細胞工程知識點

細胞工程知識點細胞工程知識點細胞工程知識點xxx公司細胞工程知識點文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設(shè)計，管理制度細胞工程知識點細胞工程：以細胞為對象，應(yīng)用生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地利用或改造生物遺傳性狀，以獲得特定的細胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。細胞工程的應(yīng)用：動植物快速繁殖技術(shù)：植物組織培養(yǎng)、人工種子、試管動物、克隆動物新品種的培育：細胞融合、細胞水平的重組細胞工程生物制品：單克隆抗體制備、疫苗生產(chǎn)細胞療法與組織修復(fù)：2細胞工程理論基礎(chǔ)細胞全能性：每個活的體細胞都具有像胚性細胞那樣，經(jīng)過誘導(dǎo)能分化發(fā)育成為一個新個體的潛在能力，并且具有母體的全部的遺傳信息。細胞分化：指細胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程。細胞的脫分化：在一定營養(yǎng)和刺激因素作用下,具有特定結(jié)構(gòu)與功能的植物組織的細胞被誘導(dǎo)而改變原來的發(fā)育途徑,逐步失去原來的分化狀態(tài),細胞特性消失,轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚鷻C能的細胞,并進行活躍的細胞分裂,這一過程稱為去分化。3細胞工程技術(shù)實驗室條件：組成：準備室、無菌間、操作間、培養(yǎng)室、分析室。無菌技術(shù)、顯微技術(shù)、細胞觀察與分析、細胞分離、細胞保存與復(fù)蘇（1）細胞保存方法傳代培養(yǎng)保存法低溫冷凍保存法(低溫、超低溫保存)液體固化的方式（形成冰晶、形成無定型的玻璃化狀態(tài)）玻璃化指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的固定化過程，在此狀態(tài)時，水分子沒有發(fā)生重排，不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積的變化，因此不會由于機械或溶液效應(yīng)造成組織和細胞傷害，化凍后的細胞仍有活力。冷凍方法（緩慢冷凍法、快速冷凍法預(yù)冷凍法包括逐級冷凍和兩部冷凍）細胞復(fù)蘇按一定復(fù)溫速度將細胞懸液由凍存狀態(tài)恢復(fù)到常溫的過程。復(fù)蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。細胞培養(yǎng)和代謝調(diào)控：細胞培養(yǎng)：模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。細胞培養(yǎng)的操作方式：分批式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)、灌流式培養(yǎng)。分批式培養(yǎng)（植物細胞培養(yǎng)）：分批式培養(yǎng)過程的環(huán)境隨時間變化很大，可分為延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期等五個階段。流加式培養(yǎng)(適合植物）：隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補充新的營養(yǎng)成分，使細胞進一步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。半連續(xù)式培養(yǎng)（動物細胞）：定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細胞、載體一起取出。連續(xù)式培養(yǎng)：該模式是將細胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。灌流式培養(yǎng)：灌流式培養(yǎng)是把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。（動物細胞）代謝工程：通過某些特定生化反應(yīng)的修飾來定向的改善細胞的特性，或是利用重組DNA技術(shù)創(chuàng)造新的化合物。它是利用基因工程或是分子生物學(xué)技術(shù)、將生物技術(shù)內(nèi)的代謝路徑改變，通常改變生體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的酶。代謝工程技術(shù)目前以微生物利用為主，改變工業(yè)微生物的代謝路徑，生產(chǎn)所需要的化學(xué)物質(zhì)，如抗生素。逆代謝工程：是一種采用逆向思維方式進行代謝設(shè)計的新型代謝工程。就是先在異源生物或相關(guān)模型系統(tǒng)中，通過計算或推理確定所希望的表型，然后確定該表型的決定基因或特定的環(huán)境因子，然后通過基因改造或環(huán)境改造是該表型在特定的生物中表達。植物人工繁殖植物組織培養(yǎng)：是指在無菌條件下，將離體的植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等）、組織（如花藥組織、胚乳、皮層等）、細胞（體細胞、生殖細胞等）、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)臈l件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽，或者長成新的完整植株的一種實驗技術(shù)。也稱植物離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)再生植株的途徑：.器官發(fā)生途徑：離體培養(yǎng)的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程體細胞胚發(fā)生途徑：從體細胞產(chǎn)生胚狀體的過程植物組織培養(yǎng)的問題：玻璃化、褐化問題、微生物污染問題。玻璃化問題解決方案：利用固體培養(yǎng)基,增加瓊脂濃度，選擇適當(dāng)?shù)奶荚?提高培養(yǎng)基中蔗糖含量，從根本上降低培養(yǎng)基中的滲透勢,造成細胞吸水阻遏,減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分；采用通氣性好的封口材料如紗布、脫脂棉等代替聚乙烯塑料膜作為封口材料,可降有效低培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境的相對濕度,減輕有害氣體的積累,使植物光合作用順暢。非受傷的物理和化學(xué)協(xié)迫可以增加乙烯的合成。乙烯促進葉綠素分解及細胞的畸形發(fā)展。乙烯處理破壞膜的結(jié)構(gòu)，解離細胞壁，細胞內(nèi)積累有少量纖維素及泡狀物質(zhì)。培養(yǎng)基中BA濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化成正相關(guān)，BA濃度越高或培養(yǎng)溫度越高，玻璃苗比率越大。選擇搭配合適的激素,適當(dāng)降低培養(yǎng)基中ＢＡ的濃度均可減輕玻璃苗的出現(xiàn)。通過培養(yǎng)條件(溫度和光照)減少玻璃苗的發(fā)生。適當(dāng)?shù)蜏靥幚砜上ＡЩ?，提高光照強?適當(dāng)延長光照時間,充分利用自然光照也可以減低玻璃苗的發(fā)生頻率。在培養(yǎng)基中減少或除去ＮＨ4ＮＯ3，附加活性炭、青霉素、聚乙烯醇(ＰＶＡ)、Ｃａ、赤霉素(ＧＡ)及多效唑(ＰＰ333)等,減少繼代培養(yǎng)的次數(shù)等措施均可降低觀賞植物組培過程中玻璃苗的發(fā)生。褐變解決途徑：、選取適宜的外植體選擇適宜的培養(yǎng)條件細胞篩選和預(yù)處理使用抑制劑（Vc、檸檬酸、巰基乙醇、谷胱甘肽、DTT等）使用吸附劑（活性炭、PVP等）微生物污染問題防治措施：改進外植體消毒方法反復(fù)檢查培養(yǎng)物是否污染使用抗生素（用兩性霉素B、青霉素、鏈霉素）17、人工種子三部分：人工種皮外層，保護胚狀體中的水分免于喪失和防止外部力量沖擊；人工胚乳，含有必需的營養(yǎng)成分和某些植物激素；胚狀體或芽。18、極性現(xiàn)象：由細胞的電場方向決定的。因為電場方向決定著細胞內(nèi)的物質(zhì)分配，這些物質(zhì)包括無機鹽類、蛋白質(zhì)、核糖核酸等一些帶電荷物質(zhì)。同時，生長素的梯度、pH梯度、滲透壓大小、機械壓、光照等都能使細胞形成電場，特別是膜上和Ca2+結(jié)合的蛋白質(zhì)帶有凈的電荷，它在細胞內(nèi)電場的建立中起著非常重要的作用。19、植物激素的作用：(1)由IAA和一些CTK的組合對愈傷組織根和芽的誘導(dǎo)。(2)由IAA和GA3（赤霉素）在維管組織分化中的相互作用。(3)由IAA對莖中皮層和髓組織內(nèi)以及愈傷組織內(nèi)維管束的誘導(dǎo)。(4)莖組織對IAA的反應(yīng)有不定根的發(fā)生。(5)由GA3、IAA和乙烯對開花的誘導(dǎo)和性別的控制。20、細胞分化的調(diào)控機制：1）細胞分化基因表達的主要調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，而不是翻譯水平。2）調(diào)節(jié)細胞中轉(zhuǎn)錄過程的因素是非組蛋白,組蛋白使基因轉(zhuǎn)錄過程關(guān)閉，非組蛋白使部分基因轉(zhuǎn)錄過程打開。21、植物胚胎培養(yǎng)：對植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）進行離體無菌培養(yǎng)、使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。包括：成熟胚培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)和試管受精等。22、植物脫毒方法：1）物理法：高溫處理、低溫處理2）化學(xué)法：利用嘌呤和嘧啶類似物、氨基酸、抗生素等化學(xué)藥品處理患病植物來抑制植物體內(nèi)病毒的復(fù)制。3）生物學(xué)方法：莖尖培養(yǎng)、微體嫁接法、通過愈傷組織培養(yǎng)、珠心培養(yǎng)法、花藥培養(yǎng)脫毒。動物人工繁殖體外受精：是指將哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。試管動物培育過程：精子采集與體外獲能、卵子采集與成熟培養(yǎng)。體外受精胚胎體外培養(yǎng)胚胎移植體外發(fā)育、出生胚胎移植：是指將受精卵或發(fā)育到一定階段的胚胎移植到與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的“受體”母畜輸卵管或子宮的技術(shù)。人工受精：將采集的精子注入發(fā)情處理的母體內(nèi)完成受精過程。人工受精繁殖動物的意義：1）提高優(yōu)秀種公畜的利用率2）加速品種改良3）家畜配種不受時間和地域限制4）大幅度減少種公畜的飼養(yǎng)數(shù)量5）克服公母畜體型懸殊和種間交配困難6）防止疾病傳播7）有利于提高母畜的受胎率5、人工授精技術(shù)3個環(huán)節(jié)：采精、精液處理和輸精。6、細胞核移植克隆動物的技術(shù)路線：1）核供體細胞的準備2）受體細胞的去核3）細胞核移植、激活4）重組胚的培養(yǎng)與移植5）核移植后代的鑒定7、胚胎冷凍保存方法：程序冷凍法、玻璃化冷凍法。主要的冷凍損傷機制包括:一溶液效應(yīng)造成化學(xué)損傷二是細胞內(nèi)結(jié)冰造成物理損傷三是細胞滲透壓異常損傷。冷凍保護劑：滲透型冷凍保護劑屬于細胞內(nèi)液抗凍保護劑：甘油、二甲亞砜非滲透型冷凍保護劑葡萄糖、二糖（蔗糖）、三塘（棉子糖）、聚乙烯吡咯烷酮、清蛋白注：抗凍蛋白8、精子冷凍保存方法：常溫保存、低溫保存、冷凍保存

9、卵母細胞保存：玻璃化冷凍法、一步冷凍法、超快速冷凍法細胞重組與細胞融合細胞質(zhì)工程：是研究真核細胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細胞器、細胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細胞質(zhì)融合：也叫細胞雜交，是使用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技術(shù)。細胞質(zhì)融合方法：生物法：病毒誘導(dǎo)細胞融合化學(xué)法：聚乙二醇誘導(dǎo)、脂質(zhì)體法物理法：電融合誘導(dǎo)法病毒誘導(dǎo)細胞融合的優(yōu)缺點：優(yōu)點：操作簡單、成本低。缺點：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分，病毒可能感染操作者與親本細胞聚乙二醇介導(dǎo)的細胞融合優(yōu)缺點：優(yōu)點：融合成本低，無需特殊設(shè)備；融合產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種的限制。缺點：融合過程繁瑣，聚乙二醇可能對細胞有害。點融合誘導(dǎo)法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：融合率高、重復(fù)性和可操作性強。缺點：可能會造成不可恢復(fù)的細胞損傷。新品種的培育體細胞雜交：是指將不同來源地體細胞融合并使之分化再生，形成新品種的技術(shù)。多倍體育種的方法：化學(xué)方法：一些化學(xué)物質(zhì)可以阻止卵母細胞第二極體生物釋放或細胞分裂而產(chǎn)生多倍體。常用的化學(xué)物質(zhì)有：細胞松弛素、秋水仙素、聚乙二醇等。物理方法：主要包括溫變激變、機械創(chuàng)傷、輻射、水靜壓法和高鹽高堿法等、生物法：指體細胞雜交，利用染色體加倍個體和為加倍個體雜交繁殖多倍體后代，常與物理化學(xué)法結(jié)合使用。雌核發(fā)育：精子經(jīng)過處理使用其核不參與受精卵卵球的發(fā)育，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進行的一種發(fā)育方式。雄核發(fā)育：卵細胞不受精，卵核消失，或卵細胞受精前失活，由精核在在卵細胞內(nèi)單獨發(fā)育成單倍體，因此只含有一套雄配子染色體。、雌核發(fā)育存在的問題：人工雌核發(fā)育的后代成活率較低，有的個體還有雌雄間性的特征。.植物離體受精：指體外無菌條件下培養(yǎng)未受精的子房、胚珠和花粉、使花粉萌發(fā)進入胚珠完成受精的技術(shù)。包括離體傳粉和體外受精兩類。胚胎嵌合：將兩枚胚胎細胞(同種或異種動物胚胎)融合共同發(fā)育成為一個胚胎為嵌合胚胎。將該胚胎移植給受體，妊娠產(chǎn)仔，如該仔畜具有以上兩種動物胚胎的細胞稱之為嵌合體動物。植物細胞代謝產(chǎn)物制備植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器分為兩大類：機械攪拌式生物反應(yīng)器氣升式生物反應(yīng)器：鼓泡式生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器細胞固定化培養(yǎng)：是指游離的細胞包埋在支持物內(nèi)部或表面進行培養(yǎng)的一門技術(shù)。植物細胞固定化培養(yǎng)的優(yōu)點：細胞經(jīng)包埋后所受的剪切力損傷減少，維持細胞的穩(wěn)定性，適合脆弱的植物細胞的培養(yǎng)，同時也利于采用傳統(tǒng)生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)。懸浮細胞體系中的細胞密度比較高時會因粘度增加引起傳質(zhì)困難。固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞密度遠高于懸浮培養(yǎng)，但不會改變培養(yǎng)液流體性質(zhì)，利于傳質(zhì)。大多數(shù)植物次級代謝產(chǎn)物合成生長停止后才大量合成。采用固定化培養(yǎng)可以將細胞生長與產(chǎn)物合成分成兩個階段。固定化培養(yǎng)方法：吸附固定法、共價結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法。固定化培養(yǎng)生物反應(yīng)器：采用合適的機械攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、鼓泡式生物反應(yīng)器等進行培養(yǎng)。也可將細胞直接吸附或包埋在特殊設(shè)計的生物反應(yīng)器內(nèi)的介質(zhì)表面或內(nèi)部進行培養(yǎng)：如中空纖維生物反應(yīng)器。看護培養(yǎng)：用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續(xù)分裂和增值。這塊愈傷組織被稱為看護組織。飼養(yǎng)層培養(yǎng)：把處理過的無分裂能力或分裂很慢的細胞來飼養(yǎng)所需要的細胞，使其分裂和生長。兩步培養(yǎng)法：非生長偶聯(lián)型的細胞培養(yǎng)一般采取兩步法：第一步：采用利于細胞生長的培養(yǎng)基使細胞達到高的細胞濃度。第二步：更換利于細胞產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基或者添加代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)或誘導(dǎo)子促進產(chǎn)物的合成。兩相培養(yǎng)：在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細胞在水相中生長合成次級代謝產(chǎn)物，分泌出來的產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移至有機相中。毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物：一些植物的次級代謝產(chǎn)物在根里大量合成，但正常艮的培養(yǎng)非常困難，生長緩慢，收獲困難，而許多毛狀根在離題培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出次級代謝產(chǎn)物的合成，產(chǎn)物較正常植物及懸浮培養(yǎng)細胞要高。利用RI質(zhì)粒致根區(qū)誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生。毛狀根：是發(fā)根農(nóng)桿菌感染雙子葉植物后，形成的類似頭發(fā)一樣的組織。毛狀根誘導(dǎo)的方法：外植體接種法、莖桿接種法、原生質(zhì)體—農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法。微藻培養(yǎng)及應(yīng)用適合培養(yǎng)的微藻：藍藻門、綠藻門、金藻門、紅藻門。微藻應(yīng)用：微藻在能源、醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化工、環(huán)保、農(nóng)業(yè)及航天等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值。保健品、功能食品：片劑、粉劑、添加劑水產(chǎn)養(yǎng)殖：餌料航天：安保系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因藥物：可以食用能源：生物柴油、氫動物細胞培養(yǎng)生物制藥動物細胞培養(yǎng)：是模擬體內(nèi)生理環(huán)境使分離的動物細胞在體外生存、增殖的一門技術(shù)。貼壁型細胞的分類：成纖維細胞、上皮型細胞、游走型細胞、多形型細胞。接觸性抑制：接觸性抑制是某些動物細胞體外培養(yǎng)的生長特性之一，是指由于細胞相互接觸而抑制細胞運動性的現(xiàn)象。密度抑制：細胞接觸后匯合成片后，只要營養(yǎng)充分，細胞仍能進行增殖分裂。但當(dāng)細胞密度達到一定程度后，營養(yǎng)相對缺乏，代謝產(chǎn)物增多，發(fā)生密度抑制現(xiàn)象。培養(yǎng)基的類型：天然培養(yǎng)基：血清、組織提取液、雞胚汁合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基動物細胞培養(yǎng)分類：貼壁培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)動物細胞貼壁生長的過程：游離期、吸附期、繁殖期、退化期。動物細胞小規(guī)模培養(yǎng)有哪幾種類型：懸滴培養(yǎng)法、灌注小式培養(yǎng)法、培養(yǎng)板培養(yǎng)法、轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法。傳代培養(yǎng)：是指將原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。細胞的體外大量增殖以及細胞系的建立是通過傳代培養(yǎng)實現(xiàn)的。細胞系：是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。第一次傳代培養(yǎng)后的細胞即為細胞系。不能連續(xù)培養(yǎng)的為有限細胞系、能連續(xù)培養(yǎng)下去的是連續(xù)細胞系。細胞株：是指從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或篩選的方法，由單細胞增值形成的細胞群。微載體培養(yǎng)基本流程：選擇合適的微載體類型浸泡水化及消毒接種培養(yǎng)觀察與細胞記數(shù)傳代培養(yǎng)消化與收獲微載體培養(yǎng)的優(yōu)點：模擬了體內(nèi)三維生長環(huán)境，減輕了接觸抑制，可以多層生長很好地解決了生物反應(yīng)器的空間分布問題，單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高；培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小；容易放大。把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起接種和收獲方便：可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，培養(yǎng)基利用率高16動物細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器機械攪拌式槳葉改造，充氣攪拌式改造，微載體培養(yǎng)，中空纖維式培養(yǎng)17球傳球接種技術(shù)，將貼滿細胞的微載體與新鮮微載體混合實現(xiàn)細胞因隨機碰撞而實現(xiàn)轉(zhuǎn)移貼附在新載體表面的技術(shù)病毒疫苗的類型：滅活疫苗、減毒活疫苗干擾素：是一種細胞因子，是真核細胞對各種刺激反應(yīng)后形成的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器

1、轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器：將外源基因轉(zhuǎn)入細胞或動植物，利用細胞增殖或者動植物代謝準備外源基因的表達產(chǎn)物的技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動物：:是指在基因組內(nèi)穩(wěn)定地整合以實驗方法導(dǎo)入的外源基因，并且外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代的遺傳工程動物。一般用胚胎干細胞法，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法