參考儀器分析

楊

海

講師Ya

生命科學與技術(shù)學院本科課程儀器分析(13)質(zhì)法譜Mass

Spectroscopy內(nèi)容提要一、質(zhì)譜簡介二、質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)與工作原理三、譜圖解析2質(zhì)譜簡介3質(zhì)譜法(MassSpectrometry,MS)，即用電場和磁場將運動的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片)按它們的質(zhì)荷比(m/z)分離后進行檢測的方法荷質(zhì)比又稱比荷，是一個帶電粒子所帶電荷與其質(zhì)量之比。粒子無論帶何種電荷，應(yīng)一律代入正值計算質(zhì)荷比是荷質(zhì)比的倒數(shù)，在質(zhì)譜分析中，當加速電壓與電場強度恒定時，粒子運行軌跡半徑與質(zhì)荷比成正比被分析樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場中運動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比分開而得到質(zhì)譜。通過質(zhì)譜及相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果1898年，維恩用電場和磁場使正離子束發(fā)生偏轉(zhuǎn)時發(fā)現(xiàn)，電荷相同時質(zhì)量小的離子偏轉(zhuǎn)得多,質(zhì)量大的離子偏轉(zhuǎn)得少1919年，阿斯頓制成能分辨一百分之一質(zhì)量單位的質(zhì)譜計，用質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)同位素并將質(zhì)譜法應(yīng)用于質(zhì)量分析，1922年獲得獎20世紀40年始將質(zhì)譜法用于測定有機化合物的結(jié)構(gòu)，開拓了有機質(zhì)譜的新領(lǐng)域2002年：Fenn和Tanaka發(fā)明了生物大分子的質(zhì)譜分析法而獲得獎質(zhì)譜簡介4質(zhì)譜簡介5離子化

& 運動軌跡分離6信息量大，應(yīng)用范圍廣，是研究分子結(jié)構(gòu)的有力工具由于分子離子峰可以提供樣品分子的相對分子量的信息，所以質(zhì)譜法也是測定分子量的常用方法分析速度快、靈敏度高、高分辨率的質(zhì)譜儀可以提供分子或離子的精密測定。質(zhì)譜儀器較為精密，價格昂貴，工作環(huán)境要求較高質(zhì)譜簡介內(nèi)容提要一、質(zhì)譜簡介二、質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)與工作原理三、譜圖解析7質(zhì)譜分析法是根據(jù)樣品離子的質(zhì)荷比實現(xiàn)定性和定量的一種方法。質(zhì)譜儀必須有電離裝置把樣品電離為離子，有質(zhì)量分析裝置把不同質(zhì)荷比的離子分開，經(jīng)檢測器檢測之后可以得到樣品的質(zhì)譜圖不管是哪種類型的質(zhì)譜儀，其基本組成是相同，包括進樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器、真空系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理設(shè)備質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)與工作原理89直接進樣：按電離方式的需要，將樣品送入離子源的適當部位通過接口進樣：將色譜流出物導入質(zhì)譜，去除大部分流動相，樣品經(jīng)離子化后供質(zhì)譜分析噴霧技術(shù)(電噴霧，熱噴霧和離子噴霧)傳送裝置(粒子束)粒子誘導解吸(快原子轟擊，液相二次粒子質(zhì)譜)在很多情況下進樣和離子化是同時進行的質(zhì)譜儀的組成☆離子源的作用是將要分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。10質(zhì)譜儀的組成離子源的性能決定了離子化效率，很大程度上決定了質(zhì)譜儀的靈敏度根據(jù)樣品分析的需要，選擇合適的離子源和電離方法，適度電離：離子源1112分子離子(molecular

ion)

：分子失去一個電子生成的離子。它既是一個正離子，又是一個游離基。用M+表示，分子離子的質(zhì)荷比等于分子量準分子離子(quasi-molecular

ion)：指與分子存在簡單關(guān)系的離子，通過它也可以確定分子量。例如分子得到或失去一個氫生成的(M+H)+或(M-H)-就是最常見的準分子離子碎片離子(fragment ions)：分子離子在離子源中經(jīng)一級或多級裂解生成的產(chǎn)物離子同位素離子(isotopic

ions)：由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子。它們在質(zhì)譜圖中總是出現(xiàn)在相應(yīng)的分子離子或碎片離子的右側(cè)（即質(zhì)荷比較大的一側(cè)）離子源13常見的離子化方式有兩種：一種是樣品在離子源中以氣體的形式被離子化(EI、CI、APCI等)，另一種為從固體表面或溶液中濺射出帶電離子(ESI、FAB、MALDI等)電子電離源(EI)

☆化學電離源

(CI)

☆大氣壓電離源電噴霧源(ESI)☆☆大氣壓化學電離源(APCI)大氣壓光電離源(APPI)快原子轟擊源(FAB)基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)離子源EI源(ElectronIonization)主要用于揮發(fā)性樣品的電離，是應(yīng)用最為廣泛的離子源之一原理：樣品以氣體形式進入離子源。由燈絲發(fā)出的電子與樣品分子發(fā)生碰撞使樣品分子電離14離子源－EI源15一般燈絲與接收極之間的電壓一般為70伏，所有的標準質(zhì)譜圖都是在70eV下得到的。通過與標準譜圖的比對，可以實現(xiàn)定性分析在70eV電子碰撞作用下,有機物分子可能被打掉一個電子形成分子離子，也可能會發(fā)生化學鍵的斷裂形成碎片離子。由分子離子可以確定化合物分子量,由碎片離子可以得到化合物的結(jié)構(gòu)對于一些不穩(wěn)定的化合物，在70ev的電子轟擊下很難得到分子離子。為了得到分子量，可以采用10－20eV的電子能量，不過此時儀器靈敏度將大大降低，需要加大樣品的進樣量。而且，得到的質(zhì)譜圖不再是標準質(zhì)譜圖離子源－EI源16電離效率高，靈敏度高穩(wěn)定、操作方便，電子流強度10~240eV可精確控制EI譜能提供有機化合物最豐富的結(jié)構(gòu)信息，有較好的重現(xiàn)性，其裂解規(guī)律的研究最為完善，已經(jīng)建立了數(shù)萬種有機化合物的標準譜圖庫可供檢索只適用于易氣化的有機物樣品分析,常用于GC-MS穩(wěn)定性差的分子難以得到分子離子離子源－EI源17EI源直接用電子轟擊分子，對于穩(wěn)定性差的分子難以得到分子離子；CI源(ChemicalIonization)的主體結(jié)構(gòu)與與EI類似，通過引入反應(yīng)氣體實現(xiàn)電離燈絲發(fā)出的電子首先將反應(yīng)氣電離，然后反應(yīng)氣離子與樣品分子進行離子-分子反應(yīng)，使樣品氣電離。反應(yīng)氣體可以是甲烷、異丁烷、氨等，反應(yīng)氣的量遠多于樣品氣*

離子-分子反應(yīng)：在化學電離等高壓離子源中，已經(jīng)電離了的分子（即離子）與尚未電離的分子有較多的碰撞機會，因此發(fā)生離子-分子反應(yīng)。在反應(yīng)中分子因和離子之間發(fā)生質(zhì)子交換或電荷交換而被電離離子源18現(xiàn)以甲烷作為反應(yīng)氣為例：CH4

+

e

CH4+

+

CH3+

+CH2+

+

CH++

C+

+

H+甲烷離子與分子進行反應(yīng)，生成加合離子：CH4+

+

CH4

CH5+

+

CH3CH3+

+

CH4

C2H5+

+

H2加合離子與樣品分子反應(yīng)：CH5+

+

XH

XH2+

+

CH4C2H5+

+

XH

X+

+C2H6生成的XH2+和X+比樣品分子XH多一個H或少一個H，可表示為(M±1)+，稱為準分子離子以甲烷作為反應(yīng)氣，除(M+1)+之外，還可能出現(xiàn)(M+17)+、(M+29)+等離子，同時還出現(xiàn)大量的碎片離子離子源－CI源CI源的特點最強峰為準分子離子譜圖簡單不適用難揮發(fā)試樣--常用于GC-MSCI得到的質(zhì)譜不是標準質(zhì)譜，所以不能進行庫檢索離子源－CI源19ESI(Electron

Spray

Ionization)是液相離子化，屬于軟電離方式，能使溶液中的分子生成帶多電荷的離子ESI主要部件是一個多層套管組成的電噴霧噴咀。最內(nèi)層是液相色譜流出物，外層是大流量的噴射氣(鞘氣)，使噴出的液體分散成微滴。噴嘴前方有輔助氣噴咀，使微滴的溶劑快速蒸發(fā)在溶劑蒸發(fā)過程中，微滴表面電荷密度逐漸增大，當大于某個臨界值時，離子就可以從表面蒸發(fā)出來離子產(chǎn)生后，借助于噴咀與錐孔之間的電壓，穿過取樣孔進入分析器離子源20小分子離子蒸發(fā)機制&大分子帶電殘基機制21離子源－ESI源離子源－ESI源離子源－ESI源2324ESI源是一種軟電離方式。即使是分子量大、穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解。主要用于分析極性比較大的化合物及大分子化合物(如蛋白質(zhì)、肽、糖等)。電噴霧電離源的最大特點是容易形成多電荷離子。如一個分子量為10kD的分子若帶有10個電荷，則其質(zhì)荷比只有

1000，進入了一般質(zhì)譜儀可以分析的范圍之內(nèi)。目前采用

ESI，可以測量分子量在300KD以上的蛋白質(zhì)屬于大氣壓電離源(無需高真空環(huán)境)，使用簡單易清潔在高鹽條件下會發(fā)生離子抑制；會產(chǎn)生加和離子影響結(jié)果離子源－ESI源電噴霧電離源得到的肌紅蛋白(~17kDa)的質(zhì)譜圖25離子源－ESI源APCI

(atmospheric

pressure

chemical

ionization)結(jié)構(gòu)與ESI源大致相同，不同之處在于APCI噴咀的下游放置一個針狀放電電極放電電極通過高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，2

2產(chǎn)生H3O+，N

+，O

+

和O+

等離子，溶劑分子也會被電離這些離子與分析物分子進行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化，這些反應(yīng)過程包括由質(zhì)子轉(zhuǎn)移和電荷交換產(chǎn)生正離子，質(zhì)子脫離和電子捕獲產(chǎn)生負離子等離子源26離子源－APCI源2728ESIAPCI離子產(chǎn)生方式液相離子化氣相離子化化合物類型極性化合物生物大分子弱極性、小分子化合物，且有一定揮發(fā)性流速(mL/min)0.001~0.250.2~2多電荷生成系列多電荷離子，特點適于蛋白質(zhì)等生物分子不能生成多電荷離子，因此不適于分析大分子而APCI源是氣相離子化，主要作為ESI的補充，用于分析極性較小的小分子化合物APCI主要產(chǎn)生單電荷離子，不適合分析大分子。一般用于測定分子量低于1000的有機物APCI源得到的質(zhì)譜很少有碎片離子，主要是準分子離子ESI與APCI的對比離子源－APCI源APPI(atmosphericpressurephotoionization)是用紫外燈(或激光)取代APCI的電暈放電，通過光照使化合物發(fā)生選擇性電離的離子化技術(shù)，適用于非極性化合物APPI選擇性好，對特定的化合物靈敏度會有提高例如：氪燈發(fā)射10.0eV和10.6eV的光子，可選擇性電離化合物，避免甲醇、乙腈及水等溶劑的干擾離子源29大氣壓電離源(API)是在常壓下工作，獨立于高真空狀態(tài)的質(zhì)量分析器之外的，不同大氣壓電離源之間的切換非常方便，廣泛應(yīng)用于LC-MS系統(tǒng)不同的API適用于不同分子量、不同極性的樣品，ESI最為常用，三者互為補充30離子源MALDI(Matrix

Assisted

Laser

Description

Ionization)

是利用一定波長的脈沖式激光照射樣品使樣品電離的一種

電離方式。激光照射到樣品靶上，基質(zhì)分子吸收激光能量，與樣品分子一起蒸發(fā)到氣相并使樣品分子電離離子源3132MALDI是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。最適于與飛行時間質(zhì)譜儀(TOF)組合，用于分析生物大分子，如肽、蛋白質(zhì)、核酸等MALDI得到的質(zhì)譜主要是分子離子/準分子離子，碎片離子和多電荷離子較少。MALDI-TOF-MS可用于600KDa以下生物大分子的分子量測定離子源－MALDI源離子源33例：Agilent

ESI+APCI離子源34離子源3580年代中期出現(xiàn)的兩種新的電離技術(shù)：電噴霧電離ESI和基質(zhì)輔助激光解吸電離MALDI為代表，這兩種技術(shù)所具有的高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得在fmol(10-15)乃至

amole(10-18)水平檢測相對分子質(zhì)量高達幾十萬的生物大分子成為可能，從而開拓了質(zhì)譜學一個嶄新的領(lǐng)域——生物質(zhì)譜，促使質(zhì)譜技術(shù)在生命科學領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用和發(fā)展。離子源MALDI-TOF

MSMALDI-TOF-TOF

MSESI-

-Q

MSESI-IT

MSESI-IT-TOF

MSESI-Q-TOF

MSESI-FTI

S??36☆質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并排列成譜。常見的質(zhì)量分析器有：磁式單聚焦分析器磁式雙聚焦分析器四極桿分析器離子阱分析器飛行時間分析器傅立葉變換回旋

分析器質(zhì)譜儀的組成37帶電粒子進入分析器的磁場后，受到洛倫茲力的作用而作半徑為R的圓周運動，圓周運動的離心力要與洛倫茲力平衡，則有：38單聚焦分析結(jié)構(gòu)簡單，操作方便無法克服離子初始能量(速度)不同對運動半徑R的影響，分辨率很低。質(zhì)量分析器為了消除離子能量分散對分辨率的影響，通常在扇形磁場前加一扇形電場。這種由電場和磁場共同實現(xiàn)質(zhì)量分離的分析器，同時具有方向聚焦和能量聚焦作用，叫雙聚焦質(zhì)量分析器(Double

Focusing)扇形電場是一個能量分析器，不起質(zhì)量分離作用。質(zhì)量相同而能量不同的離子經(jīng)過靜電電場后會彼此分開。即靜電場有能量色散作用如果設(shè)法使靜電場的能量色散作用和磁場的能量色散作用大小相等方向相反，就可以消除能量分散對分辨率的影響。只要是質(zhì)量相同的離子，經(jīng)過電場和磁場后可以會聚在一起。改變離子加速電壓可以實現(xiàn)質(zhì)量掃描。雙聚焦分析器的最大的優(yōu)點是具有高分辨率。缺點是掃描速度慢，操作、調(diào)整比較，而且儀器造價也比較昂貴質(zhì)量分析器39工作原理磁式雙聚焦分析器40Waters

Autospec

Ultima

NT氣相色譜－高分辨磁質(zhì)譜聯(lián)用儀41磁式雙聚焦分析器四極桿分析器(Quadrupole，Q)由兩對四根高度平行的雙曲線金屬電極桿組成，精密地固定在正方形的四個角上，電極上加有直流電壓Vdc和射頻電壓VrfVrf

=

V0cosωtV0為射頻電壓的振幅，ω為射頻振蕩頻率，t為時間四極之間的空間處于射頻調(diào)制的直流電壓的兩種力作用下的射頻場中，離子進入此射頻場時，只有合適m/z的離子才能通過穩(wěn)定的振蕩穿過電極間隙而進入控制器，其它m/z的離子則與極桿相撞而被濾去42質(zhì)量分析器在保持Vdc/Vrf不變的情況下改變Vrf值，對應(yīng)于一個Vrf值，四極場只允許一種質(zhì)荷比的離子通過，其余離子則振幅不斷增大，最后碰到四極桿而被吸收43四極桿分析器設(shè)置掃描范圍實際上是Vrf值的變化范圍。當Vrf值由一個值變化到另一個值時,檢測器檢測到的離子就會從m1變化到m2，也即得到m1到m2的質(zhì)譜四極桿分析器是一種無磁分析器，體積小，重量輕，操作方便掃描速度快，分辨率較高，比磁式質(zhì)譜價格便宜，體積小，在常規(guī)

廣泛使用出色的分析靈敏度(fg級)和可靠性，具有良好的重現(xiàn)性，常用于定量分析四極桿分析器45離子阱分析器(iontrap，IT)的主體是雙曲面三維結(jié)構(gòu)，由一個環(huán)電極和上下兩端蓋電極組成。環(huán)電極和上下兩端蓋電極都是繞Z軸旋轉(zhuǎn)的雙曲面。直流電壓Vdc和射頻電壓

Vrf加在環(huán)電極和端蓋電極之間離子阱電極及電路連接方式離子阱的結(jié)構(gòu)示意圖離子阱

的電場質(zhì)量分析器46與四極桿分析器類似，離子在離子阱內(nèi)的運動遵守馬蒂厄微分方程，也有類似四極桿分析器的穩(wěn)定區(qū)對于一定質(zhì)量的離子，在特定的Vdc和Vrf下，可以處于穩(wěn)定區(qū)內(nèi)。穩(wěn)定區(qū)離子的軌道振幅保持一定大小，可以長時間留在阱內(nèi)；不穩(wěn)定區(qū)的離子振幅很快增長，撞擊到電極而48改變Vdc或Vrf的值，可使穩(wěn)定區(qū)的離子進入非穩(wěn)定區(qū)。如果在引出電極上加負電壓，可以將離子從阱內(nèi)引出，由電子倍增器檢測離子阱的質(zhì)量掃描方式與四極桿類似，是在恒定的Vdc/Vrf下，掃描Vrf獲取質(zhì)譜離子在離子阱中的運動軌跡離子阱分析器49Torion便攜式GC-MS離子阱在多級MS方面有性能（非常容易就能做到3級以上的MS）和成本（只用一個阱就能做）上的優(yōu)勢，常用于藥物代謝物或 產(chǎn)物等的定性分析因存在空間電荷效應(yīng)，低質(zhì)量截止等問題，離子肼動態(tài)范圍窄，不利于定量分析離子阱體積小，價格低，結(jié)構(gòu)簡單，易于實現(xiàn)小型化華

技大學

分析測試中心Agilent

1100

LC/MSD

Trap離子阱分析器飛行時間質(zhì)量分析器(TimeofFlight，TOF)的主要部分是一個離子漂移管。離子在加速電壓V作用下得到動能，則有：1/2

mv2=eV或v=(2eV/m)1/2離子以速度v進入

空間（漂移區(qū)），假定離子在漂移區(qū)飛行的時間為T，漂移區(qū)長度為L，則：T=L(m/2eV)1/2離子在漂移管中飛行的時間與離子質(zhì)量的平方根成正比。對于能量相同的離子，離子的質(zhì)量越大，達到所用的時間越長；質(zhì)量越小，所用時間越短，根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子分開適當增加漂移管的長度可以增加分辨率質(zhì)量分析器50分析質(zhì)量范圍寬，掃描速度快，既不需電場也不需磁場。傳統(tǒng)TOF存在分辨率低的缺點：離子進入漂移管前的時間分散、空間分散和能量分散主要原因。即使是質(zhì)量相同的離子，由于產(chǎn)生時間的先后，產(chǎn)生空間的前后和初始動能的大小不同，達到檢測器的時間就不相同，降低了分辨率新型MALDI-TOF通過采取激光脈沖電離方式，離子延遲引入技術(shù)和離子反射技術(shù)，可以在很大程度上克服上述三個原因造成的分辨率下降目前的MALDI-TOF最高可檢質(zhì)量超過300kDa，并且具有很高的靈敏度。51飛行時間分析器飛行時間分析器52?質(zhì)譜儀的組成53質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器和EI、CI等離子源都必須處在<10-3Pa高真空中才能正常工作保證離子在離子源和分析器正常運行消減不必要的離子碰撞，減小散射效應(yīng)和本底避免復合反應(yīng)和離子-分子反應(yīng)54質(zhì)譜儀的組成一般真空系統(tǒng)由機械真空泵和擴散泵或渦輪分子泵組成兩級真空系統(tǒng)。機械真空泵能達到的極限真空度為0.1Pa，不能滿足要求，還必須依靠高真空泵。擴散泵性能穩(wěn)定可靠，缺點是啟動慢，從停機狀態(tài)到儀器能正常工作所需時間長；渦輪分子泵啟動快，但使用

不如擴散泵。由于渦輪分子泵使用方便，沒有油的擴散污染問題，因此，近年來生產(chǎn)的質(zhì)譜儀大多使用渦輪分子泵。渦輪分子泵直接與離子源或分析器相連，抽出的氣體再由機械真空泵排到體系之外真空系統(tǒng)55擴散泵渦輪分子泵真空系統(tǒng)56色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：質(zhì)譜儀是一種很好的定性鑒定用儀器，但對混合物的分析

為力；色譜儀是一種很好的分離用儀器，但定性能力很差，二者結(jié)合起來，則能發(fā)揮各自專長，使分離和鑒定同時進行，實現(xiàn)定性與定量分析質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用：通過串聯(lián)質(zhì)譜法，實現(xiàn)多級質(zhì)譜

(MS/MS,MS/MS/MS)，以獲得物質(zhì)更詳細的信息以便進行物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析；或是將不同工作原理的質(zhì)量檢測器串聯(lián)

(如Q-TOF串聯(lián))，這也是目前質(zhì)譜儀發(fā)展的一個方向質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)與工作原理57色質(zhì)聯(lián)用的種類氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)毛細管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)色質(zhì)聯(lián)用接

術(shù)：將分析物從流動相中進行有效的分離，盡可能減小對質(zhì)譜系統(tǒng)的污染和對真空度的影響大流量真空泵進樣管反吹非線形進校通路質(zhì)譜法

色譜柱??離子源：GC-MS法常用EI源和CI源；LC-MS法常用ESI源和APCI源質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)58質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)離子碎片的多少直接影響質(zhì)譜的應(yīng)用分子離子和準分子離子可以獲得分子量信息，但缺少結(jié)構(gòu)信息；離子碎片可以提供

的分子結(jié)構(gòu)信息，但過于破碎的離子碎片難以直接定性、定量為了得到

的信息，最好的辦法是先獲得準分子離子，再把準分子離子“打碎”之后測定其碎片離子在串聯(lián)質(zhì)譜中采用碰撞活化解離技術(shù)把離子“打碎”，也稱為碰撞誘導解離(Collision

Induced

dissociation,CID)。帶有一定能量的離子進入碰撞室后，與室內(nèi)惰性氣體的分子或原子發(fā)生碰撞，使離子發(fā)生碎裂空間串聯(lián)質(zhì)譜：四極桿多級質(zhì)譜時間串聯(lián)質(zhì)譜：離子肼多級質(zhì)譜59三組四級桿：第一組四級桿用于質(zhì)量分離(MS1)，第二組四極桿用于碰撞活化(CID)，第三組四極桿用于質(zhì)量分離

(MS2)最多可實現(xiàn)二級質(zhì)譜(MS/MS)60三重四極桿結(jié)構(gòu)示意圖串聯(lián)質(zhì)譜Agilent

Triple

Quadrupole

LC/MS61三重四極桿質(zhì)譜時，掃描指定質(zhì)荷比范圍全掃描(Full

Scan)：指質(zhì)譜內(nèi)的所有離子。對于未知物，一般會首先何用這種模式，信息量大，掃描速度慢，因此靈敏度較低對于二級質(zhì)譜MS/MS或多級質(zhì)譜MSn時，要想獲得所有的碎片離子，也得做全掃描選擇離子監(jiān)測(selected

ion

monitoring,

SIM)：只選擇性掃描一個或幾個特定質(zhì)荷比的離子。SIM可以提高檢測的靈敏度和信噪比色譜聯(lián)用6263三重四極桿質(zhì)譜☆子離子掃描(Product

Ion

Scan)：由MS1選定質(zhì)量，CID碎裂之后，由MS2掃描得子離子譜母離子掃描(PrecursorIonScan)：由MS2選定一個子離子，MS1掃描，檢測器得到的是能產(chǎn)生選定子離子的那些離子，即母離子譜中性丟失譜掃描方式(NeutralLossScan)：MS1和MS2同時掃描。只是二者始終保持一定固定的質(zhì)量差(即中性丟失質(zhì)量)，只有滿足相差固定質(zhì)量的離子才得到檢測多離子反應(yīng)監(jiān)測(multiple

reaction

monitoring，MRM)：由MS1選擇一個或幾個特定離子，經(jīng)碰撞碎裂之后，由其子離子中選出一特定離子，只有同時滿足MS1和MS2選定的一對離子時,才有信號產(chǎn)生。用這種掃描方式的好處是增加了選擇性，即便是兩個質(zhì)量相同的離子同時通過了MS1，但仍可以依靠其子離子的不同將其分開選擇反應(yīng)監(jiān)測(selectivereaction

monitoring，SRM)，與MRM類似，但是只選擇一個母離子和一個子離子監(jiān)測。有些廠家SRM和MRM不作區(qū)分三重四極桿質(zhì)譜64三重四極桿質(zhì)譜儀四種MS/MS工作方式高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定中內(nèi)美通65三重四極桿質(zhì)譜高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定中內(nèi)美通66利用離子技術(shù)，離子阱可以選擇任一質(zhì)量離子進行碰撞解離，實現(xiàn)二級或多級(MSn)分析功能。離子阱是在時間上串聯(lián)實現(xiàn)多級質(zhì)譜67A.

打開電子門，基礎(chǔ)電壓置于低質(zhì)量的截止值，使所有的離子被阱集(trap

)，然后利用輔助射頻電壓拋射掉所有高于被分析母離子的離子B.

增加基頻電壓，拋射掉所有低于被分析母離子的離子，只留下要碰撞活化的離子(isolation)C.

利用加在端電極上的輔助射頻電壓激發(fā)母離子，使其與阱內(nèi)本底氣體碰撞(excitation)D.掃描基頻電壓，拋射并接收所有CID過程形成的子離子，獲得子離子譜(ejection)。循環(huán)往復，就可以進行多級MS分析串聯(lián)質(zhì)譜將不同質(zhì)譜的優(yōu)點進行組合四極桿-飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF

MS)：以四極桿質(zhì)譜作為質(zhì)量過濾器，以飛行時間質(zhì)譜作為質(zhì)量分析器優(yōu)點：能夠提供高分辨譜圖；定性能力好于

Q；速度快，適合于生命科學的大分子量復雜樣品定量分析缺點：儀器成本高，調(diào)試

復雜離子阱-飛行時間質(zhì)譜(IT-TOFMS)：以離子阱作為質(zhì)量選擇器和反應(yīng)器，結(jié)合了離子阱的多級質(zhì)譜能力和飛行時間質(zhì)譜的高分辨能力優(yōu)點：同時具有多級串級和高分辨能力，適合于未知樣品的定性工作，如糖蛋白的定性缺點：由于離子阱容量限制，對于混合樣品的靈敏度欠佳；定量能力弱串聯(lián)質(zhì)譜68串聯(lián)質(zhì)譜69內(nèi)容提要一、質(zhì)譜簡介二、質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)與工作原理三、譜圖解析70質(zhì)譜圖Mass

spectrum橫坐標為質(zhì)荷比m/z，從左到右質(zhì)荷比的值增大?？v坐標為離子流的強度，常用相對強度來表示，即把最強的離子流強度定為100%，其它離子流的強度以其百分數(shù)表示；有時也以所有被記錄離子的總離子流強度作為

100%，各種離子以其所占的百分數(shù)來表示71譜圖解析色質(zhì)聯(lián)用中的色譜-質(zhì)譜圖總離子色譜圖總離子數(shù) v.s.

色譜保留時間特定保留時間下的質(zhì)譜圖離子強度v.s.質(zhì)核比譜圖解析73譜圖解析☆分子在離子化過程中可產(chǎn)生多種離子峰，如(準)分子離子峰、碎片離子峰、同位素離子峰、重排離子峰、亞穩(wěn)離子峰等分子離子峰/準分子離子峰從(準)分子離子峰可以獲知化合物的分子量分子離子峰必符合氮律氮律：在有機化合物分子中，若含有偶數(shù)(包括零)個氮原子的，則其分子量為偶數(shù)；若含有奇數(shù)個氮原子的，則其分子量為奇數(shù)分子離子峰的強度和化合物的結(jié)構(gòu)關(guān)系極大，它取決于分子離子與其裂解后所產(chǎn)生離子的相對穩(wěn)定性分子離子峰強度的一般順序為：芳環(huán)＞共軛烯＞烯＞環(huán)狀化合物＞酮＞不含支烴＞醚＞酯＞胺＞酸＞醇＞高分支烴①.

游離基

的斷裂

☆游離基對分子斷裂的是由于電子的強烈成對傾向造成的。由游離基提供一個奇電子與鄰接原子形成一個新鍵，與此同時，這個原子的另一個鍵斷裂。含飽和雜原子(醇、醚、胺類)單箭頭表示單電子轉(zhuǎn)移，Y為雜原子。例如乙醇的斷裂：醇、醚類等容易形成m/z

31+14n的離子峰；胺類則形成30+14n的峰離子峰74碎片離子峰－α斷裂75MW=4641碎片離子峰－α斷裂含不飽和雜原子(酮、醛、羧酸)：易在雜原子旁發(fā)生α斷裂酮類易產(chǎn)生CnH2n+1CO+(m/z43、57、71?)的離子峰醛類易產(chǎn)生m/z

29的HCO+離子峰羧酸產(chǎn)生m/z

45的HOOC+)的峰烯丙斷裂(烷烴)：烴類的烯丙斷裂會生成穩(wěn)定的烯丙離子(m/z

41)?m/z

91是烷基苯類化合物的特征離子峰m/z77、51、39等是含苯環(huán)化合物的特征離子峰碎片離子峰－α斷裂以上幾種由游離基

的斷裂位置是在電荷定位原子相鄰的第一個碳原子和第二個碳原子之間的鍵，因此，這類

基

的斷裂常稱α斷裂77例：碎片離子峰－α斷裂78碎片離子峰－α斷裂79誘導斷裂：由正電荷誘導、吸引一對電子而發(fā)生的斷裂，其結(jié)果是正電荷的轉(zhuǎn)移。也稱i斷裂電負性強的元素誘導力也強。在有些情況下，i斷裂和α斷裂同時存在。由于i斷裂需要電荷轉(zhuǎn)移，因此，i斷裂不如α斷裂容易進行。表現(xiàn)在質(zhì)譜中，相應(yīng)α斷裂的離子峰強，i斷裂產(chǎn)生的離子峰較弱。例如乙醚，i斷裂和α斷裂同時存在,α斷裂的幾率大于i斷裂。但由于α斷裂生成的m/z59還有進一步的斷裂，因此，在乙醚的質(zhì)譜中，m/z

59并不比m/z29強碎片離子峰80碎片離子峰－i斷裂α斷裂

CH2=OC2H5i斷裂

C2H581如果化合物分子中具有σ鍵，如烴類化合物，則會發(fā)生σ鍵斷裂。σ鍵斷裂需要的能量大，當化合物中沒有π電子和n電子時，

σ鍵的斷裂才可能成為主要的斷裂方式。斷裂后形成的產(chǎn)物越穩(wěn)定，這樣的斷裂就越容易進行正碳離子的穩(wěn)定性順序為叔>仲>伯，因此，碳氫化合物最容易在分支處發(fā)生鍵的斷裂。并且，失去最大烷基的斷裂也最容易進行碎片離子峰82碎片離子峰－σ斷裂有機

中的狄爾斯-阿德爾反應(yīng)，可以由丁二烯和乙烯

環(huán)己烯：在質(zhì)譜的分子離子斷裂反應(yīng)

己烯可以生成丁二烯和乙烯，正好與上面反應(yīng)相反，所以稱為逆狄爾斯--阿德爾反應(yīng)(RDA)現(xiàn)在，RDA反應(yīng)已廣泛用來解釋含有環(huán)己烯結(jié)構(gòu)的各類化合物。例如，萜烯化合物的裂解。這類裂解反應(yīng)的特點是，環(huán)己烯雙鍵打開，同時

兩個α鍵斷開，形成兩個新的雙鍵，電荷處在帶雙鍵的碎片上：碎片離子峰84碎片離子峰－環(huán)烯的斷裂85①麥氏重排：具有不飽和官能團C=X(X為O、S、N、C等)及其-H原子結(jié)構(gòu)的化合物，-H原子可以通過六元環(huán)空間排列的過渡態(tài)，向缺電子的部位轉(zhuǎn)移發(fā)生-H的斷裂，同時伴

隨C=X的β鍵斷裂(均裂)離子峰86戊酮-2m/z

58是具有-H甲基酮的特征峰位上有氫原子的烯烴也發(fā)生麥氏重排。位上有氫原子的烷基取代芳烴：重排離子峰－麥氏重排87②.飽和分子的氫重排（消除反應(yīng)）X為鹵素原子時，消去HXX為—OH時，消去H2OX為—SH時，消去H2S??一般要求n≥2重排離子峰－氫重排88當樣品分子在電離室電離生成m1后，一部分離子被電場加速經(jīng)質(zhì)量分析器到達檢測器，另一部分在電離室內(nèi)進一步被裂解為低質(zhì)量的離子，還可能一部分經(jīng)電場加速進入質(zhì)量分析器后，在到達檢測器前的飛行途中裂解為離子

m2，這種離子稱為亞穩(wěn)定離子。由于亞穩(wěn)定離子是在飛行途中裂解產(chǎn)生的，所以失去一部分動能，因此其質(zhì)譜峰不在正常的位置上，而是在較低質(zhì)量的位置上，這種質(zhì)譜峰稱為亞穩(wěn)定離子峰，此峰所對應(yīng)的質(zhì)量稱為表觀質(zhì)量m*。m*一般不為整數(shù)。離子峰89對亞穩(wěn)定離子峰的觀測，可以判斷分子斷裂的途徑如乙酰苯有兩種可能的斷裂途徑，可能有兩種亞穩(wěn)定離子峰，從亞穩(wěn)峰的出現(xiàn)可以判斷是哪種途徑或兩種途徑同時發(fā)生：亞穩(wěn)定離子峰9091大多數(shù)元素都是由具有一定自然豐度的同位素組成。這些元素形成化合物后,其同位素就以一定的豐度出現(xiàn)在化合物中?；衔镔|(zhì)譜中就會有不同同位素形成的離子峰,通常把由重同位素形成的離子峰叫同位素峰同位素離子峰的強度與組成該離子的各同位素的豐度有關(guān)，可以通過各同位素豐度估算分子離子峰和其他同位素離子

峰的相對強度可以通過同位素峰的統(tǒng)計分布來確定其元素組成離子峰79Br81Br9250.54%49.46%同位素離子峰★一張化合物的質(zhì)譜包含著有關(guān)化合物的很豐富的信息。在很多情況下，僅依靠質(zhì)譜就可以確定化合物的分子量、分子式和分子結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜分析的樣品用量極微，是進行有機物鑒定的有力工具。對于復雜的有機化合物的定性，還要借助于紅外光譜，紫外光譜，核磁等分析方法譜圖解析9394分子離子的質(zhì)荷比就是化合物的分子量。因此，在解釋質(zhì)譜時首先要確定分子離子峰，通常判斷分子離子峰的方法如下：分子離子峰是質(zhì)譜中質(zhì)量數(shù)最大的峰，它應(yīng)處在質(zhì)譜的最右端分子離子峰應(yīng)具有合理的質(zhì)量丟失。也即在比分子離子小4-14及20-25個質(zhì)量單位處，不應(yīng)有離子峰出現(xiàn)分子離子的質(zhì)量數(shù)應(yīng)符合氮律如果某離子峰完全符合上述三項判斷原則，那么這個離子峰可能是分子離子峰；如果三項原則中有一項不符合，這個離子峰就肯定不是分子離子峰準分子離子峰的分析可參照分子離子峰的判斷原理質(zhì)譜的解析利用一般的質(zhì)譜很難直接確定分子式可利用

(Beynon)表，通過分子離子峰的同位素峰來確定分子組成式由于不同分子的元素組成不同，不同化合物的同位素豐度也不同，將各種化合物（包括C、H、O、N的各種組合）的M、M+1、M+2的強度值編成質(zhì)量與豐度表，如果知道了化合物的分子量和M、M+1、M+2的強度比，即可查表確定分子式。利用高分辨質(zhì)譜儀可以提供分子組成式。碳、氫、氧、氮的原子量分別為12.000000，10.07825，15.994914，14.003074，如果能精確測定化合物的分子量，可以由計算機輕而易舉的計算出所含不同元素的個數(shù)質(zhì)譜的解析95一張化合物