細(xì)胞培養(yǎng)工藝介紹課件

提綱為什么要培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)什么樣的細(xì)胞如何培養(yǎng)細(xì)胞及培養(yǎng)過(guò)程的注意事項(xiàng)為什么要培養(yǎng)細(xì)胞－生命科學(xué)的基本研究方法科學(xué)研究需要——細(xì)胞是生物體的最小單位工業(yè)生產(chǎn)的需要——細(xì)胞培養(yǎng)可以獲得我們需要的藥物、原料等單克隆抗體市場(chǎng)快速增長(zhǎng)08年銷售達(dá)167億美元已有近20個(gè)產(chǎn)品超過(guò)150個(gè)在臨床試驗(yàn)階段主要是CHO表達(dá)的，超過(guò)50％培養(yǎng)何種細(xì)胞表達(dá)我們目的蛋白的細(xì)胞——處理過(guò)CHO細(xì)胞基本概念DNA——染色體——遺傳物質(zhì)基因——DNA片斷轉(zhuǎn)錄：DNA——RNA翻譯：RNA——蛋白質(zhì)構(gòu)建表達(dá)特定產(chǎn)物的細(xì)胞株將特定產(chǎn)物的基因引入細(xì)胞中長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)挑選克隆CHO陽(yáng)性克隆將外源基因到入細(xì)胞內(nèi)可選的細(xì)胞構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的方法克隆的挑選表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)常用的表達(dá)體系GS表達(dá)系統(tǒng)DHFR表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體的作用讓細(xì)胞產(chǎn)生抗性同時(shí)表達(dá)目的蛋白二氫葉酸還原酶表達(dá)系統(tǒng)（DHFR）DHFR是合成dATP和dGTP的關(guān)鍵酶常用DHFR-的CHO細(xì)胞不能合成四氫葉酸含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白的表達(dá)水平，使外源基因高效表達(dá)

為什么要挑選克隆穩(wěn)定的種子高效的種子經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的種子克隆就是從一個(gè)細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群細(xì)胞篩選方法－獲得單克隆貼壁培養(yǎng)的克隆形成克隆環(huán)ClonePixFLCellXpress有限稀釋法單克隆形成流式細(xì)胞術(shù)篩選細(xì)胞Re-clonesubclone檢測(cè)手段dot-blotELISASDSWesternFlowCytometryAnalysisdot-blot上清酶連抗體（1步或2步）顯色劑酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）夾心法包被抗體加上清酶聯(lián)抗體顯色讀數(shù)Western基于電泳轉(zhuǎn)膜抗體及酶（同ELISA）染色或發(fā)光FlowCytometryAnalysis抗體與細(xì)胞結(jié)合熒光物質(zhì)連接抗體激光誘發(fā)熒光可檢測(cè)上清或細(xì)胞如何培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)血清、懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的方法含血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)價(jià)格便宜品質(zhì)穩(wěn)定生物污染少減輕下游純化負(fù)擔(dān)貼壁變懸浮貼壁懸浮平面立體無(wú)血清培養(yǎng)基的分類無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)蛋白培養(yǎng)基化學(xué)成分限定型培養(yǎng)基無(wú)血清、無(wú)蛋白、化學(xué)成分限定型培養(yǎng)基無(wú)動(dòng)物源性成分優(yōu)化培養(yǎng)——如何優(yōu)化？細(xì)胞株的選擇培養(yǎng)條件優(yōu)化工藝調(diào)整為什么要優(yōu)化？細(xì)胞株的選擇培養(yǎng)條件優(yōu)化主要是培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的使用方法優(yōu)化考察指標(biāo)——生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)化考察指標(biāo)生長(zhǎng)曲線 表達(dá)水平優(yōu)化效果工藝控制細(xì)胞狀態(tài)的觀察工藝參數(shù)的設(shè)定液體補(bǔ)充的控制發(fā)酵模式批次培養(yǎng)補(bǔ)料－批次培養(yǎng)連續(xù)灌注培養(yǎng)培養(yǎng)放大方瓶搖瓶小罐大罐