蛋白質(zhì)組學(xué)課件

第四章

蛋白質(zhì)組學(xué)第四章

蛋白質(zhì)組學(xué)1DNA轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心法則及其補(bǔ)充翻譯后得到的蛋白質(zhì)就可以行使其功能嗎？DNA轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心法則及其補(bǔ)充翻譯2新合成的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾(糖基化、磷酸化等）亞細(xì)胞定位或遷移分子間的相互作用等都會(huì)造成蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和功能發(fā)生變化新合成的翻譯后的修飾(糖基化、磷酸化等）亞細(xì)胞定位或遷移分子3

一個(gè)已知的基因序列也很難預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)的功能。同時(shí)，蛋白質(zhì)翻譯的修飾、結(jié)構(gòu)形式、蛋白質(zhì)分子的相互作用及蛋白質(zhì)分子與其他分子的相互作用等問(wèn)題，都是基因組學(xué)所不能回答的。因此，科學(xué)家們就把研究的重心由基因轉(zhuǎn)向了其編碼合成的全部蛋白質(zhì)。一個(gè)已知的基因序列也很難預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)的功能。4產(chǎn)生背景20世紀(jì)中后期，生命科學(xué)研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。2.隨著人類基因組全序列測(cè)定，生命科學(xué)跨入了后基因組時(shí)代。3.因mRNA的表達(dá)情況不能直接反應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。產(chǎn)生背景20世紀(jì)中后期，生命科學(xué)研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。54.蛋白質(zhì)有自身特有的活動(dòng)規(guī)律，如動(dòng)態(tài)修飾、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、結(jié)構(gòu)形成、代謝等，均無(wú)法從基因組水平上的研究獲知。蛋白質(zhì)構(gòu)象病更難于只靠DNA序列來(lái)解釋。5.蛋白質(zhì)不能動(dòng)態(tài)反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)。

4.蛋白質(zhì)有自身特有的活動(dòng)規(guī)律，如動(dòng)態(tài)修飾、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位66.蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)（1）蛋白質(zhì)組(Proteome)：1994年由澳大利亞Macquarie大學(xué)的學(xué)生Wilkins和他的老師提出，最早見(jiàn)文獻(xiàn)是1995年7月的“Electrophoresis”雜志上。指基因組表達(dá)的所有相應(yīng)的蛋白質(zhì)，也可說(shuō)是指細(xì)胞或機(jī)體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式。（2）蛋白質(zhì)組學(xué)：研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。

6.蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)77.蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性的特點(diǎn)（1）蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量在同一機(jī)體的不同細(xì)胞中是各不相同的。（2）同一細(xì)胞，在不同時(shí)期、不同條件下，蛋白質(zhì)組也是在不斷改變的。（3）在病理或治療過(guò)程中，細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成及其變化與正常生理過(guò)程的也不同。7.蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性的特點(diǎn)8

蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組DNA序列與基因功能之間的橋梁,是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體。蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是9基因組與蛋白質(zhì)組比較基因組與蛋白質(zhì)組比較10蛋白質(zhì)組學(xué)課件11

基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白組ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified基因組12蛋白質(zhì)組學(xué)課件13蛋白質(zhì)組學(xué)課件14蛋白質(zhì)組學(xué)研究表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)結(jié)構(gòu)功能15表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)種類表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)種類16結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)17功能蛋白質(zhì)組學(xué)

研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能，是指從動(dòng)態(tài)和整體的角度研究蛋白質(zhì)的功能及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是位于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組研究之間的層次。功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能，是指從動(dòng)態(tài)和整體的18蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及修飾(表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)):關(guān)鍵技術(shù)：2-D電泳2.蛋白質(zhì)的序列和高級(jí)結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)）：X-射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）、多維核磁共振波譜分析、電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及修飾(表達(dá)193.蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分布及移位（細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)）：確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的位置，通過(guò)純化細(xì)胞器或用質(zhì)譜儀鑒定蛋白復(fù)合物組成等。4.蛋白質(zhì)的功能模式（功能蛋白質(zhì)組學(xué)）：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其與其他分子的相互作用3.蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分布及移位（細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)）：確定蛋白20與蛋白質(zhì)工程密切相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)表達(dá)模式的研究蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)和功能研究蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)與蛋白質(zhì)工程密切相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究21表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究22大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的DNA序列已被測(cè)定,建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù),并希望籍此來(lái)回答以下幾方面的問(wèn)題:a.所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置ｂ各種蛋白質(zhì)的豐度ｃ不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化ｄ各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位ｅ某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的D23目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù),其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物),對(duì)于這些蛋白質(zhì),這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供基因名稱、蛋白質(zhì)名稱、EC編號(hào)、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)、Genbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長(zhǎng)條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度).目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括124釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的工作早于蛋白質(zhì)組概念的提出.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組的完成及其蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)在互聯(lián)網(wǎng)上的建立,大大加速了這一工作.最新版的數(shù)據(jù)庫(kù)包括6000多頁(yè),每頁(yè)代表一個(gè)已知或推測(cè)的酵母蛋白.釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的25它包含以下幾方面的信息:ａ以序列為基礎(chǔ)的已知和推測(cè)的酵母蛋白的特征信息,如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、多肽片段大小等ｂ一些研究得到的關(guān)于各種蛋白質(zhì)在翻譯后加工、亞細(xì)胞定位、功能分類方面的信息ｃ從以往的超過(guò)5000篇關(guān)于酵母蛋白研究的文章中獲得的有關(guān)各種蛋白質(zhì)功能、相互作用、突變表型的信息.借助數(shù)據(jù)庫(kù)的有力推動(dòng),在雙向電泳蛋白質(zhì)譜上最明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的大部分得到鑒定它包含以下幾方面的信息:26

正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失的缺陷型酵母的雙向蛋白質(zhì)圖譜。初步的研究表明，缺失單一基因?qū)?dǎo)致的結(jié)果并不只是缺乏此基因編碼的蛋白質(zhì)，而是能導(dǎo)致其他一系列蛋白質(zhì)量的改變。一些蛋白質(zhì)減少而另一些蛋白質(zhì)增多，當(dāng)然還有一些蛋白質(zhì)被加工修飾而導(dǎo)致性狀改變。單一基因缺失的結(jié)果總是引起蛋白質(zhì)組全局性的變化。大約20%的酵母基因缺失是致死性的，另外80%則不然,這時(shí)機(jī)體能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)對(duì)抗這種內(nèi)源性的變化。這種基因缺失的研究可能會(huì)告訴我們一些關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間相互“對(duì)話”和“作用”的重要信息，如蛋白質(zhì)間的物理聯(lián)系(這些蛋白質(zhì)可能會(huì)組成蛋白質(zhì)復(fù)合物)，信號(hào)傳遞途徑，以幫助我們了解細(xì)胞是如何構(gòu)成的以及是如何協(xié)同工作的。正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失27人類的蛋白質(zhì)組研究

對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特異的組織、細(xì)胞和疾病上.證據(jù)表明,盡管人的不同組織有著很大的功能差別,但其中的許多蛋白質(zhì)是看家蛋白,因此它們的雙向圖譜可能也是近似的.這點(diǎn)與簡(jiǎn)單生物不同,簡(jiǎn)單生物在不同的發(fā)育階段有著極不相同的蛋白質(zhì)組.因此對(duì)于人類來(lái)說(shuō),一個(gè)高質(zhì)量的基本的雙向圖譜是非常有用的,它可以作為其他組織、細(xì)胞的參照?qǐng)D譜.人的各種組織、器官、細(xì)胞乃至各種細(xì)胞器已被廣泛研究.人類的蛋白質(zhì)組研究對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特28

人的各種體液都被用于研究與某些疾病的關(guān)系.最近澳大利亞科學(xué)家利用雙向電泳技術(shù)研究眼淚中的蛋白質(zhì)與生理狀態(tài)的關(guān)系.他們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì),這個(gè)蛋白質(zhì)非常相似于在乳腺癌細(xì)胞里高表達(dá)的另一種蛋白質(zhì).這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提供疾病診治的新的手段.在一項(xiàng)利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)進(jìn)行的酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用,導(dǎo)致許多糖蛋白的糖基缺乏,如轉(zhuǎn)鐵蛋白。人的各種體液都被用于研究與某些疾病的關(guān)系.最近澳大利亞科29

癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其他蛋白質(zhì)的翻譯后加工及許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平.腫瘤的蛋白質(zhì)組研究能提供一些以往其他技術(shù)所不能提供的早期診斷依據(jù),例如利用不同細(xì)胞組織的特征蛋白質(zhì)譜,可以判別一些難以判定來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源.癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其30蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)技術(shù)31（一）研究細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的技術(shù)：2-D電泳1.1975年，PatrickOˊFarrel發(fā)明了二維凝膠電泳。2.操作（1）等電聚焦。（2）平衡膠條。（3）第二相SDS。（一）研究細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的技術(shù)：32蛋白質(zhì)組學(xué)課件33蛋白質(zhì)組學(xué)課件34蛋白質(zhì)組學(xué)課件35蛋白質(zhì)組學(xué)課件36蛋白質(zhì)組學(xué)課件37蛋白質(zhì)組學(xué)課件38蛋白質(zhì)組學(xué)課件39蛋白質(zhì)組學(xué)課件403.2-D膠上蛋白質(zhì)鑒定(1)早期Westernblot鑒定(2)Edman降解法鑒定(3)肽質(zhì)量指紋（peptide-massfingerprinting）技術(shù)鑒定(4)蛋白質(zhì)組信息學(xué)3.2-D膠上蛋白質(zhì)鑒定412D電泳→

Mass定序分析2D電泳→

Mass定序分析42（二）構(gòu)象解析技術(shù)實(shí)際測(cè)定具體蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)：X-射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）、多維核磁共振波譜分析、電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）。X-射線單晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。（1）局限性（2）改進(jìn)措施：已經(jīng)運(yùn)用原子力顯微鏡及多功能光學(xué)診斷技術(shù)深入研究蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的機(jī)理；高能量光源的使用。

（二）構(gòu)象解析技術(shù)432.通過(guò)氨基酸序列知識(shí)去辨識(shí)和推引出其決定的三維結(jié)構(gòu)（1）用分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)的方法，根據(jù)理化的基本原理，從理論上計(jì)算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。（2）通過(guò)對(duì)已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，找出一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，總結(jié)出規(guī)律，用于新蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)組學(xué)課件44（三）蛋白質(zhì)序列測(cè)定1.蛋白質(zhì)直接測(cè)序的用途2.肽序列分析的基本步驟：（1）分析已純化蛋白質(zhì)氨基酸殘基的組成。（2）測(cè)定頭尾氨基酸。（3）把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析，得到肽圖。（4）Edman降解（三）蛋白質(zhì)序列測(cè)定45

蛋白質(zhì)測(cè)序發(fā)展簡(jiǎn)史1.英國(guó)科學(xué)家Sanger測(cè)序（20世紀(jì)50年代）。2.建立色譜技術(shù)和定量氨基酸分析技術(shù)（20世紀(jì)50年代）。3.Edman降解（20世紀(jì)70年代出現(xiàn)）。儀器自動(dòng)化：液相自動(dòng)測(cè)序儀和固相蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序儀。進(jìn)入20世紀(jì)80年代，氣相測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)并實(shí)現(xiàn)了儀器自動(dòng)化。靈敏度顯著提高，樣品量只需10pmol以下，一次連續(xù)測(cè)定的順序甚至可超過(guò)80個(gè)殘基。樣品處理遠(yuǎn)比固相方法簡(jiǎn)單和操作方便。

464.20世紀(jì)70年代，華裔學(xué)者張瑞耀提出的有色Edman試劑——DABITC，使手工測(cè)序技術(shù)更加靈敏可靠。5.對(duì)2-D膠上的點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序：將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后將膜片放入測(cè)序儀的反應(yīng)室中進(jìn)行Edman降解。6.毛細(xì)管電泳技術(shù)（20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的微量分析技術(shù)）的采用，是蛋白質(zhì)N端微量順序測(cè)定方法學(xué)一個(gè)引人注目的發(fā)展。其靈敏度比HPLC高兩個(gè)數(shù)量級(jí)?？稍?0fmol的水平檢測(cè)氨基酸。微型測(cè)序儀與毛細(xì)管電泳聯(lián)用的微量蛋白質(zhì)測(cè)序方法已經(jīng)呈現(xiàn)很好的前景。4.20世紀(jì)70年代，華裔學(xué)者張瑞耀提出的有色Edman試477.蛋白質(zhì)C端測(cè)序：C端測(cè)序的重要性：為PCR擴(kuò)增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依據(jù)；以及為基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的鑒定提供關(guān)鍵的證據(jù)等。（1）最成功的方法是在Schlack早年提出的異硫氰酸法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。（2）直到20世紀(jì)90年代初由于發(fā)展出一些新的偶聯(lián)和裂解試劑，配合用HPLC對(duì)乙酰內(nèi)硫脲氨基酸（TH）的鑒定，該方法才得以較快地發(fā)展。目前已有自動(dòng)化C端測(cè)序儀，能常規(guī)地進(jìn)行6-8個(gè)殘基的C端順序測(cè)定。7.蛋白質(zhì)C端測(cè)序：C端測(cè)序的重要性：為PCR擴(kuò)增出某一488.質(zhì)譜法用于蛋白質(zhì)順序測(cè)定：（1）必要性：DNA順序測(cè)定解決不了翻譯后加工所導(dǎo)致的氨基酸殘基的修飾問(wèn)題，Edman降解不能解決N端封閉肽的測(cè)序問(wèn)題，而質(zhì)譜法能使上述問(wèn)題迎刃而解。（2）20世紀(jì)80年代初出現(xiàn)快原子轟擊質(zhì)譜（FAB質(zhì)譜）能準(zhǔn)確確定的分子量達(dá)到數(shù)千。相繼發(fā)展的串行質(zhì)譜可以把FAB得到的分子離子進(jìn)行再一次惰性原子轟擊，使肽鏈在不同部位斷裂從而得到一組片段的質(zhì)譜信息，使多肽順序測(cè)定得以實(shí)現(xiàn)。8.質(zhì)譜法用于蛋白質(zhì)順序測(cè)定：49（3）20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)了電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜測(cè)定分子量數(shù)萬(wàn)的蛋白質(zhì)準(zhǔn)確度可達(dá)萬(wàn)分之一，主要優(yōu)點(diǎn)是可與HPLC儀實(shí)現(xiàn)液質(zhì)聯(lián)用，因而能使一個(gè)蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物在得到HPLC肽譜的同時(shí)得到一張精確的肽質(zhì)量譜。飛行時(shí)間質(zhì)譜能對(duì)分子量達(dá)30萬(wàn)道爾頓的分子進(jìn)行準(zhǔn)確質(zhì)譜分析。誤差率可精確到十萬(wàn)分之一，因而該技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析已呈現(xiàn)極大應(yīng)用前景。該技術(shù)結(jié)合羧肽酶或氨肽酶的應(yīng)用可成功地進(jìn)行蛋白質(zhì)C端與N端的順序測(cè)定，該方法一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)是用樣品量極微（1-2pmol），且非?？焖伲看钨|(zhì)譜分析只需數(shù)分鐘。（3）20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)了電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸電509.質(zhì)譜技術(shù)不能完全取代Edman降解與其他蛋白質(zhì)分析方法。通常是聯(lián)合運(yùn)用這些技術(shù)。10.蛋白質(zhì)測(cè)序展望：（1）N端測(cè)序儀在靈敏度上還需提高。（2）C端測(cè)序技術(shù)需要更新型的偶聯(lián)試劑和更有效的裂解方法。（3）質(zhì)譜技術(shù)將有令人刮目相看的作為。（4）一些新的分析技術(shù)很可能進(jìn)入蛋白質(zhì)順序分析領(lǐng)域，如多維核磁共振方法。9.質(zhì)譜技術(shù)不能完全取代Edman降解與其他蛋白質(zhì)分析方法51（四）研究蛋白質(zhì)胞內(nèi)分布及移位的方法1.研究蛋白質(zhì)組的高通量方法。分別收集細(xì)胞不同區(qū)域內(nèi)蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行2-D電泳和蛋白質(zhì)鑒定。不能采用離心的方法獲取各組分蛋白，而用順序抽提亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方法。2.將胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察蛋白質(zhì)移位。（四）研究蛋白質(zhì)胞內(nèi)分布及移位的方法52（五）研究蛋白質(zhì)功能模式的技術(shù)

酵母雙雜交系統(tǒng)、選擇性噬菌體感染技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)可用于確定蛋白質(zhì)作用區(qū)域。（五）研究蛋白質(zhì)功能模式的技術(shù)53四、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的應(yīng)用1.用于尋找疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)：標(biāo)志物。2.用于微生物蛋白組研究，徹底闡明病原微生物的致病機(jī)理并尋找全新的藥物作用靶點(diǎn)。3.蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)將成為藥物設(shè)計(jì)的路標(biāo)。4.對(duì)不同生物的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較性研究，可以對(duì)生物進(jìn)化途徑提供參考，對(duì)多細(xì)胞生物的起源提供線索。5.追蹤胞內(nèi)信號(hào)分子的移位，闡明目標(biāo)蛋白質(zhì)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的位置。四、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的應(yīng)用54五、蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的困難1.2-D電泳膠上的點(diǎn)只是細(xì)胞蛋白質(zhì)中的一小部分，大部分不能被顯示。2.2-D膠上顯示的蛋白質(zhì)有偏向性。3.難溶于水或分子量大于18萬(wàn)的蛋白質(zhì)難于在2-D膠上顯示。4.質(zhì)譜技術(shù)雖有較高的靈敏度，但對(duì)來(lái)自2-D膠上的許多低豐度的蛋白質(zhì)仍不能鑒定。五、蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的困難55

第四章

蛋白質(zhì)組學(xué)第四章

蛋白質(zhì)組學(xué)56DNA轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心法則及其補(bǔ)充翻譯后得到的蛋白質(zhì)就可以行使其功能嗎？DNA轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制中心法則及其補(bǔ)充翻譯57新合成的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾(糖基化、磷酸化等）亞細(xì)胞定位或遷移分子間的相互作用等都會(huì)造成蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和功能發(fā)生變化新合成的翻譯后的修飾(糖基化、磷酸化等）亞細(xì)胞定位或遷移分子58

一個(gè)已知的基因序列也很難預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)的功能。同時(shí)，蛋白質(zhì)翻譯的修飾、結(jié)構(gòu)形式、蛋白質(zhì)分子的相互作用及蛋白質(zhì)分子與其他分子的相互作用等問(wèn)題，都是基因組學(xué)所不能回答的。因此，科學(xué)家們就把研究的重心由基因轉(zhuǎn)向了其編碼合成的全部蛋白質(zhì)。一個(gè)已知的基因序列也很難預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)的功能。59產(chǎn)生背景20世紀(jì)中后期，生命科學(xué)研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。2.隨著人類基因組全序列測(cè)定，生命科學(xué)跨入了后基因組時(shí)代。3.因mRNA的表達(dá)情況不能直接反應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。產(chǎn)生背景20世紀(jì)中后期，生命科學(xué)研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。604.蛋白質(zhì)有自身特有的活動(dòng)規(guī)律，如動(dòng)態(tài)修飾、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、結(jié)構(gòu)形成、代謝等，均無(wú)法從基因組水平上的研究獲知。蛋白質(zhì)構(gòu)象病更難于只靠DNA序列來(lái)解釋。5.蛋白質(zhì)不能動(dòng)態(tài)反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)。

4.蛋白質(zhì)有自身特有的活動(dòng)規(guī)律，如動(dòng)態(tài)修飾、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位616.蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)（1）蛋白質(zhì)組(Proteome)：1994年由澳大利亞Macquarie大學(xué)的學(xué)生Wilkins和他的老師提出，最早見(jiàn)文獻(xiàn)是1995年7月的“Electrophoresis”雜志上。指基因組表達(dá)的所有相應(yīng)的蛋白質(zhì)，也可說(shuō)是指細(xì)胞或機(jī)體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式。（2）蛋白質(zhì)組學(xué)：研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。

6.蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)627.蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性的特點(diǎn)（1）蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量在同一機(jī)體的不同細(xì)胞中是各不相同的。（2）同一細(xì)胞，在不同時(shí)期、不同條件下，蛋白質(zhì)組也是在不斷改變的。（3）在病理或治療過(guò)程中，細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成及其變化與正常生理過(guò)程的也不同。7.蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性的特點(diǎn)63

蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組DNA序列與基因功能之間的橋梁,是在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體性地研究生物體。蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是64基因組與蛋白質(zhì)組比較基因組與蛋白質(zhì)組比較65蛋白質(zhì)組學(xué)課件66

基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白組ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified基因組67蛋白質(zhì)組學(xué)課件68蛋白質(zhì)組學(xué)課件69蛋白質(zhì)組學(xué)研究表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)結(jié)構(gòu)功能70表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)種類表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)種類71結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)72功能蛋白質(zhì)組學(xué)

研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能，是指從動(dòng)態(tài)和整體的角度研究蛋白質(zhì)的功能及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是位于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組研究之間的層次。功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能，是指從動(dòng)態(tài)和整體的73蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及修飾(表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)):關(guān)鍵技術(shù)：2-D電泳2.蛋白質(zhì)的序列和高級(jí)結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)）：X-射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）、多維核磁共振波譜分析、電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及修飾(表達(dá)743.蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分布及移位（細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)）：確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的位置，通過(guò)純化細(xì)胞器或用質(zhì)譜儀鑒定蛋白復(fù)合物組成等。4.蛋白質(zhì)的功能模式（功能蛋白質(zhì)組學(xué)）：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其與其他分子的相互作用3.蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分布及移位（細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)）：確定蛋白75與蛋白質(zhì)工程密切相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)表達(dá)模式的研究蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)和功能研究蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)與蛋白質(zhì)工程密切相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究76表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究77大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究

大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的DNA序列已被測(cè)定,建立蛋白質(zhì)基因聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù),并希望籍此來(lái)回答以下幾方面的問(wèn)題:a.所有編碼基因的產(chǎn)物在雙向圖譜上的位置ｂ各種蛋白質(zhì)的豐度ｃ不同條件下各種蛋白質(zhì)表達(dá)水平及合成速率的變化ｄ各種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位ｅ某些蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式及水平大腸桿菌的蛋白質(zhì)組研究大腸桿菌全部4000多個(gè)基因的D78目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括1600個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的數(shù)據(jù),其中大約400個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)已與大約350個(gè)基因相對(duì)應(yīng)(有些基因可能有多個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物),對(duì)于這些蛋白質(zhì),這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供基因名稱、蛋白質(zhì)名稱、EC編號(hào)、功能范疇、Swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)、Genbank序列號(hào)、基因圖譜的位置、染色體上的轉(zhuǎn)錄方向以及一些生理信息(如在不同生長(zhǎng)條件下該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的豐度).目前,大腸桿菌的聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)已更新到第六版,大約包括179釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究

利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的工作早于蛋白質(zhì)組概念的提出.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因組的完成及其蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)在互聯(lián)網(wǎng)上的建立,大大加速了這一工作.最新版的數(shù)據(jù)庫(kù)包括6000多頁(yè),每頁(yè)代表一個(gè)已知或推測(cè)的酵母蛋白.釀酒酵母的蛋白質(zhì)組研究利用雙向電泳技術(shù)分析酵母蛋白譜的80它包含以下幾方面的信息:ａ以序列為基礎(chǔ)的已知和推測(cè)的酵母蛋白的特征信息,如分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、多肽片段大小等ｂ一些研究得到的關(guān)于各種蛋白質(zhì)在翻譯后加工、亞細(xì)胞定位、功能分類方面的信息ｃ從以往的超過(guò)5000篇關(guān)于酵母蛋白研究的文章中獲得的有關(guān)各種蛋白質(zhì)功能、相互作用、突變表型的信息.借助數(shù)據(jù)庫(kù)的有力推動(dòng),在雙向電泳蛋白質(zhì)譜上最明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的大部分得到鑒定它包含以下幾方面的信息:81

正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失的缺陷型酵母的雙向蛋白質(zhì)圖譜。初步的研究表明，缺失單一基因?qū)?dǎo)致的結(jié)果并不只是缺乏此基因編碼的蛋白質(zhì)，而是能導(dǎo)致其他一系列蛋白質(zhì)量的改變。一些蛋白質(zhì)減少而另一些蛋白質(zhì)增多，當(dāng)然還有一些蛋白質(zhì)被加工修飾而導(dǎo)致性狀改變。單一基因缺失的結(jié)果總是引起蛋白質(zhì)組全局性的變化。大約20%的酵母基因缺失是致死性的，另外80%則不然,這時(shí)機(jī)體能通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)對(duì)抗這種內(nèi)源性的變化。這種基因缺失的研究可能會(huì)告訴我們一些關(guān)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間相互“對(duì)話”和“作用”的重要信息，如蛋白質(zhì)間的物理聯(lián)系(這些蛋白質(zhì)可能會(huì)組成蛋白質(zhì)復(fù)合物)，信號(hào)傳遞途徑，以幫助我們了解細(xì)胞是如何構(gòu)成的以及是如何協(xié)同工作的。正在丹麥進(jìn)行的一項(xiàng)研究計(jì)劃分別作出野生型和將基因系統(tǒng)缺失82人類的蛋白質(zhì)組研究

對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特異的組織、細(xì)胞和疾病上.證據(jù)表明,盡管人的不同組織有著很大的功能差別,但其中的許多蛋白質(zhì)是看家蛋白,因此它們的雙向圖譜可能也是近似的.這點(diǎn)與簡(jiǎn)單生物不同,簡(jiǎn)單生物在不同的發(fā)育階段有著極不相同的蛋白質(zhì)組.因此對(duì)于人類來(lái)說(shuō),一個(gè)高質(zhì)量的基本的雙向圖譜是非常有用的,它可以作為其他組織、細(xì)胞的參照?qǐng)D譜.人的各種組織、器官、細(xì)胞乃至各種細(xì)胞器已被廣泛研究.人類的蛋白質(zhì)組研究對(duì)人蛋白質(zhì)組的研究主要聚焦在特83

人的各種體液都被用于研究與某些疾病的關(guān)系.最近澳大利亞科學(xué)家利用雙向電泳技術(shù)研究眼淚中的蛋白質(zhì)與生理狀態(tài)的關(guān)系.他們發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì),這個(gè)蛋白質(zhì)非常相似于在乳腺癌細(xì)胞里高表達(dá)的另一種蛋白質(zhì).這個(gè)發(fā)現(xiàn)可能會(huì)提供疾病診治的新的手段.在一項(xiàng)利用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)進(jìn)行的酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用,導(dǎo)致許多糖蛋白的糖基缺乏,如轉(zhuǎn)鐵蛋白。人的各種體液都被用于研究與某些疾病的關(guān)系.最近澳大利亞科84

癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其他蛋白質(zhì)的翻譯后加工及許多蛋白質(zhì)的表達(dá)水平.腫瘤的蛋白質(zhì)組研究能提供一些以往其他技術(shù)所不能提供的早期診斷依據(jù),例如利用不同細(xì)胞組織的特征蛋白質(zhì)譜,可以判別一些難以判定來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的來(lái)源.癌細(xì)胞不僅有許多特異蛋白質(zhì)產(chǎn)物,而且這些產(chǎn)物還會(huì)影響其85蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)技術(shù)蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)技術(shù)86（一）研究細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的技術(shù)：2-D電泳1.1975年，PatrickOˊFarrel發(fā)明了二維凝膠電泳。2.操作（1）等電聚焦。（2）平衡膠條。（3）第二相SDS。（一）研究細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)模式的技術(shù)：87蛋白質(zhì)組學(xué)課件88蛋白質(zhì)組學(xué)課件89蛋白質(zhì)組學(xué)課件90蛋白質(zhì)組學(xué)課件91蛋白質(zhì)組學(xué)課件92蛋白質(zhì)組學(xué)課件93蛋白質(zhì)組學(xué)課件94蛋白質(zhì)組學(xué)課件953.2-D膠上蛋白質(zhì)鑒定(1)早期Westernblot鑒定(2)Edman降解法鑒定(3)肽質(zhì)量指紋（peptide-massfingerprinting）技術(shù)鑒定(4)蛋白質(zhì)組信息學(xué)3.2-D膠上蛋白質(zhì)鑒定962D電泳→

Mass定序分析2D電泳→

Mass定序分析97（二）構(gòu)象解析技術(shù)實(shí)際測(cè)定具體蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)：X-射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）、多維核磁共振波譜分析、電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）。X-射線單晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。（1）局限性（2）改進(jìn)措施：已經(jīng)運(yùn)用原子力顯微鏡及多功能光學(xué)診斷技術(shù)深入研究蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的機(jī)理；高能量光源的使用。

（二）構(gòu)象解析技術(shù)982.通過(guò)氨基酸序列知識(shí)去辨識(shí)和推引出其決定的三維結(jié)構(gòu)（1）用分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)的方法，根據(jù)理化的基本原理，從理論上計(jì)算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。（2）通過(guò)對(duì)已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，找出一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，總結(jié)出規(guī)律，用于新蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)組學(xué)課件99（三）蛋白質(zhì)序列測(cè)定1.蛋白質(zhì)直接測(cè)序的用途2.肽序列分析的基本步驟：（1）分析已純化蛋白質(zhì)氨基酸殘基的組成。（2）測(cè)定頭尾氨基酸。（3）把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析，得到肽圖。（4）Edman降解（三）蛋白質(zhì)序列測(cè)定100

蛋白質(zhì)測(cè)序發(fā)展簡(jiǎn)史1.英國(guó)科學(xué)家Sanger測(cè)序（20世紀(jì)50年代）。2.建立色譜技術(shù)和定量氨基酸分析技術(shù)（20世紀(jì)50年代）。3.Edman降解（20世紀(jì)70年代出現(xiàn)）。儀器自動(dòng)化：液相自動(dòng)測(cè)序儀和固相蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序儀。進(jìn)入20世紀(jì)80年代，氣相測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)并實(shí)現(xiàn)了儀器自動(dòng)化。靈敏度顯著提高，樣品量只需10pmol以下，一次連續(xù)測(cè)定的順序甚至可超過(guò)80個(gè)殘基。樣品處理遠(yuǎn)比固相方法簡(jiǎn)單和操作方便。

1014.20世紀(jì)70年代，華裔學(xué)者張瑞耀提出的有色Edman試劑——DABITC，使手工測(cè)序技術(shù)更加靈敏可靠。5.對(duì)2-D膠上的點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序：將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后將膜片放入測(cè)序儀的反應(yīng)室中進(jìn)行Edman降解。6.毛細(xì)管電泳技術(shù)（20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的微量分析技術(shù)）的采用，是蛋白質(zhì)N端微量順序測(cè)定方法學(xué)一個(gè)引人注目的發(fā)展。其靈敏度比HPLC高兩個(gè)數(shù)量級(jí)?？稍?0fmol的水平檢測(cè)氨基酸。微型測(cè)序儀與毛細(xì)管電泳聯(lián)用的微量蛋白質(zhì)測(cè)序方法已經(jīng)呈現(xiàn)很好的前景。4.20世紀(jì)70年代，華裔學(xué)者張瑞耀提出的有色Edman試1027.蛋白質(zhì)C端測(cè)序：C端測(cè)序的重要性：為PCR擴(kuò)增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依據(jù)；以及為基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的鑒定提供關(guān)鍵的證據(jù)等。（1）最成功的方法是在Schlack早年提出的異硫氰酸法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。（2）直到20世紀(jì)90年代初由于發(fā)展出一些新的偶聯(lián)和裂解試劑，配合用HPLC對(duì)乙酰內(nèi)硫脲氨基酸（TH）的鑒定，該方法才得以較快地發(fā)展。目前已有