八種常用生化實驗步驟

PCR一、試驗?zāi)康呐c原理簡介聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽瞤olymerasechainreaction〕是體外克隆基因的重要方法，它可在了基因在體外的克隆，是分子生物學(xué)及基因工程中極為有用的爭辯手段。PCR反用于DNADNADNA94℃，1min。二、復(fù)性。降低溫度使DNA單鏈分子同引物結(jié)合。溫度為55℃，時間1minDNA3端參加dNTP72℃，時間2min945分鐘，使DNA25-35個7210PCR熱穩(wěn)定性DNATaqDNATaqDNA80000/mg.寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的設(shè)計是影響PCR擴(kuò)增反響的效率與特異性的關(guān)鍵因素。脫氧核苷三磷酸dNT：標(biāo)準(zhǔn)的PCR反響體系應(yīng)包括4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTPdGTP。每種dNTP200-250μl濃度的dNTPdNTPMg2+螯合有關(guān)。Mg2+來激活熱穩(wěn)定的DNAdNTP與寡聚核酸結(jié)Mg2+合，因而反響體系中陽離子的濃度一般要超過dNTP和引物來源的磷酸鹽基團(tuán)的摩爾濃度。Mg2+1.5mmol/L。PHTris-ClPCRPH8.3-8.8PCR10mmol/L72℃溫育時，反響體系的溫度將下降1位，致使緩沖液的PH7.2。一價陽離子：標(biāo)準(zhǔn)PCR50mmol/LKCl500bpDNADNADNAPCRDNADNA。PCR了解引物設(shè)計的一般要求。10Х擴(kuò)增緩沖液dNTP〔20mmol/L，PH8.0〕TapDNA聚合酶端引物〔20μmol/L〕3〔20μmol/L〕DNA瓊脂糖凝膠PCR儀〔Bio-Rad公司〕移液槍〔0.5-10μL5-50μL〕槍頭 微量移液管一、試驗操作依據(jù)以下次序，將各成分加到微量離子管內(nèi)混合：10Х擴(kuò)增緩沖液 2.5μlMg2+ 1.5μl5 端引物 1μl3端引物1μlDDW16.25μldNTP2.5μlTaq酶0.25μl模板 1μl依據(jù)以下方法進(jìn)展PCR擴(kuò)增：循環(huán)數(shù) 預(yù)變性 變性 復(fù)性 聚合 后延長35個循環(huán) 95℃5min 94℃1min 63℃1min 72℃1min 72℃10min聚合反響時間是依據(jù)靶基因的長度按每分鐘聚合1000bp的速率來計算出來的。抽取每種擴(kuò)增樣品5-10DNAmarker來推斷擴(kuò)增片段的大小染色后觀看擴(kuò)增的量與片段大小。從陽性比照樣品的相對分子量的目的條帶的亮度與粗細(xì)可以推斷PCR擴(kuò)增的效率；陰性比照樣品在目的條帶四周應(yīng)當(dāng)沒有相應(yīng)條帶。二、對可能發(fā)生PCR表2.1 多種PCR擴(kuò)增過程的一些疑難問題的診斷與解決方法現(xiàn)象 可能緣由 補救措施擴(kuò)增的目的條帶 試劑不合格；PCR儀有故障； 在兩臺不同的PCR儀上用穎購置的試劑與老的試劑分別進(jìn)展較弱或不能檢測 擴(kuò)增程序有錯誤； PCR，比較擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果。到相應(yīng)的條帶。復(fù)性條件不是最適宜的。 重計算引物Tm，必要時優(yōu)化引物濃度。假設(shè)是引物問題，要重合成引物。被復(fù)性結(jié)合到模板上的 優(yōu)化MgCl、模板DNA、和dNTP的濃度；2引物不適合延長。 重純化模板DNA以除去抑制物；在恒定復(fù)性溫度下增加PCR循環(huán)數(shù)。變性不完全。 增加變性時間或設(shè)置更調(diào)質(zhì)變性溫度。兩個引物之間的距離太大。 應(yīng)用那些能夠擴(kuò)增大的DNA片段的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。多種擴(kuò)增產(chǎn)物條帶 優(yōu)化MgCl、模板DNA、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶和dNTP的濃度。2PCR產(chǎn)物進(jìn)展1：100稀釋后作為模板，再參加的PCR30個循環(huán)的其次次PCR擴(kuò)增；或者進(jìn)展嵌套式PCR擴(kuò)增；或者從凝膠上割取取目的條帶作模板重進(jìn)展PCR引物二聚體過量 應(yīng)用降落PCR；重設(shè)計合成引物，特別留意引物3末端的序列。試驗二、堿裂解法大量提取質(zhì)粒DNA及檢測三、試驗?zāi)康呐c原理簡介質(zhì)粒DNA的提取是基因工程操作中常用的根本技術(shù)。質(zhì)粒作為載體應(yīng)具備以下四個特點：①有足夠的容納目的基因的幅度，并且對于攜帶的目的基因能夠借助載體的復(fù)制和調(diào)控系統(tǒng)得到忠實的復(fù)制與增殖。②在非必要的DNA克隆區(qū)有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一識別位點，易于基因片段與載體的連接、重組與篩選。③與宿主細(xì)胞有天與一個或多個遺傳表型〔如抗藥性、營養(yǎng)缺陷型或顯色表型反響等。④拷貝數(shù)多，易于宿主細(xì)胞的DNA分別質(zhì)粒DNA的方法包括三個根本步驟：培育細(xì)胞使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分別和純化質(zhì)粒DNA。DNADNADNA的變性與復(fù)性的差異而到達(dá)分別目的的。在強堿性pHDNA的氫鍵斷裂，雙螺旋構(gòu)造解開而變性。質(zhì)粒DNA的大局部氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分別，調(diào)整pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性糾纏形成網(wǎng)狀構(gòu)造，經(jīng)過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS提取基因工程中運載基因的載體，把握最常用的提取質(zhì)粒DNA的方法。二．試劑及步驟試劑配制：SolⅠ：1MTris-HCL〔pH8.0〕2.5ml，0.5MEDTA2ml,DDW91ml,20%葡萄糖4.5ml(葡萄糖單獨滅，滅完后加進(jìn)SolI°保存。So〔常溫使用〕10%SDS50ml，2MNaOH50ml100ml：SDS1g，NaOH0.8g，加DDW100ml。不要猛烈攪拌！SolⅢ：KAc147g，HAc57.5ml300mlDDW500ml。高壓滅菌，4°保存。STEbuffer：1MTris-HCl〔pH8.0〕1ml，0.5MEDTA0.2ml,Nacl0.5844g,DDW98.8ml。高壓滅菌！70%乙醇10ml5MLiCl20ml3MpH5.2酚/氯仿/異戊醇無菌水DDW13％(W/V)PEG8000，1.6MNaCl:6.5gPEG,4.6752gNaCl50ml,過濾除菌.(僅由第一組配制)1/100的比例接種保存的pPIC9K3mL的含有適當(dāng)抗生素LB基，37℃、180rpm121/100200mlLB37℃、250rpm⒈離心管50m〕分裝菌液，離心去上清10000rp，5mi4℃；重懸于15m〔原始菌液的1/4體積〕STE中，離心去上清〔10000rpm，1-2min，4℃〕離心完畢盡可能吸干上清液。2mL冰冷的SolⅠ中；猛烈震蕩重懸菌體。⒊參加4mLSoⅡ輕輕顛倒數(shù)次〔動作要輕柔，防止斷裂DNA形成碎片10min。3mLSolⅢ馬上輕輕顛倒完全徹底混勻，冰上放置10min。⒌4℃，10000rpm10min。⒍脫脂棉過濾收集上清至的離心管，加等體積異丙醇，混勻沉淀核酸，室溫放置大于10min。⒎室溫，10000rpm離心15min剩余的上清。⒏少許7％乙醇清洗管壁及沉淀，室溫?fù)]發(fā)〔一般室溫放置10-15min足夠；3mLDDW5MLiCl4°C，10000rpm10min，取上清至的離心管。〔沉淀大分子RNA〕⒒加等體積異丙醇，混勻沉淀核算，離心去上清〔12023rpm，15min，室溫。⒓留神倒去上清，倒置管口，使液體溜干。少許70％乙醇清洗管壁及沉淀，室溫?fù)]發(fā)。⒔用490μLDDW1.5mLRNaesA20μg/mL，3745min。500μL[13％(W/V)PEG8000，1.6MNaCl]，混勻靜置，4℃3-4h。⒖最大轉(zhuǎn)速〔12023rpm〕20min，回收DNA沉淀；沉淀用500μL70％乙醇重懸以除去微PEG5min⒗500μLDDW溶解DNA，用等體積的酚，酚/氯仿/異戊醇，25:24:1；氯仿/24:110min〔抽提過程中要留神，不要吸到有機相〕⒘收集最終水相至的離心管，加1/10V[3MpH5.2]，混勻；用2乙醇沉淀，低溫(-20℃)放置>20min。10min，去上清。70％10min；取上清，揮發(fā)乙醇；50μLDDW粒。試驗三、酶切與連接一、試驗?zāi)康呐c原理簡介限制性內(nèi)切酶在基因工程中主要應(yīng)用地以下兩個方面：制作基因酶切圖譜和進(jìn)展基因克隆。制作基因圖譜，就是利用特定的酶切出特定的條帶：而利用基因克隆時選擇酶應(yīng)留意以下幾個方面：1〕克隆片段的長度；2〕克隆片段中切點的狀況3〕載體上切點的狀況；4〕切割與連接方式；5〕接頭狀態(tài)。酶切方式可分為局部酶切和完全酶切兩種：1〕局部酶是指同一DNA片段上有些被切開而另一些未被切開，此法主要應(yīng)用于基因的克隆。用局部酶切法是基于基因內(nèi)部可能有此酶的位點。進(jìn)展局部酶切可通過兩個方式：一是不同的時間內(nèi)在同一酶反響管中取樣終止反響，利用時間來把握酶切的程度。另一種是在其余條件一樣時把握酶的稀釋度，利用不同酶濃度把握2〕完全酶切法適用于如載體切割、酶切圖譜的制作、基因的鑒定與DNA片段的分別工作。完全酶切又可分為單酶切、多酶切兩種。在多酶切反響中當(dāng)2種或2種以上的酶有一樣的反響條件時，可同時進(jìn)展酶切，不然須在前一種酶作用完成后將其失活，而后進(jìn)展其次種酶切反響，這樣可以避開片段混亂現(xiàn)象的消滅。二、材料和試劑限制性內(nèi)切棧酶XhoI EcoRI 10╳BufferPCR產(chǎn)物 pPIC9K質(zhì)粒 10╳T4連接Buffer T4Ligase 瓊脂糖 電泳緩沖液 Goldview染液 膠回收試劑盒電泳儀 恒溫水浴鍋 1.5mlEP管 移液槍 滅菌槍頭 紫外檢測儀三、試驗步驟PCR產(chǎn)物雙酶切〔XhoI、EcoRI〕 pPI9K質(zhì)粒雙酶切(XhoI局部酶切、EcoRI完全酶切)DDW23μlDDW35μl10╳HBuffer5μl10╳HBuffer5μlPCR20μlpPI9K質(zhì)粒8μlXhoI1μlXhoI1μl(3720min)EcoRI1μlEcoRI1μl(374(373以上兩步酶切都要制備兩管,酶產(chǎn)物置于-20℃,電泳檢測酶切結(jié)果并回收一管做連接.由于pPI9K質(zhì)粒有兩個XhoI酶切位點(1193\5730)9KPCR然后電泳檢測后在紫外檢測儀下觀看UV260n。切膠回收〔盡量更要切到不含目的片段的膠，依據(jù)膠回收試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作?；厥债a(chǎn)物電泳檢測后進(jìn)展連接：連接體系：10×T4連接Buffer 目的基因 質(zhì)粒載體 2μlT4Ligase 1μl混合后16℃，過夜連接。完成后放入4℃冰箱可，備用。四、留意事項1、加樣次序一般應(yīng)為：水+緩沖液+DNA+酶。2、限制性內(nèi)切酶的量不要過多，最多不超過部體積的1/10，否則易發(fā)生酶的星號反響。所謂酶的星號反響就是指轉(zhuǎn)變酶切條件時酶的識別位點專一性下降，導(dǎo)致酶切圖譜混亂的現(xiàn)象。3、內(nèi)芭棧瓣選擇和使用方案須依據(jù)具體的試驗狀況來細(xì)心設(shè)計。4、限制性內(nèi)切酶和連接酶都極易失活，須在冰盒上操作，同時防止污染。試驗四、感受態(tài)細(xì)胞的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)就是受體菌能承受外源DNA〔四周環(huán)境中的DNA分子〕力量的一種生理狀態(tài)，一般認(rèn)為處于生長對數(shù)期的后期能夠進(jìn)展成為感受態(tài)，但是細(xì)菌中能進(jìn)展成為感受態(tài)的細(xì)胞是很少的，一般認(rèn)為0.1%-1%，而且時間短暫。用CaCl處理大腸桿菌細(xì)胞2可以使20學(xué)習(xí)CaCl法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法；2把握外源DNA重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌細(xì)胞并篩選陽性轉(zhuǎn)化體的方法。二、材料與試劑1.5mlEP管 滅菌槍頭 移液槍 冰盒 低溫離心機 涂布棒 大腸桿菌Top10、重組質(zhì)粒〔試驗三的連接產(chǎn)物、LB0.1MCaCl2三、試驗方法1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備〔CaCl法〕2〕取-70℃超低溫冰箱保存的大腸桿菌Top1030μl〔16〕3mlLB〔1：100〕37揺菌250rp〕〔OD=0.0.。〕將過夜培育的菌液移入3mlLB37℃快速振蕩250rp，至OD=0.0.〔約2小時；冰浴300〕1ml1.5mlEP44000rpm10〔1分鐘，以使前后殘留的〕1ml0.1MCaCl〔抽濾滅菌〕懸浮，混合均勻，置于冰浴上30min。2〕44000rpm10min200μl0.1MCaCl22-7h20-30%的滅菌甘油，-70℃保存。2、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)胞取上述方法制備的感受態(tài)細(xì)胞，或者從-70℃超低溫冰箱取出一管感受態(tài)細(xì)胞溶化。按每200μl菌液加100ng已純化的質(zhì)粒DNA〔無菌操作〕的標(biāo)準(zhǔn)，將5-10μlDNA的連接物參加一管感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后放置冰上30mi〔同時作兩個比照組即受體菌比照組-〕和質(zhì)粒DNA比照組+，檢測感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量及有無污染狀況〕3〕42℃90sec，快速取出馬上放于冰上2min。留意：在水浴中切勿亂晃動。4〕上述各管中分別參加800μl37℃預(yù)熱的LB1ml37℃180rpm1-25〕4000rpm10min800μl200μl6〕100μl的菌液涂布于加相應(yīng)抗生素〔Amp+50ppm〕LB固體培育基，涂勻，置于超凈臺上1小時左右至菌液完全被培育基吸取。7〕37℃倒置培育12-24小時。從平板上選擇抗性菌落進(jìn)展鑒定。四、方法事項1108個/ml，即OD值為0.415-20min600進(jìn)展一次OD值監(jiān)測。2、熱激是一個格外重要的步驟，應(yīng)準(zhǔn)確的到達(dá)熱激所需要的溫度的時間。3、假設(shè)參加太多的菌落裂解液，會轉(zhuǎn)變了反響混合液的離子平衡，導(dǎo)致試驗失敗。4、PCR擴(kuò)增對DNADNA5、間或帶入瓊脂碎片于反響混合液中，會抑制的熱穩(wěn)定性DNA試驗五菌落PCR篩選陽性重組子及重組質(zhì)粒的酶切鑒定菌落PCR1〕反響體系： 10Х擴(kuò)增緩沖液2.5μlMg2+2.5μl正向引物1.25μl反向引物1.25μlDDWdNTP2.5μltaq0.25μl模板為菌落200μl25μl302〕完全混合后，將反響管放于PCR儀上，依據(jù)變性、復(fù)性、延長三種程序設(shè)定溫度、時間、循環(huán)次數(shù)。進(jìn)展反響。程序設(shè)定同試驗一。抽取每種擴(kuò)增產(chǎn)物5-10μl，用瓊脂凝膠電泳來分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNAmarker來推斷擴(kuò)增片段的大小。試驗六、質(zhì)粒酶切及電轉(zhuǎn)化畢赤酵母一、試驗原理及目的核酸不能自動進(jìn)入細(xì)胞，需要幫助才能穿過細(xì)胞壁的物理屏障進(jìn)入能夠進(jìn)展表達(dá)或復(fù)制的胞內(nèi)位點。電流可逆性的擊穿細(xì)胞膜形成瞬時水通路或膜上小孔，促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)。電場強度為kV/cm、持續(xù)時間為μs—ms級的電脈沖刺激會使細(xì)胞膜發(fā)生電穿孔現(xiàn)象,即:細(xì)胞膜構(gòu)造重組,消滅微孔,電導(dǎo)率轉(zhuǎn)變,臨時喪失屏障功能等,從而引起離子的流出,代謝物的排泄,細(xì)胞對藥劑及DNA等大分子的吸取量增加。線性DNA分子與環(huán)狀DNA分子均可用于轉(zhuǎn)染，但線性DNA無論是瞬時表達(dá)還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的水平高于環(huán)狀分子。所以對于閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA來說，要首先利用限制性內(nèi)切酶切割使其變成線性分子，然后進(jìn)展轉(zhuǎn)染。同時轉(zhuǎn)染的效率還會以下因素影響：外加電場的強度、電脈沖的長度、溫度、培育基的離子成分。把握電穿孔轉(zhuǎn)染DNA技術(shù)。二、材料和試劑〔兩組共配一次〕RDB培育基1、取Sorbitol18.6g及瓊脂2g溶于70ml水中。2、 10ХD 10ml 〔8g葡萄糖，40mlDDW〕10YNB 10ml 〔13.4gYNB100mlDDW過濾除菌〕500ХB 0.2ml(2mg生物素，10ml水，過濾除菌)100ХAA 1.0ml 〔過濾除菌〕DDW 8.8ml將1、2兩種溶液混合，加熱后倒平板，每個平板10ml.共10個平板。YPD培育基10YeastextractPeptone1g2g10×D10ml加水至100ml，高壓滅菌三、試驗步驟I、線性化質(zhì)粒的制備SacI3酶切體系〔依據(jù)質(zhì)粒濃度而定，保定質(zhì)粒濃度DNA大于1μg/μl〕DDW 33μlBufferI 5μl質(zhì)粒 10μlSacI 2μl和電泳檢測酶切結(jié)果，回收質(zhì)粒II、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備：11：100300μl3mlYPD30℃揺菌過夜〔15h〕2、取活化的菌液10l接入100mlYPD液體培育基30℃揺菌過夜，至OD61.3-1.〔12-15，收集菌體制備感受態(tài)細(xì)胞。3、4℃3000g55ml無菌DDW250ml4、4℃10000rpm525ml5、4℃10000rpm55ml6、4℃10000rpm50.25ml7、依據(jù)80μl1.5mlEP-20℃存放III、電轉(zhuǎn)化180μl10μl〔5-20μg〕52、設(shè)置電轉(zhuǎn)儀于真核細(xì)胞程序，電轉(zhuǎn)條件：1.5KV 25μF IV、陽性克隆篩選1、電轉(zhuǎn)成功后，將菌液涂于RDB30℃恒溫培育箱培育2-32、長出克隆后選擇單菌落作PCR，鑒定其是否為陽性克隆。假設(shè)獲得陽性克隆則揺菌保種，劃線鑒定，小量表達(dá)，電泳檢測目的基因。試驗七重組蛋白的表達(dá)及westernblot鑒定表達(dá)試劑：10×D10×YNB500×B〔試驗六中已配〕10×GY：10ml90ml100ml，過濾除菌。1M〔ph6.0〕:13.2ml1MK2HPO4,86.8ml1MKH2PO4PH6.0。50ml〕〔ph6.0〕40ml，0.8ml500×B10×M，〔ph6.0〕10ml，0.2ml500×B3mlYPD，搖菌過夜〔16h400mlBMGY24h，4h100mlBMMY，30h1ml24h1ml，24h，12023rpm15min，留上清。westernblot鑒定樣品預(yù)備不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液〔900ul，TCA-10.0215min100％TCA101h414000102030ul53所用試劑：轉(zhuǎn)膜緩沖液：〔48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇〕甘氨酸〔MW75.07〕2.9gTris〔MW121.14〕5.8gSDS0.37g甲醇200ml蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存，此溶液可重復(fù)使用3～5次〔此溶液最好保存在4度冰箱，最多后再參加甲醇，最終補足液體。假設(shè)先參加甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比較困難〕〔可以配制成2×轉(zhuǎn)移緩沖液進(jìn)展保存，稀釋后使用〕TBS緩沖液：〔10mMTris-Hcl pH7.5,150mmol/L NaCl〕1mol/LTris·HCl〔pH7.5〕10mlNaCl 8.8g蒸餾水至 1000ml10×TBS緩沖液進(jìn)展保存，稀釋10倍使用〕10×TBS:Tris12.11g，NaCl88g蒸餾水至 900ml，調(diào)整pH至7.5，定容1000mlTris4.844g，NaCl35.2g。蒸餾水至 350ml，調(diào)整pH至7.5，定容400mlTBST緩沖液：〔含0.05％Tween20的TBS緩沖液〕20％Tween20 1.65mlTBS 700ml勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。封閉液：脫脂奶粉 5gTBST 100ml最好現(xiàn)用現(xiàn)配?；蛘哂煤?%BSA的TBST4℃保存。使用時，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。一． 制備凝膠5％12％分別膠配制凝固時間：分別膠30分鐘，濃縮膠50分鐘電泳時間：80V二格外鐘，100V 可以降低電壓，60V可以降低電壓，60V80V濾紙和膜的預(yù)備(在電泳完畢前20分鐘應(yīng)開頭預(yù)備工作)。檢查是否有足夠的transferbuffer，沒有馬上配制。檢查是否有適宜大小的濾紙和膜。1-10transfer