食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)(與“檢測(cè)”有關(guān)的文檔共39張)

食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)第一頁(yè)，共39頁(yè)。第一節(jié)概述轉(zhuǎn)基因生物：利用基因工程技術(shù)改變基因組的構(gòu)成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或者農(nóng)產(chǎn)品加工動(dòng)植物、微生物及產(chǎn)品。主要是轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因食品：①：轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物、微生物產(chǎn)品，如轉(zhuǎn)基因大豆②：轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物、微生物產(chǎn)品直接加工品，如轉(zhuǎn)基因大豆油③：以①和②為原料生產(chǎn)的食品和添加劑，如轉(zhuǎn)基因大豆油加工成的人造奶油。轉(zhuǎn)基因成分（外源基因成分）：物種本身不具有的，而是來(lái)源于其他物種的功能基因序列。第二頁(yè)，共39頁(yè)。轉(zhuǎn)基因食品的特征具有其原有基因表達(dá)的性狀和功能存在外源DNA的表達(dá)產(chǎn)物及其生物活性第三頁(yè)，共39頁(yè)?；蛑亟M體載體：自我復(fù)制，運(yùn)載工具目的基因：轉(zhuǎn)基因生物性狀改變直接相關(guān)DNA調(diào)控元件：使目的基因表達(dá)精確開(kāi)始和終止，表達(dá)增強(qiáng)標(biāo)記基因：進(jìn)行標(biāo)記以便篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞報(bào)告基因：編碼某種易于檢測(cè)蛋白質(zhì)或酶的基因基因組基因組啟動(dòng)子終止子外源目的基因基因重組體示意圖第四頁(yè)，共39頁(yè)。外源基因表達(dá)的產(chǎn)物主要包括：目的基因、標(biāo)記基因和報(bào)告基因表達(dá)的蛋白，或意外表達(dá)的蛋白。使得其具有有傳統(tǒng)食物有不同的生物特性，由此產(chǎn)生安全性問(wèn)題。第五頁(yè)，共39頁(yè)。第二節(jié)食品中轉(zhuǎn)基因成分檢驗(yàn)檢測(cè)方法概述主要針對(duì)外源DNA及其表達(dá)產(chǎn)物DNA分析蛋白質(zhì)抗原特性PCR法ELISA和蛋白印跡法第六頁(yè)，共39頁(yè)。檢測(cè)流程采樣混樣樣品制備目標(biāo)物質(zhì)提取PCR或蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果判斷結(jié)果報(bào)告第七頁(yè)，共39頁(yè)。采樣要求1一般規(guī)定：所用器具清潔干燥無(wú)DNA和蛋白質(zhì)污染；避免樣品散落，防止污染生態(tài)環(huán)境；短時(shí)間內(nèi)完成，避免樣品組成發(fā)生變化2抽樣方法：隨機(jī)原則；“三層五點(diǎn)”；若加工工程損壞DNA,則加大采樣量第八頁(yè)，共39頁(yè)。采樣要求3抽樣數(shù)量：根據(jù)轉(zhuǎn)基因限量水平確定每批中應(yīng)抽取的原始樣品最小數(shù)量4樣品制備與保存：分三份，用于檢測(cè)，復(fù)檢和備查；及時(shí)加貼標(biāo)簽，注明編號(hào)、貨物名稱、品種、抽樣時(shí)間、抽樣人及其他必要信息第九頁(yè)，共39頁(yè)。外源基因檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)目的和檢測(cè)結(jié)果特異性水平不同，檢測(cè)方法可分為四類：初篩試驗(yàn)：普遍存在的基因重組通用元件基因特異性試驗(yàn)：基因重組體中含有的外源基因組成結(jié)構(gòu)特異性試驗(yàn)：目的基因與調(diào)控基因連接處的核苷酸序列事件特異性試驗(yàn)：插入的基因序列和植物基因組之間的連接區(qū)第十頁(yè)，共39頁(yè)。DNA提取及純化為什么要提取純化？植物細(xì)胞中DNA主要存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞中各種DNA稱為總DNA，其中95%以上的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合存在的。植物細(xì)胞中還存在大量多糖、蛋白質(zhì)、多糖、多酚類物質(zhì)和RNA等成分。這些物質(zhì)都會(huì)影響后續(xù)DNA的PCR檢測(cè)。第十一頁(yè)，共39頁(yè)。DNA提取及純化轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)時(shí)需要先提取總DNA，利用去污劑或有機(jī)溶劑破壞細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞，是DNA與蛋白質(zhì)分離并游離于提取液中，然后去除雜質(zhì)成分。DNA純化的原理是根據(jù)乙醇或異丙醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合水分子的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于DNA，在DNA提取液中加入乙醇或異丙醇，DNA因溶解度降低而析出。

第十二頁(yè)，共39頁(yè)。DNA提取方法一類：改進(jìn)的傳統(tǒng)方法，如苯酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲基胺法（簡(jiǎn)稱CTAB法）、二氧化硅法等。第二類：試劑盒法，試劑盒法因?yàn)椴僮骱?jiǎn)便而被廣泛應(yīng)用。第十三頁(yè)，共39頁(yè)。CTAB法樣本準(zhǔn)備：固體樣本要研磨成大小在2mm以下的顆粒，也可以用液氮研磨至DNA充分釋放并滿足DNA提取的要求；液態(tài)樣本可以通過(guò)離心沉淀、加熱蒸發(fā)、冷凍干燥等方法得到干物質(zhì)用于DNA提取。

第十四頁(yè)，共39頁(yè)。CTAB法原理CTAB能溶解細(xì)胞膜并能與DNA結(jié)合成CTAB-DNA復(fù)合物，該復(fù)合物可溶解于高鹽溶液中（如氯化鈉），蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)在此溶解中因溶解度降低而生成沉淀，經(jīng)離心后與復(fù)合物分離；然后將該復(fù)合物置于低鹽溶液中，因其不溶性而沉淀析出；最后將復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，加入乙醇使DNA沉淀，離心后獲得純化的DNA。

第十五頁(yè)，共39頁(yè)。CTAB法主要試劑按下表配置試劑，定容至200ml,高壓滅菌第十六頁(yè)，共39頁(yè)。DNA質(zhì)量和純度檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠里進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察DNA條帶判斷核酸定量檢測(cè)

紫外分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA溶液的OD值，OD260/OD280一般在~，高了表明有RNA污染，低了表明有蛋白質(zhì)或有機(jī)溶劑污染。

第十七頁(yè)，共39頁(yè)。核酸PCR檢測(cè)PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。PCR反應(yīng)體系是由DNA模版、引物、dNTP、DNA聚合酶、鎂離子和緩沖液等組成。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

第十八頁(yè)，共39頁(yè)。變性：94℃退火：56℃延伸：72℃第十九頁(yè)，共39頁(yè)。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法核酸PCR定性檢測(cè)：檢測(cè)目標(biāo)基因是否存在（有沒(méi)有）核酸PCR定量檢測(cè)：檢測(cè)目標(biāo)基因存在的量（有多少）第二十頁(yè)，共39頁(yè)。1核酸PCR定性檢測(cè)檢測(cè)原理是定性PCR檢測(cè)對(duì)象包括轉(zhuǎn)基因食品目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等外源基因和元件。根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特異性序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)試樣中外源目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在預(yù)期特異性片段，判斷樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。第二十一頁(yè)，共39頁(yè)。為了提高反應(yīng)準(zhǔn)確性，在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。在陽(yáng)性對(duì)照PCR反應(yīng)時(shí)，內(nèi)源基因和待測(cè)樣品的特異性序列都得到擴(kuò)增，陰性對(duì)照沒(méi)有任何擴(kuò)增，表明PCR體系正常工作。第二十二頁(yè)，共39頁(yè)。2實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在普通PCR反應(yīng)體系中，增加能與模版結(jié)合的兩端有熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡聚核苷酸探針。在PCR體系中加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增時(shí)，兩條引物分別與待擴(kuò)增目的DNA片段的5’端和3’端互補(bǔ)結(jié)合；探針則與兩條引物之間的目的DNA片段互補(bǔ)結(jié)合。第二十三頁(yè)，共39頁(yè)。Taq酶的5‘－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。擴(kuò)增反應(yīng)所經(jīng)歷的PCR循環(huán)數(shù)稱為循環(huán)閾值Ct值。Ct值與模版起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，只要獲得測(cè)試樣品的Ct值就可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該樣品中目標(biāo)核酸的絕對(duì)含量。第二十四頁(yè)，共39頁(yè)。3LAMP檢測(cè)

LAMP即環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中各個(gè)角落的DNA或RNA的特異高效擴(kuò)增。擴(kuò)增目的片段時(shí)要依賴一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶和四條能夠識(shí)別靶序列上六個(gè)特異區(qū)域的引物。本方法特異性高，不需要熱循環(huán)設(shè)備，具有操作簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)。第二十五頁(yè)，共39頁(yè)。第二十六頁(yè)，共39頁(yè)。蛋白質(zhì)檢測(cè)（ELISA）原理:從測(cè)試樣品中按照一定的程序提取含有目標(biāo)蛋白的基質(zhì)，利用抗體與目標(biāo)蛋白（為抗原）特異性結(jié)合的特性，通過(guò)對(duì)偶聯(lián)抗原與抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，而實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品特異蛋白的檢測(cè)。

優(yōu)點(diǎn)：具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)：由于抗原抗體的專一性，每種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品都需要開(kāi)發(fā)專門(mén)的檢測(cè)試劑。另外加工容易破壞蛋白的抗原性，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。第二十七頁(yè)，共39頁(yè)。ELISA吸附原理圖第二十八頁(yè)，共39頁(yè)。將原料樣品粉碎后，加入緩沖液混勻，震蕩抽提蛋白質(zhì)，離心后去上清液稀釋，加入偶聯(lián)抗體孵育，在一定條件下是特異性蛋白進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定其吸光值。同時(shí)使用與基質(zhì)一致的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)外源蛋白的濃度。每一輪反應(yīng)都要包括空白、陰性標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品。蛋白質(zhì)檢測(cè)操作第二十九頁(yè)，共39頁(yè)。其他檢測(cè)方法1蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析通過(guò)研究外源基因在同種或不同種作物中的蛋白質(zhì)差異性表達(dá)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品目前主要采用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)及基于同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析優(yōu)點(diǎn)：不僅能夠鑒定差異表達(dá)的蛋白，還能對(duì)其進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量第三十頁(yè)，共39頁(yè)。2近紅外光譜分析法第三十一頁(yè)，共39頁(yè)。3變性高效液相色譜法基于異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中保留時(shí)間比同源雙鏈短，故先被洗脫下來(lái)，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或者多峰的洗脫曲線。只能鑒定是否存在轉(zhuǎn)基因成分，不能檢測(cè)轉(zhuǎn)基因具體發(fā)生的位置及該區(qū)域的基因序列等信息。第三十二頁(yè)，共39頁(yè)?；蛐酒夹g(shù)基因芯片：通過(guò)微加工技術(shù)，將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的特定序列的DNA片段（基因探針）有規(guī)律地排列固定于支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，與計(jì)算機(jī)的電子芯片十分相似，所以被稱為基因芯片。

第三十三頁(yè)，共39頁(yè)?；河址Q載片，是基因芯片中用于固定探針的基質(zhì)，通常采用標(biāo)準(zhǔn)的載玻片或者其他固體載體，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾制備而成?；蛐酒结槪河址Q寡核苷酸探針，是基因芯片中固定于基質(zhì)表面、能與樣本DNA互補(bǔ)、用于探測(cè)樣本DNA信息的核酸分子。雜交：指兩條互補(bǔ)的單鏈核酸形成一條穩(wěn)定的雙螺旋分子的過(guò)程第三十四頁(yè)，共39頁(yè)?；蛐酒瑱z測(cè)原理：探針與待測(cè)樣品中目標(biāo)序列按堿基互補(bǔ)原理發(fā)生特異性雜交反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的檢測(cè)。第三十五頁(yè)，共39頁(yè)?；蛐酒瑱z測(cè)流程樣品核酸cDNA文庫(kù)DNA列陣基片基因芯片標(biāo)記的核酸核酸雜交洗滌檢測(cè)提取PCR、標(biāo)記PCR、純化固定第三十六頁(yè)，共39頁(yè)?；蛐酒夹g(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

檢測(cè)芯片：①進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分篩選；②轉(zhuǎn)基因食品品系或品種確定；