植物昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子長度為18-26個核苷酸nt課件

生物芯片檢測細胞中microRNA的表達MicroRNAExpressioninCellsDetectedbyOligonucleotideMicroarray07生技1生物芯片檢測細胞中microRNA的表達MicroRNA1

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子,長度為18-26個核苷酸(nt)的小非編碼RNA，類似于siRNA的分子

。

miRNA通過調節(jié)基因表達,參與調控細胞的眾多生物學功能,如生物發(fā)育、脂肪代謝,及細胞的分化、增殖和凋亡等。它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補,將mRNA剪切或是抑制其翻譯。

人類基因組中已發(fā)現300多種miRNA,而且預測實際數目會更多,它們可能會對人類基因組中近30%的基因發(fā)揮調控作用。但關于miRNA的表達模式、生物學功能、作用機制等,目前的認識還不很清楚。在此,我們設計并制備了miRNA表達譜的寡核苷酸芯片,利用其快速、平行、高通量的檢測特點,分析了6種不同細胞系中206個miRNA的表達水平特點,為miRNA的進一步研究奠定了基礎。

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植21材料和方法1.1材料

實驗所用6種人類腫瘤細胞系均為本實驗室保存,分別HeLa(人宮頸癌上皮細胞)、K562(人慢性髓細胞性白血病細胞)、ES-2(人卵巢透明細胞癌)、MCF-7(人乳腺癌細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)和A549細胞(人肺腺癌細胞)。所有細胞系均在5%CO2條件下,用含有10%胎牛血清的適合培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2miRNA芯片的制備

所用的210個寡核苷酸探針為mirVanaTMmiRNAProbeSet試劑盒(Ambion),其中206個與已知的人類和小鼠miRNA序列互補,4個為陽性對照。3×SSC點樣緩沖液溶解探針至50μmol/L,用SpotArrayTM24基因芯片點樣儀(PerkinElmer)印制于SuperChipTMⅠ(PerkinElmer)玻片表面,制成miRNA寡核苷酸芯片。每次雜交前進行水合、干燥等點樣后處理。1材料和方法1.1材料31.3miRNA的準備、標記與雜交

依m(xù)irVanaTMmiRNAIsolationKit(Ambion)說明書提取腫瘤細胞的富集miRNA。用UniversalMicroplateSpectrophotometer(Bio-tek)紫外分析儀測定miRNA濃度和純度,8mol/L尿素變性的15%聚丙烯酰胺凝膠檢測質量。依m(xù)irVanaTMmiRNALabelingKit(Ambion)說明書對富集miRNA進行熒光標記,方法簡單描述如下:先在miRNA末端添加20-50個經過氨基修飾的核苷酸尾,然后與帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯類(Nhydroxysuccinimidylester,NHS-ester)的熒光染料Cy3(AmershamBiosciences)反應。標記后的樣本與3×miRNAHybridizationBuffer(Ambion)混合并將其均勻鋪于miRNA寡核苷酸芯片表面,小心加蓋玻片封片,置于密封濕潤的雜交倉中,42℃雜交16h。最后進行雜交后清洗。1.3miRNA的準備、標記與雜交41.4芯片圖像的采集與數據處理采用ScanArrayTMExpress1.0(PerkinElmer)掃描儀進行掃描,掃描強度為100%,光電倍增管增益為80%,掃描精度為10μm。掃描所得圖ScanArray3.0(PerkinElmer)軟件進行處理,得到雜交信號和與之相應背景的平均強度值,從雜交信號值中減去背景值得到校正信號強度值。6種細胞檢測所得數據經陽性對照均衡后比較。判斷表達存在差異的標準是:①相互比較的miRNA信號熒光強度值相差至少大于1000;②若其中有信號強度值小于100,則同一種miRNA在不同細胞的熒光值差異需大于500。數據經總體歸一化和對數轉化后,Cluster3.0(StanfordUniversity)進行聚類分析。

1.4芯片圖像的采集與數據處理51.5RT-PCR驗證miRNA分別取6種細胞總RNA各5μg,用與miR-17-5p、miR-21前體互補的特異性引物和逆轉錄酶SuperscriptⅢ(Invitrogen)進行逆轉錄反應,分別取1μL逆轉錄產物進行PCR反應中的miRNA序列設計特異性引物,有關參數見表1。用15%非變性聚丙烯酰胺凝膠驗證擴增產物大小;用LabWorks4.0ImageAcquisitionandAnalysis軟件進行定量及數據處理。取PCR產物連入pGEM-T-easy載體(Promega),送交測序,測序結果與提供的miRNA序列一致。1.5RT-PCR驗證miRNA6植物昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子長度為18-26個核苷酸nt課件72結果2.1miRNA的抽提和純化6種細胞系富集miRNA的D260nm/D280nm值均為1.8～2.1,符合miRNA芯片的檢測要求。2.2芯片雜交結果標記、純化后的miRNA與芯片雜交,用掃描儀在543nm通道處對芯片進行掃描,得到圖像,用Scanarray3.0軟件分析miRNA在6種細胞中的表達水平。經比較發(fā)現,91個miRNA在6種細胞間沒有明顯差異,115個miRNA存在差異。miR-21在6種細胞中校正信號強度/背景強度均大于2倍,表達水平均較高;miR-17-5p和miR-20a在6種細胞中的表達情況相似,在ES-2細胞中校正信號強度/背景強度大于10倍,表達較高;miR-126與miR-128a和miR-151,miR-145與miR-297-1在HeLa和MCF-7細胞中的表達水平類似。見表2。2結果2.1miRNA的抽提和純化8植物昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子長度為18-26個核苷酸nt課件92.3數據聚類分析將掃描得到的雜交后圖像用ScanArray3.0軟件進行處理,所得數據經歸一化和對數轉換后,用Cluster3.0進行聚類分析。結果,MCF-7和HeLa細胞miRNA的表達譜聚為一類。2.4RT-PCR檢測用特異性引物對miR-17-5p、miR-21前體進行擴增,同時以U6作為內參。各細胞中miRNA前體的表達水平經內參校正后,發(fā)現miR-17-5p前體在K562細胞中的表達水平最高,在ES-2細胞中的表達量次之;miR-21在6種腫瘤細胞中的表達水平均較高,與芯片檢測結果基本一致(圖1)。2.3數據聚類分析10圖一圖一113討論

microRNA是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子,它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補,將mRNA剪切或是抑制其翻譯。已很明確,miRNA在調控基因表達過程中發(fā)揮非常重要的作用,而理解miRNA在生物體內如何發(fā)揮作用的關鍵是要知道m(xù)iRNA的表達模式。但是因為miRNA的長度非常短(只有18-26nt),檢測miRNA的方法受到很大的限制。我們利用生物芯片的高通量、高敏感性的特點,為在組織和細胞中檢測多種miRNA提供了理想的手段。

3討論microRNA是一類在線蟲、植物、昆12

實驗中用熒光標記的miRNA直接與miRNA檢測芯片雜交,檢測發(fā)現6種細胞系有各自不同的miRNA表達譜。實驗檢測到miR-21在6種腫瘤細胞中的表達水平均較高,這與文獻報道的miR-21在70%的肺癌和70%的結直腸癌患者中表達上調一致[6]。Iorio等[7]也發(fā)現,miR-21在乳腺癌中表達明顯上調,而且在一定程度上可以顯示腫瘤的惡性程度。miRNA集簇存在是其一個顯著特征,我們檢測到miR-17-5p與miR-20a的表達水平類似,而也有文獻報道m(xù)iR-17-5p與miR-20a及其他4種miRNA成集簇存在于人類第13號染色體上[8]。O'Donnell等[9]通過染色質免疫沉淀實驗,發(fā)現c-Myc可直接與miR-17-5p集簇位點結合,激活其表達,提示這一miRNA的表達可能和腫瘤的發(fā)生存在某種關聯。MCF-7和HeLa分別來源于人類乳腺和宮頸,它們發(fā)育起源類似,共同起源于胚胎內胚層。我們檢測到MCF-7和HeLa細胞miRNA的表達譜聚為一類。提示在哺乳動物體內特殊的miRNA有可能參與維持胚胎早期發(fā)生過程中的多潛能細胞狀態(tài)[10],在器官和組織的發(fā)育、形成中發(fā)揮重要調控作用。實驗中用熒光標記的miRNA直接與miRNA13總RNA中miRNA所占的比例極少(約為0.01%)[11],為了驗證芯片檢測結果是否可以反映miRNA在總RNA中的量,我們用RT-PCR的方法對芯片檢測結果進行了驗證。實驗結果表明微陣列和PCR方法檢測的miRNA的表達基本一致,但也有些差異。用RT-PCR方法檢測到K562細胞中miR-17-5p的高表達,而在微陣列中卻顯示其在K562細胞中表達水平較低。這可能是由于:①K562細胞中的前體miRNA和成熟miRNA表達量都非常高,雖然標記反應沒有對pre-miRNA進行熒光標記,但在雜交過程中大量的pre-miRNA仍可能和相對較少的成熟miRNA競爭,影響了熒光標記的成熟miRNA與探針的結合,掩蓋了K562中miR-17-5p信號;②或是實驗過程中的系統(tǒng)誤差,這種情況在普通的生物芯片技術中也存在。因此,除了要在芯片實驗過程中盡量減少人為干擾,進一步改進實驗技術減少系統(tǒng)誤差外,在對某一miRNA進行深入研究之前,用其他方法確定基因芯片結果是有必要的。本實驗方法具有快速、平行、高通量的特點。通過監(jiān)控細胞miRNA的表達,可以幫助我們更好地了解這類小核酸分子的功能及作用機制。miRNA表達的比較性研究將可能發(fā)現新的診斷性標志分子或治療性靶分子。總RNA中miRNA所占的比例極少(14謝謝觀看！謝謝觀看！15生物芯片檢測細胞中microRNA的表達MicroRNAExpressioninCellsDetectedbyOligonucleotideMicroarray07生技1生物芯片檢測細胞中microRNA的表達MicroRNA16

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子,長度為18-26個核苷酸(nt)的小非編碼RNA，類似于siRNA的分子

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miRNA通過調節(jié)基因表達,參與調控細胞的眾多生物學功能,如生物發(fā)育、脂肪代謝,及細胞的分化、增殖和凋亡等。它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補,將mRNA剪切或是抑制其翻譯。

人類基因組中已發(fā)現300多種miRNA,而且預測實際數目會更多,它們可能會對人類基因組中近30%的基因發(fā)揮調控作用。但關于miRNA的表達模式、生物學功能、作用機制等,目前的認識還不很清楚。在此,我們設計并制備了miRNA表達譜的寡核苷酸芯片,利用其快速、平行、高通量的檢測特點,分析了6種不同細胞系中206個miRNA的表達水平特點,為miRNA的進一步研究奠定了基礎。

microRNA(miRNA)是一類在線蟲、植171材料和方法1.1材料

實驗所用6種人類腫瘤細胞系均為本實驗室保存,分別HeLa(人宮頸癌上皮細胞)、K562(人慢性髓細胞性白血病細胞)、ES-2(人卵巢透明細胞癌)、MCF-7(人乳腺癌細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)和A549細胞(人肺腺癌細胞)。所有細胞系均在5%CO2條件下,用含有10%胎牛血清的適合培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2miRNA芯片的制備

所用的210個寡核苷酸探針為mirVanaTMmiRNAProbeSet試劑盒(Ambion),其中206個與已知的人類和小鼠miRNA序列互補,4個為陽性對照。3×SSC點樣緩沖液溶解探針至50μmol/L,用SpotArrayTM24基因芯片點樣儀(PerkinElmer)印制于SuperChipTMⅠ(PerkinElmer)玻片表面,制成miRNA寡核苷酸芯片。每次雜交前進行水合、干燥等點樣后處理。1材料和方法1.1材料181.3miRNA的準備、標記與雜交

依m(xù)irVanaTMmiRNAIsolationKit(Ambion)說明書提取腫瘤細胞的富集miRNA。用UniversalMicroplateSpectrophotometer(Bio-tek)紫外分析儀測定miRNA濃度和純度,8mol/L尿素變性的15%聚丙烯酰胺凝膠檢測質量。依m(xù)irVanaTMmiRNALabelingKit(Ambion)說明書對富集miRNA進行熒光標記,方法簡單描述如下:先在miRNA末端添加20-50個經過氨基修飾的核苷酸尾,然后與帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯類(Nhydroxysuccinimidylester,NHS-ester)的熒光染料Cy3(AmershamBiosciences)反應。標記后的樣本與3×miRNAHybridizationBuffer(Ambion)混合并將其均勻鋪于miRNA寡核苷酸芯片表面,小心加蓋玻片封片,置于密封濕潤的雜交倉中,42℃雜交16h。最后進行雜交后清洗。1.3miRNA的準備、標記與雜交191.4芯片圖像的采集與數據處理采用ScanArrayTMExpress1.0(PerkinElmer)掃描儀進行掃描,掃描強度為100%,光電倍增管增益為80%,掃描精度為10μm。掃描所得圖ScanArray3.0(PerkinElmer)軟件進行處理,得到雜交信號和與之相應背景的平均強度值,從雜交信號值中減去背景值得到校正信號強度值。6種細胞檢測所得數據經陽性對照均衡后比較。判斷表達存在差異的標準是:①相互比較的miRNA信號熒光強度值相差至少大于1000;②若其中有信號強度值小于100,則同一種miRNA在不同細胞的熒光值差異需大于500。數據經總體歸一化和對數轉化后,Cluster3.0(StanfordUniversity)進行聚類分析。

1.4芯片圖像的采集與數據處理201.5RT-PCR驗證miRNA分別取6種細胞總RNA各5μg,用與miR-17-5p、miR-21前體互補的特異性引物和逆轉錄酶SuperscriptⅢ(Invitrogen)進行逆轉錄反應,分別取1μL逆轉錄產物進行PCR反應中的miRNA序列設計特異性引物,有關參數見表1。用15%非變性聚丙烯酰胺凝膠驗證擴增產物大小;用LabWorks4.0ImageAcquisitionandAnalysis軟件進行定量及數據處理。取PCR產物連入pGEM-T-easy載體(Promega),送交測序,測序結果與提供的miRNA序列一致。1.5RT-PCR驗證miRNA21植物昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子長度為18-26個核苷酸nt課件222結果2.1miRNA的抽提和純化6種細胞系富集miRNA的D260nm/D280nm值均為1.8～2.1,符合miRNA芯片的檢測要求。2.2芯片雜交結果標記、純化后的miRNA與芯片雜交,用掃描儀在543nm通道處對芯片進行掃描,得到圖像,用Scanarray3.0軟件分析miRNA在6種細胞中的表達水平。經比較發(fā)現,91個miRNA在6種細胞間沒有明顯差異,115個miRNA存在差異。miR-21在6種細胞中校正信號強度/背景強度均大于2倍,表達水平均較高;miR-17-5p和miR-20a在6種細胞中的表達情況相似,在ES-2細胞中校正信號強度/背景強度大于10倍,表達較高;miR-126與miR-128a和miR-151,miR-145與miR-297-1在HeLa和MCF-7細胞中的表達水平類似。見表2。2結果2.1miRNA的抽提和純化23植物昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子長度為18-26個核苷酸nt課件242.3數據聚類分析將掃描得到的雜交后圖像用ScanArray3.0軟件進行處理,所得數據經歸一化和對數轉換后,用Cluster3.0進行聚類分析。結果,MCF-7和HeLa細胞miRNA的表達譜聚為一類。2.4RT-PCR檢測用特異性引物對miR-17-5p、miR-21前體進行擴增,同時以U6作為內參。各細胞中miRNA前體的表達水平經內參校正后,發(fā)現miR-17-5p前體在K562細胞中的表達水平最高,在ES-2細胞中的表達量次之;miR-21在6種腫瘤細胞中的表達水平均較高,與芯片檢測結果基本一致(圖1)。2.3數據聚類分析25圖一圖一263討論

microRNA是一類在線蟲、植物、昆蟲和哺乳動物中存在的小RNA分子,它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補,將mRNA剪切或是抑制其翻譯。已很明確,miRNA在調控基因表達過程中發(fā)揮非常重要的作用,而理解miRNA在生物體內如何發(fā)揮作用的關鍵是要知道m(xù)iRNA的表達模式。但是因為miRNA的長度非常短(只有18-26nt),檢測miRNA的方法受到很大的限制。我們利用生物芯片的高通量、高敏感性的特點,為在組織和細胞中檢測多種miRNA提供了理想的手段。

3討論microRNA是一類在線蟲、植物、昆27

實驗中用熒光標記的miRNA直接與miRNA檢測芯片雜交,檢測發(fā)現6種細胞系有各自不同的miRNA表達譜。實驗檢測到miR-21在6種腫瘤細胞中的表達水平均較高,這與文獻報道的miR-21在70%的肺癌和70%的結直腸癌患者中表達上調一致[6]。Iorio等[7]也發(fā)現,miR-21在乳腺癌中表達明顯上調,而且在一定程度上可以顯示腫瘤的惡性程度。miRNA集簇存在是其一個顯著特征,我們檢測到miR-17-5p與miR-20a的表達水平類似,而也有文獻報道m(xù)iR-17-5p與miR-20a及其他4種miRNA成集簇存在于