實(shí)驗(yàn)五-抗體效價(jià)的Elisa測(cè)定課件

實(shí)驗(yàn)五

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定BSA抗體效價(jià)

1.目的要求(1)學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基本原理。(2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)，抗體的效價(jià)測(cè)定及酶聯(lián)免疫測(cè)定儀的使用。

2.基本原理免疫酶技術(shù):酶標(biāo)Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺，定量測(cè)定Ab/Ag。免疫反應(yīng)：一次或數(shù)次具Ag,Ab特異的免疫學(xué)反應(yīng)酶促反應(yīng)：只進(jìn)行一次

顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)

利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過(guò)氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗體，統(tǒng)稱為酶標(biāo)記物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測(cè)定1974年Voller等用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)記物結(jié)合操作更方便，易重復(fù)靈敏度可高達(dá)ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定標(biāo)記抗體或抗原熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等直接在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上,對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究戊二醛法，過(guò)碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2產(chǎn)物（黃色，OD450)+H2O圖二間接型Elisa圖四固相抗體競(jìng)爭(zhēng)型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌？保證反應(yīng)的定量反應(yīng)防止重疊反應(yīng)，引起非特異現(xiàn)象。Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplatePatientserumwhichcontainsantibodies.IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate.

Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme.Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies.

substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody.HIV(humanimmunodeficiencyvirus)detectionpositivenegativeProteinproteininteraction---ELISA1.DirectelisadifferentepitopeCoatwithpreyproteinIncubatewithbaitproteinPimaryAbantibaitprotein-----2.CompetitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein4.操作方法4.1包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質(zhì))用包被液稀釋至10Oμg/ml，每凹孔加100μL，加蓋置4℃過(guò)夜(37℃2h)，次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加3～4滴，靜置3min后傾去，重復(fù)3次，將反應(yīng)板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2封閉:每孔中加入200－400μL封閉液，加蓋或用封口膜封板，置37℃恒溫箱60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌3次。4.3加待測(cè)血清(內(nèi)含抗體)、陰性血清(無(wú)抗體)及稀釋液(PBS/Tween):待測(cè)血清按倍比法用稀釋液稀釋(1:100、1:200等)，陰性血清也稀釋成1:100，取不同稀釋度的待測(cè)血清，陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)各1OOμL加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封板，置37℃恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌3次。4.4加酶標(biāo)抗體:按說(shuō)明書(shū)要求用稀釋液稀釋HRP-抗體(抗抗體)，每孔加l00μL，封板后置37℃溫育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。4.5顯色:每孔加入OPD應(yīng)用液1OOuL、反應(yīng)板置室溫暗處5～30min。當(dāng)顯示橙色時(shí)應(yīng)及時(shí)終止反應(yīng)。4.6終止反應(yīng):每孔加入5OμL2mol/LH2SO4。穩(wěn)定3～5min即可比色測(cè)定。4.7檢測(cè):用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，以PBS/Tween孔為對(duì)照、測(cè)波長(zhǎng)為49Onm時(shí)各孔光吸收（A）。計(jì)算陽(yáng)性血清與陰性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)為陽(yáng)性，P/N<2.1而≥1.5為可疑，P/N<1.5為陰性。用目測(cè)法則以較陰性對(duì)照深色的最高稀釋度作為抗體效價(jià)。用“＋”“－”表示，超過(guò)規(guī)定吸收值（0.2－0.4）的標(biāo)本均屬陽(yáng)性。

注意事項(xiàng)

(1)聚苯乙烯微量反應(yīng)板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度一般在1～100μg之間，在偏堿條件下易吸附于反應(yīng)板的凹孔中，4℃放置過(guò)夜較理想，若暫時(shí)不用，可加入終濃度為0.02%NaN3，4℃貯存，也可傾去包被液，干燥后置硅膠干燥器中，室溫存放3個(gè)月以上不影響測(cè)定效果。(2)反應(yīng)各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果重復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時(shí)間，切忌相互污染。(3)為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色后置室溫暗處的時(shí)間應(yīng)一致，終止反應(yīng)3～5min后應(yīng)立即比色。必要時(shí)可設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，以固定顯色及終止時(shí)間。(4)待測(cè)抗體或抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有相同的免疫特異性，否則無(wú)法結(jié)合。3按“READ”鍵，酶標(biāo)板推進(jìn)入儀器，開(kāi)始讀數(shù)并計(jì)數(shù)，打印機(jī)輸出數(shù)據(jù)。4按“MAINMENU”鍵回到主菜單，關(guān)閉電源。

酶標(biāo)板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板機(jī)，注射泵驅(qū)動(dòng)的液體輸送，條狀單排清洗或全板清洗

了解轉(zhuǎn)膜電泳原理的應(yīng)用及操作WesternBlottingorimmunoblottingaspecificprimaryantibody1979,Towbin1975,Southern,Southernblotting1977,Alwine,Northernblotting1979,Towbin,WesternBlotting1982,Reihart,Easternblotting,雙向蛋白質(zhì)印記Westernblotting:AntibodiescanbeusedtodetectspecificproteinsAlternatedetectionmethod–SecondaryantibodiesMemebrane:吸附生命大分子的固體材料NC,nitrocellulose硝酸纖維素膜0.45um

結(jié)合率：80ugPr/cm2

便宜，可簡(jiǎn)單快速封閉非特異性抗體的結(jié)合NDM,nylon-densedmembrane尼龍膜結(jié)合率：480ugPr/cm2DBM,diazobenzyloxymethyl重氮芐氧甲基膜濕法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)：將gel和membrane夾在blotterpaper中，浸在轉(zhuǎn)移裝置的buffer中，通電45min或overnight可完成。TransferBuffer(500ml,pH8.3)

glycine1.450g(39mM)Trisbase2.900g(48mM)SDS0.185g(0.037%)UsingtheSemi-DryTransferUnit

Removethestackinggelfromthegel.2.Cutpiecesofblotterpapertothesizeofthegel.

note:theblotterpaper(andthemembrane)notbelargerthanthegel.Largerpiecesmaymakecontactaroundthegel,andallowthecurrentanalternateroute,therebymakingtransferinefficient.3.Wearingglovesrinsedofpowder,cutapieceofmembranetothesizeofthegel.Markthelowerright-handcornertoallowfororientation.Pre-wetthemembraneintransferbufferfor2to5minutes.4.sandwichblotterpaper–membrane-gel-blotterpaper

makesurenoairbubblesaretrappedThemembranemustthereforebepositionedcorrectlythefirsttime.Donottrytoadjust.5.Holdthecoverlevelandslideitgentlydownontothestack.6.weighdownthelidinordertoensureevencontactwiththestack.7.Connecttheunittoasuitablepowersupply.Turnthepowersupplytozerobeforeturningon.Turnonthepowersupplyandsettoapproximately0.8mA/cm2ofgel.Largergelsmustbelimitedto0.8mA/cm2toavoidexcessiveheatbuildup.8mmx7mmmini-gelsat100mA.MolecularWeightTransferPeriod<20,00015minutes20,000-80,000030minutes>80,00045minutesProblem：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率低？（轉(zhuǎn)移后對(duì)凝膠或膜染色進(jìn)行觀察）transferbuffer中加入20％甲醇或加入終濃度為0.1%SDS,可增加膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力；使用小孔徑的硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移后的膜在含0.2%戊二醛的TBS中浸泡45min。麗春紅S，