關(guān)于生物制藥技術(shù)

第二章關(guān)于生物制藥技術(shù)第一節(jié)生物技術(shù)在制藥工業(yè)中的應(yīng)用

第二節(jié)生物制藥技術(shù)概論第三節(jié)基因工程技術(shù)

第四節(jié)原生質(zhì)體融合技術(shù)第一節(jié)生物技術(shù)在制藥工業(yè)中的應(yīng)用一：酶蛋白抑制劑

二：基因工程藥物

三：動物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá)

四：基因重組疫苗

五：基因治療藥物

現(xiàn)代生物技術(shù)包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程四大類。基因工程藥物又涉及到酶蛋白抑制劑、基因重組疫苗、單克隆抗體、基因治療藥物。一：酶蛋白抑制劑不同的酶抑制劑可用于治療許多不同的疾病。

（1）蛋白酶抑制劑可治療腫瘤、氣腫病。

（2）角鯊烯合成酶抑制劑可降低膽固醇。

（3）3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移（4）酶抑制劑治療高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化。

（5）血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可治療高血壓。

（6）糖苷水解酶抑制劑可治療糖尿病、高脂蛋白血癥、肥胖癥。

（7）磷酯酶抑制劑可治療胰腺炎。二：基因工程藥物基因工程藥物著眼于整個基因組，其方法是讓目的基因在一個體外系統(tǒng)的細(xì)胞中表達(dá)，再經(jīng)過分離純化，來生產(chǎn)藥物。

基因工程有以下分類：1：細(xì)菌基因工程2：哺乳動物細(xì)胞工程3：哺乳動物體內(nèi)生物反應(yīng)器工程4：哺乳動物乳腺反應(yīng)器工程1：細(xì)菌基因工程把目的基因?qū)氲郊?xì)菌中，通過目的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)，來生產(chǎn)藥物。細(xì)菌基因工程的缺點(diǎn)：

（1）由于細(xì)菌是低等生物，有時不能轉(zhuǎn)錄和翻譯所導(dǎo)入的基因，或者所表達(dá)的蛋白質(zhì)缺乏生物活性。

（2）細(xì)菌工程藥物的生產(chǎn)需要一個很大的發(fā)酵車間，其生產(chǎn)成本較高。2：哺乳動物細(xì)胞工程通過培養(yǎng)動物細(xì)胞，將目的基因?qū)氲絼游锛?xì)胞內(nèi)，用來生產(chǎn)動物或人所需要的蛋白質(zhì)藥物。例如：人凝血因子1X就是通過動物細(xì)胞工程生產(chǎn)的。優(yōu)點(diǎn)：藥物對于人體來說具有較大的組織相容性。缺點(diǎn)：（1）動物細(xì)胞培養(yǎng)條件十分苛刻。（2）生產(chǎn)成本較高轉(zhuǎn)基因動物

1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了AV40DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。

Palmiter等人于1982年將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥小?：哺乳動物體內(nèi)生物反應(yīng)器工程這種方法實際上就是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用，將目的基因?qū)氲絼游锏氖芫阎?，與染色體DNA整合，從而形成穩(wěn)定的遺傳性。目前，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥用蛋白有：

（1）抗凝血酶III、 （2）a1-抗胰蛋白酶、

（3）血紅蛋白、 （4）乳鐵蛋白、

（5）磷脂蛋白、 （6）長效tpA、

（7）生長激素。

如美國Genzyme公司培育出的tpA轉(zhuǎn)基因山羊，每知羊奶中tpA的含量最高可達(dá)100克。優(yōu)點(diǎn)-------能夠持續(xù)不斷地獲得轉(zhuǎn)基因藥物。哺乳動物的基因動物克隆技術(shù)4：哺乳動物乳腺反應(yīng)器工程最理想的是將基因?qū)氲讲溉閯游锏娜橄偌?xì)胞，形成哺乳動物乳腺反應(yīng)器，最后從動物的乳腺中獲得基因藥物。

目前，從轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中可以獲得含有

（1）人白蛋白、

（2）乳鐵蛋白、

（3）纖維蛋白源、

（4）抗凝血酶等等基因藥物。

英國羅斯林研究所的轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有a1-抗胰蛋白酶，可用來治療囊性纖維化肺病、肺氣腫。哺乳動物乳乳腺反應(yīng)器器工程優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)（1）通過過乳汁獲得得藥物，能能夠獲得較較高的產(chǎn)量量，同時也也容易提純純。（2）乳腺腺是一個外外分泌器官官，乳汁不不會參與體體內(nèi)循環(huán)，，也不會影影響轉(zhuǎn)基因因動物自身身的生理代代謝過程。。（3）乳汁汁所表達(dá)的的蛋白質(zhì)經(jīng)經(jīng)過修飾加加工之后，，具有穩(wěn)定定的生物活活性。（4）對于于牛、羊這這些大量分分泌乳汁的的動物來說說，動物本本身就相當(dāng)當(dāng)于一座大大型的藥物物工廠。三：動物細(xì)細(xì)胞基因在在植物中的的表達(dá)動物細(xì)胞基基因在植物物中的表達(dá)達(dá)就是植物物生物反應(yīng)應(yīng)器。隨著基因工工程研究技技術(shù)的不斷斷深入，國國外已經(jīng)有有十幾種動動物性的蛋蛋白質(zhì)、多多肽可以在在植物中表表達(dá)。1、植物生生物反應(yīng)器器實例2、動物細(xì)細(xì)胞基因在在植物中的的表達(dá)中的的優(yōu)缺點(diǎn)1、植物生生物反應(yīng)器器實例（1）乙肝病毒表表面抗原（（HBsAg）在植植物中轉(zhuǎn)基基因大腸桿菌熱熱不穩(wěn)定性性腸素菜B亞基（LT-B））在植物中中轉(zhuǎn)基因諾沃克病毒毒外殼蛋白白（Norwalkvirus）在在植物中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因蓋氏13單單克隆抗體體（Guys`13mAb）在植植物中轉(zhuǎn)基基因----預(yù)防齲齲齒谷氨酸脫羧羧酶（GAD）在植植物中轉(zhuǎn)基基因----預(yù)防糖糖尿病粒細(xì)胞巨噬噬細(xì)胞集落落刺激因子子（GM-CSF））在植物中中轉(zhuǎn)基因----預(yù)預(yù)防感染Leu-腦腦啡肽（Leu-Enkephalin）在植植物中轉(zhuǎn)基基因----鎮(zhèn)痛。。1、植物生生物反應(yīng)器器實例（2）水蛭素（Hirudin）在在植物中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因----凝血血酶抑制因因子表皮生長因因子（EGF）在植植物中轉(zhuǎn)基基因----刺激上上皮細(xì)胞分分裂促紅細(xì)胞生生成素（EPO）在在植物中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因----調(diào)節(jié)節(jié)紅細(xì)胞水水平紅鱒生長激激素（Growthhormone）在植物物中轉(zhuǎn)基因因----刺激生長長人血清白蛋蛋白（Humanserumalbumin）在植植物中轉(zhuǎn)基基因人干擾素（（HIFN-a-D）在花椰椰菜花葉病病毒中轉(zhuǎn)基基因----抗病毒毒a-天花粉粉蛋白（a-trichosantin）在煙煙草花葉病病毒中轉(zhuǎn)基基因-----抑制制艾滋病病病毒。1、植物生生物反應(yīng)器器實例（3）血管緊張肽肽轉(zhuǎn)化酶抑抑制劑（ACEI））在煙草花花葉病毒中中轉(zhuǎn)基因----抗抗過敏反應(yīng)應(yīng)流感病毒血血凝素和艾艾滋病毒抗抗原（HIV-1gp120）在煙草草花葉病毒毒中轉(zhuǎn)基因因瘧疾抗原在在煙草花葉葉病毒中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因口蹄疫病毒毒抗原和象象鼻病毒抗抗原（HRV-14）在豇豆豆花葉病毒毒中轉(zhuǎn)基因因水貂腸炎病病毒抗原（（MEV-VP2））在豇豆花花葉病毒中中轉(zhuǎn)基因犬細(xì)小病毒毒抗原（CPV-CP-VP2）在李李痘病毒中中轉(zhuǎn)基因。。2：動物基基因在植物物中的表達(dá)達(dá)中的優(yōu)缺缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）可以以減少純化化過程而大大降低了成成本，（2）通過過植物生物物反應(yīng)器方方式，人們們只須通過過吃水果、、蔬菜等方方式來替代代打針、吃吃藥。（3）將植植物生物反反應(yīng)器與植植物的組織織培養(yǎng)結(jié)合合起來，就就可以在組組織培養(yǎng)車車間生產(chǎn)有有價值的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因藥物物。缺點(diǎn)：外源蛋白質(zhì)質(zhì)在植物中中的表達(dá)水水平還不高高。四：基因重重組疫苗1、基因疫疫苗的生產(chǎn)產(chǎn)方法2、基因疫疫苗的種類類和特征3、基因疫疫苗的優(yōu)缺缺點(diǎn)1990年年9月14日，美國國國立衛(wèi)生生研究院（（NationalInstitutesofHealth,NIH）正正式批準(zhǔn)安安德生（W.F.Anderson）領(lǐng)導(dǎo)導(dǎo)的治療小小組為一位位因腺苷脫脫氨酶（ADA）基基因缺陷而而出現(xiàn)嚴(yán)重綜合性性免疫缺陷陷癥（SCID））的４歲女女孩作基因因治療。安安德生采用用白細(xì)胞培培養(yǎng)，以帶帶正常ADA基因的的病毒感染染白細(xì)胞，，再將白細(xì)細(xì)胞注入體體內(nèi)。到1991年年5月，經(jīng)經(jīng)7次注射射，患兒體體內(nèi)ADA水平達(dá)到到正常人的的25％，，免疫功能能逐漸恢復(fù)復(fù)。1、基因疫疫苗的生產(chǎn)產(chǎn)方法基因疫苗又又稱核酸疫疫苗、也稱稱為裸DNA疫苗，，其方法是是：（1）將編編碼某種搞搞原蛋白的的外源基因因克隆到真真核質(zhì)粒之之中。（2）將將這種質(zhì)質(zhì)粒作為為疫苗注注射到動動物體內(nèi)內(nèi)。（3）質(zhì)質(zhì)粒的DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生生蛋白質(zhì)質(zhì)成為抗抗原，激激活動物物體內(nèi)的的免疫系系統(tǒng)。達(dá)達(dá)到免疫疫的目的的。2、基基因疫苗苗的種類類和特征征目前，基基因疫苗苗在治療療流感病病毒、乙乙型肝炎炎、結(jié)核核病、瘧瘧疾、狂狂犬病、、乳腺癌癌、肺癌癌、前列列腺癌、、艾滋病病、干細(xì)細(xì)胞淋巴巴瘤、腦腦炎病毒毒等等方方面已經(jīng)經(jīng)進(jìn)入研研發(fā)階段段。基因疫苗苗的特征征：（（1）基基因疫苗苗既具有有預(yù)防作作用、又又具有治治療作用用。（（2）既既能激發(fā)發(fā)機(jī)體產(chǎn)產(chǎn)生免疫疫應(yīng)答，，本身又又具有免免疫作用用。3、基因因疫苗的的優(yōu)缺點(diǎn)點(diǎn)基因疫苗苗的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：（1）基基因疫苗苗的抗原原結(jié)構(gòu)接接近天然然構(gòu)象。。（2）抗抗原性強(qiáng)強(qiáng)。（3）生生產(chǎn)成本本低?；蛞呙缑绲娜秉c(diǎn)點(diǎn)：急需解決決的是轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生生物安全全性問題題，必須須保證質(zhì)質(zhì)粒DNA不與與宿主動動物發(fā)生生基因整整合，以以防止后后代發(fā)生生致畸作作用和出出現(xiàn)遺傳傳病。五：基因因治療藥藥物帕金森氏氏病的患患病原因因是由于于大腦喪喪失了產(chǎn)產(chǎn)生多巴巴胺的細(xì)細(xì)胞，其其理想的的替代來來源是人人體的胎胎兒組織織，然而而這種細(xì)細(xì)胞的來來源十分分有限。。為此人們們開始研研究動物物的胎兒兒細(xì)胞。。通過基基因重組組技術(shù)，，克隆牛牛的多巴巴胺生成成細(xì)胞到到大鼠體體內(nèi)，以以期望能能夠大量量生產(chǎn)多多巴胺。。第二節(jié)生生物物制藥技技術(shù)概論論一：從DNA→mRNA→Pr二：細(xì)胞胞破碎技技術(shù)三：提取取技術(shù)四：分離離純化技技術(shù)五：滅菌菌技術(shù)六：干燥燥技術(shù)七：基因因工程原原理一：從DNA→mRNA→Pr1：DNA的半半保留復(fù)復(fù)制2：DNA轉(zhuǎn)錄錄成mRNA3：mRNA逆逆轉(zhuǎn)錄成成DNA4：mRNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯成蛋蛋白質(zhì)5：蛋白白質(zhì)在細(xì)細(xì)胞內(nèi)的的加工和和修飾二：細(xì)胞胞破碎技技術(shù)（一）物物理方法法（二）化化學(xué)方法法（三）新新型技術(shù)術(shù)和方法法（一）物物理方法法1：研磨磨法----細(xì)細(xì)胞在玻玻璃球、、或者鋼鋼球之間間被碾碎碎。2：搗碎碎法----在在韋林氏氏搗碎機(jī)機(jī)中，細(xì)細(xì)胞被徹徹底搗碎碎。3：高壓壓勻漿法法----細(xì)胞胞被強(qiáng)近近性地通通過小孔孔而剪碎碎。4：超聲聲波破碎碎法----利利用超聲聲波的空空穴作用用來破碎碎細(xì)胞。。5：快速速冰凍融融化法----（二）化化學(xué)方法法1：滲透透沖擊法法----在細(xì)細(xì)胞液中中加入2倍量的的純水，，由于滲滲透作用用，細(xì)胞胞外的水水分進(jìn)入入細(xì)胞內(nèi)內(nèi)，導(dǎo)致致細(xì)胞膜膜脹破，，而將內(nèi)內(nèi)含物釋釋放出來來。2：干燥燥處理法法----3：自溶溶法----4：酶處處理法----多采用用溶菌酶酶進(jìn)行處處理。此此外，還還有鏈霉霉菌酶、、白細(xì)胞胞酶C也也可用于于進(jìn)行酶酶處理。。5：表面面活性劑劑增溶溶溶解法----采用洗洗滌劑破破壞細(xì)胞胞壁，使使內(nèi)含物物釋放出出來。常常用的洗洗滌劑有有：（1）十二二烷基苯苯磺酸鈉鈉陰離子子洗滌劑劑，（2）含有有銨鹽、、或者氯氯化十八八烷基三三甲基季季銨鹽的的陽離子子洗滌劑劑，（3）脂肪肪醇聚氧氧乙烯醚醚的非離離子型洗洗滌劑。。6：噬菌菌體作用用法----7：電離離輻射法法----（三）新新型技術(shù)術(shù)和方法法1：激光光破碎法法2：冷凍凍噴射法法3：高速速相向流流撞擊法法三：提取取技術(shù)1：鹽析析法2：有機(jī)機(jī)溶劑分分級沉淀淀法3：等電電點(diǎn)沉淀淀法4：結(jié)晶晶和重結(jié)結(jié)晶法5：酶酶解法6：萃萃取法（（本章節(jié)節(jié)重點(diǎn)講講解）7：透透析法8：吸吸附法9：過過濾技術(shù)術(shù)萃取法（1）液液-液萃萃?。?）化化學(xué)反應(yīng)應(yīng)萃?。?）其其它萃取取技術(shù)（4）雙雙水相萃萃?。?）液液-液萃萃取是利用一一種溶劑劑將生物物產(chǎn)品從從發(fā)酵液液中提取取出來的的過程。。萃取設(shè)備備有離心心萃取器器。（2）化化學(xué)反應(yīng)應(yīng)萃?。ㄉ性谠囋囼炛兄校?5SFT-150超超臨界萃萃取反應(yīng)應(yīng)儀（3）其其它萃取取技術(shù)液膜萃取取反膠團(tuán)萃萃取電場強(qiáng)化化萃取超臨界萃萃取凝膠萃取取所有這樣樣技術(shù)尚尚在實驗驗室階段段，還沒沒有應(yīng)用用于工業(yè)業(yè)生產(chǎn)。。（4）雙雙水相萃萃取由于生物物大分子子在加入入有機(jī)相相之后常常常會失失活，因因此出現(xiàn)現(xiàn)了雙水水相萃取取技術(shù)。。如用聚聚乙二醇醇（PEG）和和葡聚糖糖（Dex），，在水中中可以形形成密度度不同的的二相。。這二相相之間互互相不溶溶混，同同時二相相中的水水溶液均均超過70%。。所以稱稱之為雙雙水相。。能構(gòu)成成雙水相相有還有有聚乙二二醇（PEG））和無機(jī)機(jī)鹽。雙水相萃萃取的回回收率一一般在80-90%之之間，其其特點(diǎn)是是清除細(xì)細(xì)胞碎片片的能力力較強(qiáng)。。另外，，由于聚聚乙二醇醇（PEG）和和葡聚糖糖（Dex）對對蛋白質(zhì)質(zhì)很穩(wěn)定定，即使使在常溫溫下進(jìn)行行操作也也不會導(dǎo)導(dǎo)致蛋白白質(zhì)失活活。四：分離離純化技技術(shù)（一）：：膜分離離技術(shù)（二）：：層析技技術(shù)（三）：：電泳技技術(shù)（一）：：膜分離離技術(shù)1：滲透透法2：反滲滲透法3：超濾濾技術(shù)4：電滲滲析法5：多孔孔陶瓷膜膜分離法法6：滲透透汽化法法3：超濾濾技術(shù)（1）微微濾法，，其濾膜膜的孔徑徑為0.05——2.0um之之間，可可阻留分分子量為為20-100萬的物物質(zhì)，所所需要的的壓力在在0.1Mpa以下，，適用于于細(xì)菌、、微粒的的過濾，，（2）超超濾法，，也稱為為錯流過過濾，其其濾膜的的孔徑為為0.0015—0.20um之間間，可阻阻留分子子量為3-50萬的物物質(zhì)，所所需要的的壓力在在0.1--0.3Mpa，，適用于于大分子子蛋白質(zhì)質(zhì)與小分分子有機(jī)機(jī)物的分分離，（3）納納濾法，，其膜孔孔徑為納納米級細(xì)細(xì)孔，能能截流的的最小分分子為1nm，，截留分分子量為為200—1000。。所需要要的壓力力在1.50Mpa。。可用于于分子量量相差無無幾的氨氨基酸之之間的分分離。（二）：層析析技術(shù)層析技術(shù)用于于目的產(chǎn)品的的高效分離和和純化。根據(jù)層析所使使用的介質(zhì)不不同，可分為為1：無機(jī)基質(zhì)質(zhì)分離介質(zhì)2：有機(jī)高分分子基質(zhì)分離離介質(zhì)。1：無機(jī)基質(zhì)質(zhì)分離介質(zhì)以多孔硅膠、、可控孔徑的的玻璃、氧化化鋯、氧化鋁鋁、羥基磷灰灰石為主要載載體所制成的的球形、或者者無定形顆粒粒。

（1））可控孔徑的的玻璃的化學(xué)學(xué)成份中SiO2，其表表面可以通過過涂層來進(jìn)行行性能上的修修飾。

（2）對于多肽肽藥物的純化化分離，為了了獲得較高的的分離效率。。常常選用孔孔徑在25nm以上的球球形硅膠介質(zhì)質(zhì)。常用的親親水凝膠介質(zhì)質(zhì)，幾乎都是是二醇型化學(xué)學(xué)鍵合硅膠。。

（3）羥羥基磷灰石（（HAP）與與生物體有很很好的相容性性，已經(jīng)用于于蛋白質(zhì)、柱柱子酸的分離離。球形的羥羥基磷灰石產(chǎn)產(chǎn)品有KOBECERAM、HASI，片形的的羥基磷灰石石產(chǎn)品有中科科院生化所生生產(chǎn)的產(chǎn)品。。羥基磷灰石石（HAP））用于生物制制劑分離純化化的例子有：：細(xì)胞蛋白、、病毒和亞細(xì)細(xì)胞顆粒、細(xì)細(xì)菌蛋白、精精蛋白、重組組蛋白、核蛋蛋白、水解酶酶、異構(gòu)酶、、轉(zhuǎn)移酶、氨氨基酸、多肽肽、多糖。無機(jī)基質(zhì)分離離具體方法（1）離子交交換層析，其其介質(zhì)有強(qiáng)陽陽、弱陽、弱弱陰、強(qiáng)陰之之分。（2）親水凝凝膠層析，（3）大孔反反相層析，是是指在無機(jī)基基質(zhì)分離介質(zhì)質(zhì)的表面涂有有烷基介質(zhì)，，其中長鏈烷烷基介質(zhì)涂層層適用于分離離小肽，短鏈鏈烷基介質(zhì)涂涂層適用于分分離多肽及蛋蛋白質(zhì)。（4）疏水作作用層析，用用于分離親水水性強(qiáng)有蛋白白質(zhì)，（5）親和介介質(zhì)層析，針針對不同的生生物大分子需需要采用不同同的特異性親親和介質(zhì)。2：有機(jī)高分分子基質(zhì)分離離介質(zhì)常用的有機(jī)高高分子基質(zhì)分分離介質(zhì)有：：（1）苯乙烯烯—二乙烯苯苯共聚物----屬于交交聯(lián)體性質(zhì)，，常用的有Mono-Q、Mono-S介質(zhì)。。（2）N-乙乙烯吡啶共聚聚物，屬于親親水性凝膠體體性質(zhì)，常用用的有TSK-gel-DEAE-5PW、TSK-gel-SP-5PW、TSK-gel-CM-5PW。（3）聚甲基基丙烯酸酯介介質(zhì)。根據(jù)層析方法法不同，又可可分為：（1）紙層析析（2）薄層層層析（3）離子交交換層析（4）凝膠分分子篩層析（5）親和層層析（3）離子交交換層析目前能夠在工工業(yè)上加以應(yīng)應(yīng)用的離子交交換層析設(shè)備備有瑞典Pharmacia公司生生產(chǎn)的----BioPilot中中試層析系統(tǒng)統(tǒng)，其進(jìn)樣量量可達(dá)10L。全自動BioProcess標(biāo)準(zhǔn)層層析系統(tǒng)，其其流速可達(dá)4-20升/小時。A：離子交換換劑B：離子交換換劑的類別C：離子交換換劑的處理A：離子交換換劑的性質(zhì)離子交換劑是是一種不溶性性的固體物質(zhì)質(zhì)，由二部份份組成：（（1）一部份份是不溶性的的骨架，（（2）另一部部份是通過靜靜電吸引在骨骨架上的離子子。離子部分分可以與溶液液中的同性帶帶電基團(tuán)發(fā)生生交換。離子交換劑的的骨架由不同同的材料所組組成：

（1）硅酸鋁，，

（2）多多糖，

（3）天然的聚聚合物。離子交換劑所所吸附的帶電電基團(tuán)有：（（1）酚基基、羥基、羧羧基、磺酸基基---形成成陽離子交換換劑，

（2）氨基、芳芳香氨基----形成陰陰離子交換劑劑。B：離子交換換劑的類別（1）以聚丙丙乙烯及其衍衍生物為骨架架的離子交換換樹脂----如商品樹脂Dowex（（美國）、Zerolite（英國國）、Amberlite（美國））、上海樹脂脂廠生產(chǎn)的#704、#724、#732、華華北制藥廠生生產(chǎn)的101樹脂。（2）以纖維維素、或者微微晶纖維素作作為骨架的離離子交換樹脂脂---如羧甲基纖維維素（CM-纖維素）、、磷酸基纖維維素（P-纖纖維素）、磺磺乙基纖維素素（SE-纖纖維素）、二二乙氨基纖維維素（DEAE-纖維素素）。（3）以葡聚聚糖凝膠作為為骨架的離子子交換樹脂----如DEAE-Sephadex，DEAE-Sephadex-A-25。（4）以聚丙丙烯酰胺作為為骨架的離子子交換樹脂----（5）以瓊脂脂糖凝膠作為為骨架的離子子交換樹脂----如CM-Sepharose-CL-6B，DEAE-Sepharose-CL-6B。。C：離子交換換劑的處理離子交換劑在在使用之前必必須經(jīng)過前處處理，以除去去雜質(zhì)、并使使得交換劑充充分溶脹。方方法是先將離離子交換劑在在水中充分浸浸泡1—2天天，或者在沸沸水中煮沸4—5小時，，然后用酸、、堿反復(fù)處理理。所用酸堿堿的濃度為0.5mol/L。（（1）陽離子子交換劑經(jīng)過過堿洗→水洗洗→酸洗→水水洗的處理序序。

（2））陰離子交換換劑經(jīng)過酸洗洗→水洗→堿堿洗→水洗的的處理序。離子交換劑在在使用時，要要用起始緩沖沖液充分洗滌滌，以達(dá)到所所要求的離子子濃度和PH值。

（1）陽離子交交換劑應(yīng)采用用陰離子型緩緩沖液，如磷磷酸、乙酸、、檸檬酸等等等酸性緩沖液液，

（2））陰離子交換換劑應(yīng)采用陽陽離子型緩沖沖液，如Tris，胺鹽鹽、吡啶等等等。（4）凝膠分分子篩層析A：凝膠層析析的骨架介質(zhì)質(zhì)B：凝膠層析析介質(zhì)的主要要產(chǎn)品的品牌牌C：根據(jù)不同同洗脫液的凝凝膠層析分類類A：凝膠層析析的骨架介質(zhì)質(zhì)（1）天然多多糖類介質(zhì)（2）纖維素素類介質(zhì)（3）葡聚糖糖類介質(zhì)（4）瓊脂糖糖類介質(zhì)（5）合成大大分子類介質(zhì)質(zhì)B：凝膠層析析介質(zhì)的主要要產(chǎn)品的品牌牌以葡聚糖類介介質(zhì)為骨架的的Sephadex。以以瓊脂糖類類介質(zhì)為骨架架的Sepharose、Bio-GelA。。

以瓊脂糖糖+葡聚糖為為骨架的Superdex。

以葡葡聚糖+聚丙丙烯酰胺為骨骨架的Sephacryl。

以瓊瓊脂糖+聚丙丙烯酰胺為骨骨架的Ultrogel。

以聚羥羥甲基酰胺類類為骨架的Trisacryl。以以聚丙烯酰酰胺為骨架的的Bio-GelP。以以聚苯乙烯烯為骨架的Bio-Beads-S-X。以以聚乙烯醇為為骨架的Toyopearl。C：根據(jù)不同同洗脫液的凝凝膠層析分類類（1）水相淋淋洗凝膠過濾濾層析，簡稱稱凝膠過濾。。是指針對水水溶性的生物物大分子，按按照其分子大大小進(jìn)行分離離的方法。（2）有機(jī)溶溶劑淋洗凝膠膠滲透層析，，簡稱凝膠滲滲透。是指針針對脂溶性的的生物大分子子，按照其分分子大小進(jìn)行行分離的方法法。（5）親和層層析親和層析（AFC）是針針對專一性結(jié)結(jié)合的生物大大分子所進(jìn)行行的分離純化化方法。親和層析常用用的介質(zhì)和載載體有：（（1）葡聚糖糖，

（2））瓊脂糖，（（3）聚丙丙烯酰胺，（（4）交聯(lián)聯(lián)聚苯乙烯，，

（5）交交聯(lián)聚甲基丙丙烯酸酯，（（6）親和和性高聚物。。（三）：電泳泳技術(shù)1：紙電泳2：醋酸纖纖維膜電泳3：凝膠電電泳----淀粉凝膠電電泳，瓊脂糖糖凝膠電泳，，聚丙烯酰胺胺凝膠電泳。。

4：聚焦焦電泳----密度梯度度電泳，等電電點(diǎn)聚焦電泳泳，親和電泳泳。根據(jù)電泳的操操作方式不同同，可將電泳泳分為：1：園盤電泳泳，

2：平平板電泳，3：連續(xù)凝凝膠電泳，4：連續(xù)流流動電泳。五：滅菌技術(shù)術(shù)1：干熱滅菌菌法

2：濕濕熱滅菌法3：紫外線線滅菌法4：過濾滅菌菌法

5：化化學(xué)滅菌法六：干燥技術(shù)術(shù)1：烘干法（（1）噴霧霧干燥

（2）氣流干燥燥

（3）沸沸騰干燥（（4）鼓式干干燥2：真空干燥燥法3：冷凍干燥燥法第三節(jié)：基因因工程技術(shù)基因克隆操作作，就是將外外源性的DNA分子結(jié)合合到病毒、質(zhì)質(zhì)粒、或者其其它載體系統(tǒng)統(tǒng)這中。組成成新的遺傳物物質(zhì)，然后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)繁繁殖。人們已經(jīng)成功功地將人或者者動物的某些些基因，如胰胰島素基因、、生長激素基基因、胸腺激激素基因、干干擾素基因、、乙型肝炎病病毒抗原基因因、口蹄疫病病毒抗原基因因?qū)氲酱竽c腸桿菌之中。。如將將人人的的生生長長激激素素基基因因?qū)?dǎo)入入到到大大腸腸桿桿菌菌之之中中，，在在9升升的的細(xì)細(xì)菌菌培培養(yǎng)養(yǎng)液液中中，，所所能能提提取取出出的的生生長長激激素素產(chǎn)產(chǎn)量量=從從50萬萬頭頭羊羊腦腦中中提提取取的的數(shù)數(shù)量量。。一：：基基因因工工程程的的四四個個技技術(shù)術(shù)基基礎(chǔ)礎(chǔ)二：：基基因因工工程程的的步步驟驟基因因重重組組技技術(shù)術(shù)圖圖示示一：：基基因因工工程程的的四四個個技技術(shù)術(shù)基基礎(chǔ)礎(chǔ)1：：發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了了限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切酶酶----能能夠夠識識別別DNA分分子子的的某某些些特特異異性性位位置置，，將將DNA雙雙鏈鏈切切成成帶帶有有粘粘性性末末端端的的片片段段。。2：：發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了了DNA連連接接酶酶----能能夠夠?qū)鄶嗔蚜训牡腄NA修修復(fù)復(fù)，，連連接接成成完完整整的的DNA分分子子。。3：：發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了了運(yùn)運(yùn)載載外外源源性性目目的的基基因因的的載載體體。。4：：發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了了導(dǎo)導(dǎo)入入外外源源基基因因的的手手段段。。二：：基基因因工工程程的的步步驟驟（一一））：：工工程程載載體體的的構(gòu)構(gòu)建建----質(zhì)質(zhì)粒粒、、科科斯斯質(zhì)質(zhì)粒粒、、噬噬菌菌體體λ、、單單鏈鏈?zhǔn)墒删w體M13。。（二二））：：DNA分分子子的的重重組組（三三））：：基基因因的的分分離離（四四））：：重重組組體體的的選選擇擇和和鑒鑒定定（五五））：：重重組組DNA的的表表達(dá)達(dá)（一一））：工工程程載載體體的的構(gòu)構(gòu)建建1、、基基因因工工程程載載體體的的定定義義2、、基基因因工工程程載載體體有有四四種種質(zhì)粒?？扑顾官|(zhì)質(zhì)粒粒噬菌菌體體λ單鏈鏈?zhǔn)墒删w體M13酵母菌人人工染色色體1、基因因工程載載體的定定義能夠克隆隆外源性性DNA，并能能使其在在大腸桿桿菌中繁繁殖的載載體稱為為基因工工程載體體。基因工程程載體的的共同特特點(diǎn)是：：

（1）能在在大腸桿桿菌中自自主復(fù)制制，接上上外源DNA后后還能夠夠自我復(fù)復(fù)制。（（2））很容易易從細(xì)菌菌核酸中中分離出出來。2、質(zhì)粒粒（1）質(zhì)質(zhì)粒的特特性（2）常常用的質(zhì)質(zhì)粒（3）質(zhì)質(zhì)粒pBV220的結(jié)結(jié)構(gòu)（4）質(zhì)質(zhì)粒的分分離和提提純（5）質(zhì)質(zhì)粒上的的克隆方方法（1）質(zhì)質(zhì)粒的特特性質(zhì)粒是染染色體外外的遺傳傳物質(zhì)，，它們是是雙鏈、、閉環(huán)的的DNA分子，，質(zhì)粒的的分子量量較小，，質(zhì)粒的復(fù)復(fù)制不依依賴于染染色體DNA，，用氯霉霉素阻止止細(xì)胞染染色體DNA的的蛋白質(zhì)質(zhì)合成途途徑后，，細(xì)胞染染色體的的復(fù)制也也受到抑抑制，但但是，質(zhì)質(zhì)粒仍能能繼續(xù)復(fù)復(fù)制。質(zhì)粒上帶帶有抗藥藥性選擇擇標(biāo)記。。質(zhì)粒上帶帶有幾種種限制性性內(nèi)切酶酶的切斷斷點(diǎn)位。。外源基因因的插入入不會破破壞質(zhì)粒粒的復(fù)制制特性。。（2）常常用的質(zhì)質(zhì)粒pBV220pBR322pBG-2pMK16pCYC184科斯質(zhì)粒粒噬菌體λλ單鏈?zhǔn)删wM13酵母菌人人工染色色體質(zhì)粒PBR322質(zhì)粒PGBKT7-53質(zhì)粒PGEM-3Z質(zhì)粒PUC18/19科斯質(zhì)粒粒l噬菌體基因組酵母菌人人工染色色體（3）質(zhì)質(zhì)粒pBV220的結(jié)結(jié)構(gòu)ori-------復(fù)制起起始點(diǎn)clts857-------抑抑制子基基因，在在31℃時，其基基因產(chǎn)物物具有阻阻抑PL的活性，，當(dāng)溫度度升高時時，這種種阻抑活活性就喪喪失，PL就開始指指導(dǎo)合成成mRNA。PR-------啟動子子1PL--------啟動動子2BglII--------限制制酶切割割位點(diǎn)EcoRI---------限限制酶切切割位點(diǎn)點(diǎn)

SmaI----------限制酶酶切割位位點(diǎn)BamHI--------限制酶酶切割位位點(diǎn)SalI---------限制酶酶切割位位點(diǎn)PstI------------限制酶酶切割位位點(diǎn)HindIII---------限制酶酶切割位位點(diǎn)，以以上切割割位點(diǎn)形形成多克克隆區(qū)域域，可在在此插入入外源性性目的基基因。RrnB-----------核糖體體終止基基因（終終止子））

PvuI-----------帶有有青霉素素抗性基基因Ampr。（4）質(zhì)質(zhì)粒的分分離和提提純A：質(zhì)粒粒的分離離和提純純的定義義B：質(zhì)粒粒的分離離和提純純的基本本步驟C：質(zhì)粒粒的分離離和提純純的方法法A：質(zhì)粒的分分離和提提純的定定義質(zhì)粒提純純就是指指大量的的染色體體DNA中分離離和純化化質(zhì)粒DNA。。由于染色色體DNA的分分子量要要比質(zhì)粒粒DNA大得多多，染色色體DNA提取取后多數(shù)數(shù)已經(jīng)斷斷裂成線線性分子子，而質(zhì)質(zhì)粒DNA則呈呈閉環(huán)型型，因因此可以以實現(xiàn)分分離和提提純，B：質(zhì)粒粒的分離離和提純純的基本本步驟細(xì)菌培養(yǎng)養(yǎng)和質(zhì)粒粒擴(kuò)增收集和裂裂解細(xì)菌菌質(zhì)粒提純純C：質(zhì)粒粒的分離離和提純純的方法法（a）差差示離心心沉淀法法（b）DNA變變性處理理法（c）氯氯化銫梯梯度密度度離心法法。（a）差差示離心心沉淀法法染色體DNA多多數(shù)是纏纏繞在細(xì)細(xì)胞溶菌菌物的殘殘渣之中中，密度度較大，，可以采采用離心心法除去去。（b）DNA變變性處理理法采用熱變變性、或或者用溫溫和的堿堿（PH=12.5））變性，，可以斷斷開染色色體DNA上的的氫鍵、、而質(zhì)粒粒上的共共價鍵則則不能斷斷開，當(dāng)當(dāng)溫度逐逐漸冷卻卻進(jìn)行復(fù)復(fù)性操作作時，染染色體DNA成成線性分分子，而而質(zhì)粒DNA則則呈閉環(huán)環(huán)型，可可以實現(xiàn)現(xiàn)分離。。（c）氯氯化銫梯梯度密度度離心法法在DNA中加入入足夠數(shù)數(shù)量的嵌嵌入染料料溴乙錠錠，染色色體DNA分子子結(jié)合得得多、相相對密度度較大，，而質(zhì)粒粒DNA則結(jié)合合得很少少、相對對密度較較小，經(jīng)經(jīng)過平衡衡等密度度離心之之后，二二類DNA分子子處于不不同的色色帶區(qū)內(nèi)內(nèi)，可實實現(xiàn)分離離。（5）質(zhì)質(zhì)粒上的的克隆方方法先將質(zhì)粒粒DNA用限制制酶切開開，在體體外連接接外源性性DNA，再將將重組后后的工程程質(zhì)粒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化到細(xì)細(xì)胞之中中。質(zhì)粒粒上的克克隆方法法有3種種：A、插入入失活法法B、定向向克隆法法C、磷酸酸酯酶處處理線型型質(zhì)粒DNA法法A：插入入失活法法（a）插入失活活藍(lán)白斑斑篩選技技術(shù)根據(jù)插入入失活原原理，篩篩選重組組子。由由于外源源基因的的插入，，導(dǎo)致LacZ失去活性性，菌落落顯白色色，而未未插入重重組子的的菌落顯顯藍(lán)色。。（b）抗抗藥性基基因插入失失活原原理質(zhì)粒同同時含含有二二個抗抗藥性性基因因，一一個為為青霉霉素抗抗性基基因，，另一一個為為四環(huán)環(huán)素抗抗性基基因。。插入入外源源性DNA會導(dǎo)導(dǎo)致質(zhì)質(zhì)粒四四環(huán)素素抗性性基因因失活活。先將重重組質(zhì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化到到對青青霉素素敏感感的大大腸桿桿菌之之中，，并在在培養(yǎng)養(yǎng)基中中加入入青霉霉素，，結(jié)果果沒有有被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的的親本本菌株株死亡亡，存存活的的是轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化菌菌株。。在存活活的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化菌菌株中中，同同時含含有：：（1）重重組質(zhì)質(zhì)粒、、（2）不不含重重組DNA的自自體環(huán)環(huán)化質(zhì)質(zhì)粒。。再將轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化菌菌株接接種到到含四四環(huán)素素的培培養(yǎng)基基中----自自體環(huán)環(huán)化質(zhì)質(zhì)粒在在四環(huán)環(huán)素培培養(yǎng)基基上能能夠正正常生生長----重重組質(zhì)質(zhì)粒在在四環(huán)環(huán)素培培養(yǎng)基基上則則不能能生長長（達(dá)達(dá)不到到預(yù)期期目的的）（c））抗藥藥性基基因插插入失失活的的改進(jìn)進(jìn)方法法（由于于最終終需要要的重重組質(zhì)質(zhì)粒在在四環(huán)環(huán)素培培養(yǎng)基基上則則不能能生長長，因因此無無法直直接選選擇出出重組組工程程菌））在含四四環(huán)素素的培培養(yǎng)基基中再再加入入一種種親脂脂的螯螯合劑劑萎蔫蔫酸（（5-丁基基吡啶啶-2-甲甲酸、、fusaricacid）或或者喹喹啉-2-羧酸酸。將轉(zhuǎn)化化菌株株接種種到改改良后后的四四環(huán)素素的培培養(yǎng)基基上。。凡是是能夠夠正常常生長長的菌菌株---90%以以上是是重組組工程程菌。。B、定定向克克隆法法將載體體質(zhì)粒粒pBR322同時時用二二種限限制酶酶BamHI、、HindIII進(jìn)進(jìn)行消消化內(nèi)內(nèi)切，，形成成二個個不同同粘性性末端端的接接頭。。用凝凝膠電電泳法法分離離其中中的大大片段段。將外源源性DNA也用用二種種限制制酶BamHI、HindIII進(jìn)行行消化化內(nèi)切切，形形成二二個不不同粘粘性末末端的的接頭頭。質(zhì)粒+外源源性DNA----由于于粘性性末端端互補(bǔ)補(bǔ)而形形成連連接。。質(zhì)粒本本身由由于二二個不不同粘粘性末末端的的接頭頭不能能互補(bǔ)補(bǔ)，無無法進(jìn)進(jìn)行環(huán)環(huán)化。。結(jié)果果所得得到的的DNA都都是重重組型型。C、磷磷酸酯酯酶處處理線線型質(zhì)質(zhì)粒DNA法在DNA片片段進(jìn)進(jìn)行連連接時時，二二個核核苷酸酸之間間必須須是：：（1）一一個帶帶有5`-磷酸酸基、、（2）另另一個個帶有有3`-羥羥基。。如果果用堿堿性磷磷酸酯酯酶、、或者者用小小牛腸腸道磷磷酸脂脂酶處處理已已經(jīng)經(jīng)經(jīng)過內(nèi)內(nèi)切的的質(zhì)粒粒DNA，，就可可以除除去5`-磷酸酸基。。因此此，在在復(fù)性性時就就能阻阻止質(zhì)質(zhì)粒DNA的環(huán)環(huán)化。。而外源源性DNA由于于帶有有5`-磷磷酸基基，仍仍然能能夠結(jié)結(jié)合到到質(zhì)粒粒DNA上上，形形成帶帶有二二個-OH缺口口的開開環(huán)分分子（（內(nèi)環(huán)環(huán)一端端HO-OH缺缺口、、外環(huán)環(huán)另一一端HO-OH缺口口）。。最后后得到到DNA重重組型型。（二））：DNA分子子的重重組1、粘粘性末末端連連接法法2、同同聚物物接尾尾法3、人人工合合成接接頭法法4、人人工接接頭+平平齊齊末端端的DNA鏈（三））：基基因的的分離離（1））物理理學(xué)密密度梯梯度離離心法法（2））凝膠膠電泳泳分離離技術(shù)術(shù)（3））互補(bǔ)補(bǔ)DNA分分離法法（c-DNA法））（4））鳥槍槍法（1））物理理學(xué)密密度梯梯度離離心法法不同DNA片段段，其其密度度不同同，借借此進(jìn)進(jìn)行密密度梯梯度離離心，，實現(xiàn)現(xiàn)分離離。（2））凝膠膠電泳泳分離離技術(shù)術(shù)通過凝凝膠電電泳，，分段段收集集大小小不同同的DNA片段段，然后用用快速速轉(zhuǎn)化化法來來檢驗驗其目目的蛋蛋白質(zhì)質(zhì)，進(jìn)進(jìn)行基基因定定位。。實現(xiàn)現(xiàn)分離離。（3））互補(bǔ)補(bǔ)DNA分分離法法（c-DNA法））第一步步、雙鏈cDNA的的制作作第二步步、線線性質(zhì)質(zhì)粒DNA的制制作第三步步、雙雙鏈cDNA和和線性性質(zhì)粒粒DNA鏈鏈的拼拼接第一步步、雙鏈cDNA的的制作作mRNA↓↓逆逆轉(zhuǎn)錄錄酶cDNA第一一鏈互互補(bǔ)鏈鏈↓↓堿水水解除除去mRNA模模板cDNA第一一鏈（（3`-端端帶有有發(fā)夾夾環(huán)））↓↓逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶酶、或或者用用大腸腸桿菌菌聚合合酶I從從cDNA第一一鏈3`-端的的發(fā)夾夾環(huán)開開始合合成cDNA第第二鏈鏈↓↓SI核酸酸酶降降解發(fā)發(fā)夾環(huán)環(huán)得得到雙雙鏈cDNA↓↓雙雙鏈鏈cDNA--（同同聚物物接尾尾法））---加加上人人工接接頭CCCCCCmRNA的的分離離Oligo-dT纖纖維素素柱Oligo-dT磁磁珠法法mRNAmRNA-cDNAHybridnick逆轉(zhuǎn)錄錄酶RNaseHDNA聚合合酶T4連連接酶酶T4DNA聚聚合酶酶處理理形成成平頭頭末端端NickTranslationcDNA的的合成成方法法之1逆轉(zhuǎn)錄錄酶末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶酶dCTPRNAaseHDNA聚合合酶cDNA的的合成成方法法之2第二步步、線線性質(zhì)質(zhì)粒DNA的制制作質(zhì)粒PstI（（雙環(huán)環(huán)型））↓↓限制制酶線線性性質(zhì)粒粒PstI—DNA鏈↓↓末末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶酶在在線性性質(zhì)粒粒DNA鏈鏈上加加上GGGGGGGG第三步步、雙雙鏈cDNA和和線性性質(zhì)粒粒DNA鏈鏈的拼拼接雙鏈cDNACCCCCC+線性性質(zhì)粒粒DNA上上GGGGGGG↓↓退退火、、復(fù)性性cDNA——重組組質(zhì)粒?！D(zhuǎn)轉(zhuǎn)化到到細(xì)菌菌中進(jìn)進(jìn)行大大量擴(kuò)擴(kuò)增↓↓特特定的的限制制酶形形成成特定定位點(diǎn)點(diǎn)內(nèi)切切的雙雙鏈cDNA，，帶有有粘性性末端端?！M(jìn)進(jìn)行行其它它類型型的DNA二次次重組組。（4））鳥槍槍法A：鳥鳥槍法法的具具體步步驟B：鳥鳥槍法法的優(yōu)優(yōu)缺點(diǎn)點(diǎn)A：鳥鳥槍法法的具具體步步驟先將供供體細(xì)細(xì)胞的的染色色體DNA，經(jīng)經(jīng)過酶酶處理理、或或者物物理學(xué)學(xué)方法法切割割成基基因水水平的的很多多片段段?！龑⒚棵恳黄魏秃洼d體體進(jìn)行行重組組。↓↓轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化到受受體菌菌中進(jìn)進(jìn)行基基因增增殖。。↓↓采采用適適當(dāng)?shù)牡暮Y選選方法法，從從眾多多的菌菌落中中選出出帶有有目的的基因因的菌菌株。?！龔膹倪x擇擇出的的菌株株中回回收重重組DNAB：鳥槍槍法的的優(yōu)缺缺點(diǎn)鳥槍法法的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)----采采用鳥鳥槍射射擊去去命中中“預(yù)預(yù)定目目標(biāo)””的原原理，，該方方法能能夠繞繞過直直接分分離目目的基基因的的難關(guān)關(guān)。鳥槍法法的難難點(diǎn)----必必須有有一種種有效效的目目的基基因檢檢測方方法，，常用用mRNA作為為探針針，進(jìn)進(jìn)行原原位雜雜交法法檢驗驗。（四））：重重組體體的選選擇和和鑒定定（1）遺傳學(xué)學(xué)方法（2）免疫學(xué)方法（3）原位雜雜交法（4）原位放放射免疫法（5）聚合酶酶連鎖反應(yīng)（（PCR法））選擇克隆株株（6）蛋白質(zhì)質(zhì)轉(zhuǎn)譯表達(dá)法法（1）遺傳學(xué)學(xué)方法類似于細(xì)菌抗抗生素抗性培培養(yǎng)試驗----如果所需要的的基因為抗藥藥性基因，就就可以從受體體細(xì)胞是否從從對藥物敏感感的不抗藥狀狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭箍顾帬顟B(tài)，來來判斷它是否否獲得了抗藥藥性基因。（2）免疫學(xué)學(xué)方法當(dāng)受體細(xì)胞獲獲得了某一基基因之后，常常常在細(xì)胞中中出現(xiàn)由該基基因編碼的蛋蛋白質(zhì)，因此此可以通過免免疫的方法制制備出針對這這種蛋白質(zhì)的的抗體，然后后將這種抗體體用熒光染料料進(jìn)行標(biāo)記。。當(dāng)用這種熒光光抗體處理細(xì)細(xì)胞克隆株時時，含有這一一基因的克隆隆株，由于其其蛋白質(zhì)能與與抗體進(jìn)行特特異性結(jié)合而而顯出熒光。。這樣就可以以把含有這種種目的基因的的克隆株篩選選出來。（3）原位雜雜交法A：原位雜交交法的定義B：原位雜交法的的步驟A：原位雜交交法的定義使用帶P標(biāo)記記的特異性RNA、DNA，作為探探針，就可以以在原位鑒定定含有這個基基因的菌落或或者噬菌斑，，這種方法稱稱為原位雜交交法。B：原位雜交法的的步驟將細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到硝化纖纖維素濾膜上上，

↓用用堿處理濾膜膜上的菌落，，使質(zhì)粒DNA變性，↓↓

待DNA固定在濾濾膜上之后，，洗去細(xì)胞碎碎屑，

↓用用P標(biāo)記的的RNA探針針、或者DNA探針進(jìn)行行連接酶反應(yīng)應(yīng)。

↓洗洗去多余的P標(biāo)記的RNA探針↓↓

通過放射射自顯影，找找出與探針雜雜交的菌落↓↓

陽性菌菌落中就含有有重組的目的的基因。原位雜雜交的的圖示示（4））原位位放射射免疫疫法A：原原位放放射免免疫法法的原原理B：原原位放放射免免疫法法的顯顯色試試劑C：原原位放放射免免疫法法的步步驟A：原原位放放射免免疫法法的原原理原位雜雜交法法+蛋蛋白質(zhì)質(zhì)抗原原抗體體反應(yīng)應(yīng)----原位位放射射免疫疫法B：原原位放放射免免疫法法的顯顯色試試劑堿性磷磷酸酶酶----將無無色的的底物物5-溴-4-氯吲吲哚磷磷酸鹽鹽（BCIP））轉(zhuǎn)化化為藍(lán)藍(lán)色的的產(chǎn)物物。辣根過過氧化化物酶酶----將3-氨氨基-9-乙基基咔唑唑氧化化成褐褐色產(chǎn)產(chǎn)物或或?qū)?-氯氯萘酚酚氧化化成藍(lán)藍(lán)色產(chǎn)產(chǎn)物。。I125標(biāo)記的的二抗抗----放射射自顯顯影檢檢測。。熒光素素異硫硫氰酸酸鹽標(biāo)標(biāo)記的的二抗抗----紫外外燈。。金標(biāo)記記的二二抗----金金顆粒粒包裹裹，可可以表表現(xiàn)紅紅色。。生物素素結(jié)合合的二二抗----與與凝集集素緊緊密結(jié)結(jié)合，，酶的的顯色色反應(yīng)應(yīng)進(jìn)行行檢測測。C：原原位放放射免免疫法法的步步驟對于已已知的的基因因產(chǎn)物物（蛋蛋白質(zhì)質(zhì)）↓↓提提純純，注注射到到家兔兔體內(nèi)內(nèi)，制制備免免疫血血清（（抗體體）↓↓提提取取特異異性抗抗體IgG↓↓IgG通過過碘化化作用用，標(biāo)標(biāo)記上上I↓↓將將轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的的細(xì)菌菌涂布布于培培養(yǎng)皿皿中↓↓堿堿處處理，，使細(xì)細(xì)菌裂裂解，，菌落落釋放放出抗抗原，，↓↓加加入經(jīng)經(jīng)過標(biāo)標(biāo)記的的特異異性抗抗體IgG，抗抗原、、抗體體發(fā)生生免疫疫反應(yīng)應(yīng)?！ㄍㄟ^過放射射自顯顯影檢檢測出出來↓↓陽陽性性菌落落中就就含有有重組組的目目的基基因。。（5））聚合合酶連連鎖反反應(yīng)（（PCR法法）選選擇克克隆株株樣品DNA+復(fù)復(fù)制所所需要要的引引物核核苷酸酸短鏈鏈（大大約2-個個核苷苷酸左左右））+DNA聚合合酶+大量量的三三磷酸酸脫氧氧核苷苷酸dATP、、dTTP、、dGTP、dCTP↓混混合加加熱，，使得得DNA雙雙鏈分分開（（這一一過程程稱為為DNA變變性））↓↓冷冷卻，，（DNA復(fù)性性），，引物核核苷酸酸短鏈鏈分別別附在在2條條單鏈鏈DNA的的兩端端，聚聚合酶酶就會會從引引物開開始，，沿著著DNA單單鏈進(jìn)進(jìn)行復(fù)復(fù)制式式的DNA合成成?！诘诙未位旌虾霞訜釤?，使使得DNA雙鏈鏈分開開。↓↓第第二二次冷冷卻，，合成成第二二批次次的DNA?！缛绱舜朔磸?fù)復(fù)加溫溫+冷冷卻。?？芍刂貜?fù)無無數(shù)次次。只只要聚聚合酶酶的功功能正正常+有足足夠的的三磷酸酸脫氧氧核苷苷酸dATP、、dTTP、、dGTP、dCTP。就就可以以大量量復(fù)制制出與與樣品品DNA一一樣的的DNA分分子。。差異展展示PCR法（（DD-PCR)基本原原理：：將具具有兩兩組細(xì)細(xì)胞在在某一一條件件下可可表達(dá)達(dá)的mRNA群群體體通過過逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄方方法變變成相相應(yīng)的的cDNA群群體，，以此此為模模板，，利用用一對對特殊殊引物物，在在一定定條件件下進(jìn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增增，得得到與與mRNA相對對應(yīng)的的DNA。。通過過變性性聚丙丙烯酰酰胺電電泳，，檢測測差異異條帶帶。（6））蛋白白質(zhì)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯表表達(dá)法法----cDNA克克隆中中帶有有特異異性的的mRNA互補(bǔ)補(bǔ)的順順序，，提取取細(xì)胞胞mRNA。----用用堿處處理待待篩選選的菌菌落使使細(xì)胞胞變性性，DNA固定定在濾濾膜上上?！齧RNA與已已經(jīng)固固定的的DNA進(jìn)進(jìn)行雜雜交，，形成成RNA-DNA復(fù)復(fù)合體體↓↓提提取RNA-DNA復(fù)合合體，，加熱熱處理理，使使其釋釋放出出mRNA↓↓將將mRNA進(jìn)行行轉(zhuǎn)譯譯：（（1）在在無細(xì)細(xì)胞蛋蛋白質(zhì)質(zhì)合成成系統(tǒng)統(tǒng)中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯-----兔網(wǎng)網(wǎng)狀細(xì)細(xì)胞溶溶解產(chǎn)產(chǎn)物、、小麥麥胚抽抽提物物（商商品名名BRL、、NEN））（（2））在非非洲爪爪蛙的的卵母母細(xì)胞胞中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯↓↓轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯譯產(chǎn)物物進(jìn)行行蛋白白質(zhì)屬屬性鑒鑒定：：采用用方法法：（（1）免免疫沉沉淀法法（（2））SDS-聚丙丙烯酰酰胺凝凝膠電電泳法法?！钭罱K終定位位出相相應(yīng)的的重組組工程程菌DNA。（五））：重重組DNA的表表達(dá)---真核核基因因在大大腸桿桿菌中中的表表達(dá)1、表表達(dá)條條件2、表表達(dá)細(xì)細(xì)則3、表表達(dá)方方式1、表表達(dá)條條件（（1））（1））重組組基因因中必必須具具有一一個能能夠被被大腸腸桿菌菌RNA聚聚合酶酶（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶酶）識識別的的啟動動子。。大大腸桿桿菌原原核基基因的的起始始密碼碼子為為AUG。。真真核基基因的的起始始密碼碼子為為ATG，，ATG不不能被被大腸腸桿菌菌RNA聚聚合酶酶識別別。（2））重組組DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄出出的mRNA，，必須須有一一個核核糖體體結(jié)合合位點(diǎn)點(diǎn)，大大腸腸桿菌菌自身身DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄出出的mRNA，，在其其核糖糖體結(jié)結(jié)合位位點(diǎn)上上有一一個轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯起起始密密碼子子（AUG）+SD序序列，，SD序列列與大大腸桿桿菌的的16S-rRNA的3`端端堿基基實現(xiàn)現(xiàn)互補(bǔ)補(bǔ)。（3））真核核基因因重組組到大大腸桿桿菌之之后，，真核核基因因DNA不不能被被細(xì)菌菌基因因的內(nèi)內(nèi)含子子分割割成二二段，，因為為在大大腸桿桿菌原原核細(xì)細(xì)胞中中缺乏乏蛋白白質(zhì)拼拼接系系統(tǒng)。。1、表表達(dá)條條件（（2））（4））真核核基因因必須須位于于大腸腸桿菌菌啟動動子下下游的的有效效控制制區(qū)域域內(nèi)，，以便便使得得RNA聚聚合酶酶在識識別啟啟動子子之后后，立立即開開始蛋蛋白質(zhì)質(zhì)的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯。。（5））真核核基因因所產(chǎn)產(chǎn)生的的mRNA必須須相當(dāng)當(dāng)穩(wěn)定定，并并且能能夠被被大腸腸桿菌菌的核核糖體體所轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)譯。。（6））真真核核基基因因所所表表達(dá)達(dá)出出的的異異種種蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)，，不不會會被被細(xì)細(xì)胞胞蛋蛋白白酶酶所所降降解解。。2、、表達(dá)達(dá)細(xì)細(xì)則則（1））使使用用強(qiáng)強(qiáng)啟啟動動子子（2））調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)適適當(dāng)當(dāng)?shù)牡谋肀磉_(dá)達(dá)溫溫度度（3））使使用用表表達(dá)達(dá)誘誘導(dǎo)導(dǎo)劑劑3、、表表達(dá)達(dá)方方式式（1））融融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式（2））非非融融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式（3））分分泌泌蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式（1））融融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式A：：融融合合蛋蛋白白的的定定義義B：：融融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式的的優(yōu)優(yōu)缺缺點(diǎn)點(diǎn)C：：融融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式的的改改進(jìn)進(jìn)措措施施D：：融融合合蛋蛋白白的的具具體體表表達(dá)達(dá)方方式式A：：融融合合蛋蛋白白的的定定義義融合合蛋蛋白白的的氨氨基基酸酸端端由由大大腸腸桿桿菌菌原原核核基基因因編編碼碼、、而而另另一一端端（（羧羧基基端端））則則由由真真核核基基因因編編碼碼。。最終終表表達(dá)達(dá)出出來來的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)=1條條原原核核多多肽肽+1條條真真核核多多肽肽，，因因此此稱稱為為融融合合蛋蛋白白。。B：：融融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式的的優(yōu)優(yōu)缺缺點(diǎn)點(diǎn)融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式的的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)----基基因因操操作作簡簡便便、、蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)在在細(xì)細(xì)菌菌體體內(nèi)內(nèi)較較為為穩(wěn)穩(wěn)定定，，不不會會被被細(xì)細(xì)菌菌酶酶所所降降解解，，容容易易實實現(xiàn)現(xiàn)高高效效表表達(dá)達(dá)。。融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式的的缺缺點(diǎn)點(diǎn)----由由于于融融合合蛋蛋白白中中含含有有原原核核多多肽肽，，帶帶有有細(xì)細(xì)菌菌蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的抗抗原原性性，，不不能能直直接接用用作作人人體體注注射射劑劑。。C：：融融合合蛋蛋白白表表達(dá)達(dá)方方式式的的改改進(jìn)進(jìn)措措施施（1））在在體體外外，，采采用用特特異異的的蛋蛋白白酶酶（（凝凝血血因因子子X、、膠膠原原酶酶、、腸腸激激肽肽酶酶））對對融融合合蛋蛋白白進(jìn)進(jìn)行行降降解解。。（2））用用化化學(xué)學(xué)物物質(zhì)質(zhì)（（CNBr））進(jìn)進(jìn)行行蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)水水解解，，形形成成原原核核多多肽肽+真真核核蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)分分子子，，從從而而獲獲得得具具有有生生物物活活性性的的天天然然真真核核蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)分分子子。。D：：融融合合蛋蛋白白的的具具體體表表達(dá)達(dá)方方式式融合合基基因因------融融合合蛋蛋白白基因因結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)為為““原原核核啟啟動動子子——原原核核SD序序列列——原原核核結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)基基因因片片段段——真真核核結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)基基因因序序列列——原原核核終終止止密密碼碼子子””關(guān)鍵鍵：：受體體蛋蛋白白與與外外源源蛋蛋白白的的閱閱讀讀框框要要對對齊齊兩個個蛋蛋白白的的結(jié)結(jié)合合位位點(diǎn)點(diǎn)的的設(shè)設(shè)計計很很重重要要，，應(yīng)應(yīng)便便于于下下一一步步切切除除受受體體蛋蛋白白的的操操作作。。融合合表表達(dá)達(dá)載載體體的的構(gòu)構(gòu)建建常用用的的受受體體蛋蛋白白（（原原核核細(xì)細(xì)菌菌表表達(dá)達(dá)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)））受體體蛋蛋白白的的切切除除方方法法化學(xué)斷裂裂法：溴溴化氰（（CNBr）--Met--AA酶促斷裂裂法：凝凝血因子子Xa，，有蛋白白酶活性性，識別別序列:Ile－－Glu－Gly－Arg－－AA（2）非非融合蛋蛋白表達(dá)達(dá)方式A：非融融合蛋白白表達(dá)方方式的定定義B：非融融合蛋白白表達(dá)方方式的優(yōu)優(yōu)缺點(diǎn)C：非融融合蛋白白的具體體表達(dá)方方式A：非融融合蛋白白表達(dá)方方式的定定義非融合蛋蛋白表達(dá)達(dá)方式是是指蛋白白質(zhì)的表表達(dá)是以以真核mRNA的起始始密碼子子開始，，其結(jié)果果使得蛋蛋白質(zhì)產(chǎn)產(chǎn)物的氨氨基酸端端不帶任任何細(xì)菌菌性的多多肽序列列。非融合蛋蛋白表達(dá)達(dá)方式也也稱為包涵體型型外源蛋蛋白的表表達(dá)。大大腸桿菌菌能積累累某些特特殊生物物大分子子，使之之致密的的聚集在在細(xì)胞內(nèi)內(nèi)，形成成一種水水不溶性性的結(jié)構(gòu)構(gòu)。當(dāng)外外源蛋白白大量表表達(dá)時，，這些非非天然的的蛋白質(zhì)質(zhì)往往容容易形成成包涵體體。B：非融融合蛋白白表達(dá)方方式的優(yōu)優(yōu)缺點(diǎn)非融合蛋蛋白表達(dá)達(dá)方式的的優(yōu)點(diǎn)----能夠產(chǎn)產(chǎn)生天然然的真核核蛋白質(zhì)質(zhì)。產(chǎn)物物容易回回收，包包涵體的的密度大大于細(xì)胞胞碎片，，破碎細(xì)細(xì)胞后離離心即可可獲得外外源蛋白白。非融合蛋蛋白表達(dá)達(dá)方式的的缺點(diǎn)----蛋白質(zhì)質(zhì)在細(xì)菌菌體內(nèi)容容易被細(xì)細(xì)菌蛋白白酶所破破壞。產(chǎn)產(chǎn)物喪失失生物活活性，需需要經(jīng)過過復(fù)性，，即使蛋蛋白質(zhì)重重新折疊疊。C：非融融合蛋白白的具體體表達(dá)方方式非融合蛋蛋白表達(dá)達(dá)方式可可分為2種：（a）非非融合基基因—非非融合蛋蛋白（b）融融合基因因—非融融合蛋白白（a）非非融合基基因—非非融合蛋蛋白基因結(jié)構(gòu)構(gòu)為“原原核啟動動子—原原核SD序列——ATG—真核核結(jié)構(gòu)基基因序列列—原核核終止密密碼子””要求1：：SD序序列和ATG之之間的距距離要合合適，相相差2-3個堿堿基，其其表達(dá)效效率就大大受影響響。要求2：：ATG和真真核結(jié)構(gòu)構(gòu)基因序序列之間間必須加加接人工工接頭，，以保證證ATG之后的的真核基基因不發(fā)發(fā)生通讀讀框架的的改變。。（b）融融合基因因—非融融合蛋白白基因結(jié)構(gòu)構(gòu)為“原原核啟動動子—原原核SD序列——原核ATG——TGATG（真真核基因因起始結(jié)結(jié)構(gòu)）—真核結(jié)結(jié)構(gòu)基因