動物組織基因組的提取課件

實驗一、動物組織基因組DNA提取實驗一動物基因組DNA的提取一、實驗目的學習和掌握從動物組織或細胞中提取核酸的原理和操作技術了解提取DNA的幾種方法，原理和優(yōu)缺點學習測定DNA含量和質量的基本原理及方法二、實驗原理1、核酸的分類DNA(脫氧核糖核酸)

主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質粒DNA。RNA（核糖核酸）

存在于細胞質中，如mRNA,rRNA,tRNA等。

除上述DNA，RNA外，還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。分離純化核酸總的原則：2、核酸制備的一般原則核酸純化應達到的要求：①核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。①應保證核酸一級結構的完整性；②排除其它分子(蛋白，脂類，多糖類)的污染。核酸制備時應注意的事項:

①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學因素對核酸的降解。③減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。

⑤排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時，應去除RNA，反之亦然。降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當然，幾個條件并用更好。對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制劑DNase抑制

①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。

②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。常用的RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制強烈、不徹底

異硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白氧釩核糖核苷復合物有效抑制

RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）有效抑制其它：SDS、尿素、硅藻土等有效抑制作用：1.使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白質變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。3.某些蛋白質變性劑也有抑制RNase活性和破裂細胞的作用。

如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質變性劑3.核酸制備的一般步驟：破碎組織細胞提取純化I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中1）破碎細胞（防止核酸酶的作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。

酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復凍融或液氮凍后組織搗碎。

動物：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。

細胞器DNA：首先純化細胞器。以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑2）破碎抽提核酸除去雜質首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離使核酸與蛋白質分離除去脂類多糖的除去3）核酸的純化

根據所需核酸的性質和特點除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機溶劑等）雜質，最后得到均一的核酸樣品。

4）核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是溫度和介質

溫度：

4℃樣品經常使用-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存,避免反復凍融

保存介質：

滅菌水

TE緩沖溶液(最常用)：

10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0三、動物基因組DNA的提?。?）陰離子去污劑法:

用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質變性,可以直接從生物材料中提取DNA。由于細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,而陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA。三、動物基因組DNA的提?。?）苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA連接鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性質，用乙醇沉淀DNA。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。1）樣品預處理取新鮮動物組織25-50mg（組織量不宜過多，否則容易導致裂解不完全而堵塞離心柱），組織剪碎或者切成小塊，直接放入勻漿器中勻漿。2）加入600μl的LysisBuffer，顛倒充分混勻。如需消化RNA，可加入20μlRNaseA，顛倒混勻，室溫放置5min。3）加入10μlProteinaseK，混勻。56℃水浴45min-1h，其間顛倒混勻數次直到看到組織完全裂解，裂解完全的標準為液體變得清亮及粘稠。（此步驟可以過夜處理）2.操作步驟4）12,000rpm離心10min，將上清轉入新的離心管中，加入800μl無水乙醇，混勻。5）將液體轉入離心柱（一次加不完，可分次轉入），12,000rpm離心1min，棄廢液。6）加入700μlWashbufferA（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心30s-1min，棄廢液。

7）加入700μlWashbufferB（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心30s-1min，棄廢液。稱取肝臟0.5g冰冷的生理鹽水清洗（3次）剪碎5ml生理鹽水勻漿各組取1/10組織細胞液移至1.5ml離心管加600ulLysisBuffer加20ulRNaseA顛倒混勻，放置5min加10ulProteinaseK混勻56℃水浴，45min顛倒混勻數次至液體變清亮及粘稠12000rpm，10min離心取上清轉入新離心管加800ul無水乙醇混勻轉入離心柱可分次轉入12000rpm，1min離心棄廢液，加入700ulWashbufferA12000rpm，1min離心棄廢液，加入700ulWashbufferB12000rpm，1min離心棄廢液，加入500ulWashbufferB12000rpm，1min離心棄廢液12000rpm，2min離心將離心柱置新離心管中，開離心柱蓋，放置5min柱膜中央加100ul65℃預熱的TEbuffer放置3min12000rpm，30sec離心取離心后所得溶液再加入離心柱中，放置2min12000rpm，2min離心收集離心后所得溶液，即為純化后基因組DNA3.注意事項——材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集3.注意事項——細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當的裂解預處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細胞－－蛋白酶K細菌－－溶菌酶破壁高溫溫浴時，定時輕柔振蕩3.注意事項——核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml

100mmol／LNaCl：0.2ml（5MNaCl）25mmol／LED