重組體分子的選擇與鑒定方法及鑒定課件

重組體分子的選擇與鑒定方法及原理

重組體分子的選擇與鑒定方法

我們把外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的目的是獲得帶有目的基因陽性重組體，因而重組體的篩選是體外重組技術(shù)的一個重要環(huán)節(jié)。

涂布菌液，觀察平板是無法判斷重組子是否是我們所需的。因此，我們需要進(jìn)一步進(jìn)行篩選。

常用的篩選方法概括起來有兩大類：①直接篩選法；②間接篩選法。直接篩選法直接篩選法是借助遺傳學(xué)表型來進(jìn)行篩選的方法。重組子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，載體上的一些篩選標(biāo)志基因表達(dá)，會導(dǎo)致宿主的某些表型的改變，通過瓊脂平板中添加相應(yīng)篩選物質(zhì)，可以直接篩選含重組子的菌落。如果質(zhì)粒上有兩種抗性，因為外源基因的插入，導(dǎo)致其中一個不能表達(dá)，那么也可以通過抗藥性將重組子篩選出來。DNA水平RNA水平蛋白質(zhì)水平遺傳表型直接篩選法核酸分子雜交法PCR法DNA序列分析法直接凝膠電泳法酶切片段分析法重組子篩選檢測特定外源基因是否轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄的強度（Northern雜交印跡法)

免疫化學(xué)檢測法（放射性抗體檢測法、免疫沉淀檢測法）Westhern印跡雜交法重組子篩選的方法重點介紹的篩選方法間接選擇法抗藥性篩選a互補快速裂解菌落鑒定分子大小限制性內(nèi)切酶酶切法PCR方法篩選鑒定重組子遺傳表型直接選擇法菌落雜交篩選

遺傳學(xué)表型篩選的方法之一——抗藥性篩選基本原理抗藥性篩選主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選。因為質(zhì)粒DNA攜帶有特定的抗藥性選擇標(biāo)記基因，與目的基因重組后，轉(zhuǎn)入受體菌，能使受體菌帶有相應(yīng)抗藥性，另一種情況是雖然質(zhì)粒中原來有相應(yīng)抗性，但插入外源片段后重組質(zhì)粒失去抗藥性，據(jù)此我們也可以進(jìn)行抗藥性篩選。常用的抗藥性選擇標(biāo)記抗藥性溶解劑慮過除菌貯存溫度貯存濃度終濃度氨芐青霉素（Amp）氯霉素（Cm）

水乙醇

是否

-20℃-20℃50mg/ml34mg/ml50~100μg/ml20~170μg/ml卡那霉素（Ka或Kan）水

是-20℃10mg/ml

50μg/ml四環(huán)素（Tet或Tc）

乙醇

否-20℃12.5mg/ml10μg/ml（液）12.5μg/ml（固）鏈霉素（Sm或Str）

水

是

-20℃20mg/ml25μg/mla類篩選的實驗方法LB固體培養(yǎng)基中加入千分之一的抗性藥物，再倒平板；將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在平板上；放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16小時；觀察菌落生長情況。b類插入失活篩選從原理上講，當(dāng)外源基因(或DNA片段)插入到某一基因內(nèi)的位點后,使這個基因喪失了原有的功能叫插入失活(insertionalinactivation)。插入失活法是從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子（篩選）的主要方法。例如：非重組的pBR322質(zhì)粒DNA上的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因都是正常的,表型為AprTcr。帶有這種質(zhì)粒的受體菌可以在加有四環(huán)素和氨芐青霉素的雙抗性平板上生長。但是,如果在該質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因內(nèi)插入外源片段,就會造成氨芐青霉素抗性基因失活,變成ApsTcr,攜帶這種質(zhì)粒的宿主菌可以在四環(huán)素的平板上生長,而不能在氨芐青霉素抗性平板上生長。B類插入失活篩選步驟注意事項：（1）以Amp、Tc等抗生素作為選擇藥物，37℃培養(yǎng)時間約12~16h，超過時間視為雜菌（假轉(zhuǎn)化子菌落）。（2）挑選單菌落作為轉(zhuǎn)化子以便進(jìn)一步實驗驗證。挑的菌落在LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。遺傳學(xué)表型篩選的方法二—a互補基本原理：這種篩選方法適用于含b-半乳糖苷酶基因的載體。載體在b-半乳糖苷酶的a-肽編碼區(qū)具有多克隆區(qū)域。重組質(zhì)粒中的插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通過顏色篩選鑒別。不帶有插入片段的載體表達(dá)有活力的b-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色體或附加體上缺失掉LacZM15基因，導(dǎo)致內(nèi)源a-肽失活。載體或其他含LacZ基因的a-肽互補細(xì)菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。藍(lán)白斑篩選X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，IPTG

(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)

X-gal被沒分解后的產(chǎn)物為5-溴-4-氯-靛藍(lán)無質(zhì)粒的受體菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無抗菌素抗性無菌斑生長-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物互補，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長載體產(chǎn)物失活，不能互補-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長不能正常生長注意事項：（1）菌液涂布量為90mm平皿50~100

l;（2）由于被轉(zhuǎn)化的基因產(chǎn)物作用于X-gal需要較長時間，因此，觀察和確定轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)時間可適當(dāng)延長。與37℃溫箱取出后放4℃冰箱幾小時后觀察效果更好；（3）為了防止假陽性需挑菌進(jìn)一步驗證；（4）宿主菌的-半乳糖苷酶的-肽編碼區(qū)應(yīng)在染色體或附加體上缺失。此方法直觀快捷，適用于插入片段較大的重組子的篩選。電泳法能篩選出有插入片段的陽性重組體，但不能鑒別插入片段大小相近的非目的基因片段。依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選方法二

——限制性內(nèi)切酶酶切方法鑒定重組子基本原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA的帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切這個片段，電泳后比較電泳結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果。電泳后的圖譜挑三個菌落鑒定，圖顯示的是三個菌落中的質(zhì)粒雙酶切的結(jié)果注意事項：如需檢測插入片段及其方向，使用載體特異引物和方向插入特異引物或互換。如只需確認(rèn)是否存在插入片段，可用2個插入片段特異引物。擴增反應(yīng)前在94℃變性兩分鐘，有利于細(xì)菌的裂解，提高PCR產(chǎn)物擴增的成功。

1．主要原理

用體外標(biāo)記目的基因DNA或相應(yīng)的RNA為探針同轉(zhuǎn)化后的菌落進(jìn)行原位雜交，篩選含重組DNA的克隆。這個方法可以快速地從數(shù)百個菌落中挑選出含有重組DNA的克隆。該方法的優(yōu)點是通用性比較強，可以用來檢測任何一種插入的DNA序列。這種方法依據(jù)的是核酸分子雜交的原理，而不以插入的DNA序列能否實現(xiàn)基因表達(dá)為前提，因此，只要有可利用的標(biāo)記探針就可檢測出重組質(zhì)粒DNA。

重組質(zhì)粒DNA的菌落雜交篩選方法：1硝酸纖維素膜的準(zhǔn)備：將硝酸纖維素膜剪成直徑為8cm的圓形，放人一個干凈的平皿內(nèi)，高壓滅菌，待用。2將無菌的作有標(biāo)記的硝酸纖維素膜鋪在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂糖培養(yǎng)基平皿上，用無菌的L型玻璃棒去除膜與培養(yǎng)基間的氣泡，約1－2min，培養(yǎng)基即可將濾膜浸濕。3用無菌牙簽將轉(zhuǎn)化平皿中選擇的菌落接種到濾膜上，同時接種到另一含有相應(yīng)抗生素的瓊脂糖平皿的對應(yīng)位置，并作為標(biāo)記菌落參照。每個90mm的平皿上大約可接種100個菌落。4將平皿置于37℃培養(yǎng)2－3h，菌落長到1mm時，把濾膜轉(zhuǎn)移到另一塊含有氯霉素（170ug／ml）的瓊脂糖平皿上，菌落面向上，37℃培養(yǎng)15－20h，擴增質(zhì)粒。另一個菌落對照平皿37℃培養(yǎng)過夜后，密封，4℃保存。5把濾膜從平皿中取出，菌落面朝上，置于有一薄層變性液的塑料膜上，變性處理10min，然后用干濾紙吸干變性液；再將菌落面朝上置于有一薄層中和溶液的塑料膜上，中和兩次，每次15min。室溫晾干后，再置于80℃真空干燥1－2h。

6雜交：把濾膜浸入預(yù)雜交液中，在60℃下放置6h；把同位素標(biāo)記的DNA探針于100℃變性后加入雜交溶液中，然后放入濾膜，60℃雜交16－24h。探針的用量一般為105－106cpm/ml。用2×SSC洗脫3次，每次30min。

7放射自顯影：將洗好的濾膜用吸水紙吸干，夾于兩層保鮮膜中，在暗室內(nèi)放進(jìn)暗盒，放好X線片，并于X線片上作好標(biāo)記，置于－70℃冰箱暴光48－72h。8洗片：在暗室內(nèi)取出X線片，進(jìn)行顯影和定影，分析雜交結(jié)果。注意事項：(1)菌落雜交與DNA的吸印轉(zhuǎn)膜雜交與斑點雜交不同，后者一般只有DNA，而菌落雜交時，許多菌體成分與DNA一起形成斑點，即使經(jīng)過固定步驟之后，DNA與膜的結(jié)合很不牢固。因此，菌落雜交與純核酸的雜交最適溫度不同，一般溫度略低一些可防止DNA從膜上脫落。(2)為防止濾膜上菌落脫落或移位，可采用抽吸方法進(jìn)行DNA變性：即將濾膜菌落面向上，置于4層用變性液浸透的Whatman3MM濾紙上，放置5min，然后把濾液放到一合適的抽濾器上，用水泵或負(fù)壓抽至菌落接近于干燥（l－2min）。然后用120ml中和液分4次抽過濾膜，室溫干燥后，80℃真空干燥2h。(3)