斑點(diǎn)雜交課件

分子雜交技術(shù)分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本中是否含有特定的生物分子的一門技術(shù)。樣品制備電泳雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)果顯示探針制備分子雜交原理及流程圖一.分子雜交種類

1.按其分子種類劃分

1）DNA雜交—探針為DNA或RNA

2）RNA雜交—探針為DNA或cDNA3）蛋白質(zhì)免疫分析—探針為抗體2.按樣品制備過程劃分1）原位雜交(insituhybridization)i.原位菌落雜交ii.原位噬菌斑雜交iii.原位細(xì)胞雜交iv.原位組織塊雜交原位裂解細(xì)胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品，可同時(shí)處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測(cè)某類細(xì)胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。2）斑點(diǎn)雜交(dothybridization)先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點(diǎn)在固體基質(zhì)上進(jìn)行雜交，不能測(cè)定分子量大小。一.分子雜交種類

1)DNA和RNA的雜交制備DNA或RNA樣品→與固定基質(zhì)結(jié)合→80℃真空固定→預(yù)雜交→加入標(biāo)記探針雜交→洗滌→放射自顯影或顯色反應(yīng)。

2）蛋白質(zhì)的免疫分析制備蛋白質(zhì)樣品→與固定基質(zhì)結(jié)合→常溫空氣中固定→封閉劑封閉→一抗反應(yīng)→洗滌→二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)→洗滌→顯色反應(yīng)（EIA）或→一抗放射標(biāo)記物→洗滌→放射自顯影（RIA）二、分子雜交的一般程序1.固定基質(zhì)的種類與特性1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulosefilter,NCF)可與三類大分子的結(jié)合，其機(jī)理不清楚，可能為被動(dòng)吸附。NCF不能結(jié)合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（<20,000）優(yōu)點(diǎn)：i.用于DNA，RNA雜交分析時(shí)結(jié)果可靠，靈敏，本底低。ii.用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要預(yù)激活；易于操作缺點(diǎn)：結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)使用探針次數(shù)有限（2-3次）2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙最大特點(diǎn)是能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價(jià)結(jié)合，可用不同探針進(jìn)行多次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時(shí)最好用放射性標(biāo)記物。這類基質(zhì)對(duì)生物大分子是主動(dòng)吸附。

三、雜交樣品膜的制備

3)尼龍膜i.陽(yáng)離子尼龍膜

i)容量大,蛋白質(zhì)可結(jié)合480μg/cm2ii)可結(jié)合不同大小的DNA，RNA和蛋白質(zhì)。iii)韌性好iv)可用于電轉(zhuǎn)移v)可進(jìn)行反復(fù)多次雜交試驗(yàn)vi)廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒*不能用于蛋白質(zhì)的直接染色。ii.尼龍66廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時(shí)陽(yáng)離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時(shí)陰離子狀態(tài)，電轉(zhuǎn)移時(shí)要注意。

4）離子膜

i.DEAE-纖維素紙ii.CM-纖維素紙三、雜交樣品膜的制備2.固定基質(zhì)的選擇依據(jù)

1）強(qiáng)度，耐久性，操作簡(jiǎn)便2）高信噪比（低本底高信號(hào)）3）生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性4）重現(xiàn)性好三、雜交樣品膜的制備i)細(xì)胞培養(yǎng)（高密度，幾百—十萬個(gè)菌落或低密度，幾百個(gè)以下）ii)細(xì)菌細(xì)胞原位裂解與DNA變性ii.原位噬菌斑雜交樣品膜i)細(xì)胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板）ii)噬菌體轉(zhuǎn)移—用NCF作影印iii)DNA變性與固定（與上同）

ii.毛細(xì)管法(Capillaryblottingmethod)Southern印跡v.各種轉(zhuǎn)移方法的比較i)擴(kuò)散法和毛細(xì)管法：操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴(kuò)散法為70%，毛細(xì)管法80%）耗時(shí)多。ii)電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。iii)真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。vi.轉(zhuǎn)移的最佳條件i)固定基質(zhì)的選擇ii)轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的SDS。iii)大分子的轉(zhuǎn)移

對(duì)于分子量較大的DNA片段，必須進(jìn)行原位斷裂后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最佳長(zhǎng)度為1-2kb。其步驟是：0.25MHCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）→水洗→0.5MNaOH/1MNaCl兩次，每次15分鐘→轉(zhuǎn)移。

對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一：解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS。四.標(biāo)記探針的制備

1.標(biāo)記化合物的種類

1）放射性同位素標(biāo)記物125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標(biāo)記；32P，3H，35S 用于核酸標(biāo)記，其中32P和35S使用頻率高。32P標(biāo)記核苷酸的α位或γ位，35S則是標(biāo)記核苷酸的α位.2)非放射性標(biāo)記物

i.生物素分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白—抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白可結(jié)合4個(gè)生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，可大大提高其靈敏度。生物素可以經(jīng)過化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合形成標(biāo)記化合物。

ii.半抗原包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測(cè)上述標(biāo)記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。iii.蛋白質(zhì)檢測(cè)標(biāo)記物i)酶偶聯(lián)二抗（0.05ng）ii)蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）?？勺饔糜诖蠖鄶?shù)哺乳動(dòng)物的IgG，靈敏度較低（5ng）iii)免疫金（immunogold）0.1-0.5ng3)兩類標(biāo)記化合物的比較i.靈敏度i)檢測(cè)蛋白質(zhì)，兩種方法差不多。ii)檢測(cè)核酸，放射法比酶法敏感。ii.穩(wěn)定性酶法探針可在4℃保存一年，放射性標(biāo)記需每次制備。iii.安全性非放射性標(biāo)記安全。iv.效率非放射性標(biāo)記所需時(shí)間短。2.標(biāo)記探針的制備

1）鏈標(biāo)記法i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.隨機(jī)DNA引物延伸法

ds-DNA→ss-DNA-(6n,t)→Klenow片段+dNTP(32P)iii.反轉(zhuǎn)錄法mRNA+dNTP(32P)→cDNA（標(biāo)記）iv.轉(zhuǎn)錄法含有待標(biāo)記DNA片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P)→→RNA（標(biāo)記）SP6聚合酶v.引物延伸法含待標(biāo)記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)→待標(biāo)記DNA鏈切口移位法（NickTranslation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口處按5’→3’方向切除單核苷酸；同時(shí)DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口處3’端加入底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸，并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP隨機(jī)引物標(biāo)記探針5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP變性-復(fù)姓

1.核酸雜交與結(jié)果檢測(cè)1）預(yù)雜交：預(yù)雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標(biāo)記探針是cDNA或RNA，預(yù)雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合,42℃4-6h或過夜。2）雜交：探針100℃變性，迅速冷卻，加入預(yù)雜交液中，42℃一天五.分子雜交與結(jié)果檢測(cè)3）洗滌：2×SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計(jì)算：T=4GC+2AT

*高強(qiáng)度與低強(qiáng)度雜交：若具高度特異性同源序列，采用高強(qiáng)度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強(qiáng)度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液的離子強(qiáng)度以及雜交和洗滌時(shí)的溫度。2.蛋白質(zhì)的免疫分析封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。雜交結(jié)果示意圖六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化探針的選擇在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針或RNA探針長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交探針的標(biāo)記方法選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定；但還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等

一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化雜交率現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進(jìn)行在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度（復(fù)雜度）和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對(duì)靶序列雜交的情形t1/2=ln2/kct1/2半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時(shí)間（s）k=形成雜交體的速率常數(shù)[mol/(Lxntxs)]決定于探針長(zhǎng)度（L）、探針復(fù)雜度（N）、溫度、離子強(qiáng)度、粘度和pHc=溶液中的探針濃度（mol/L）六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化雜交最適溫度——雜交技術(shù)最重要的因素之一反應(yīng)溫度低于Tm10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱最適復(fù)性溫度（Optimunmrenaturationtemperature,TOR）：Tor=Tm–25℃苛刻復(fù)性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)非苛刻復(fù)性溫度：Tns=Tm–(30或35℃)可以通過使用高濃度鹽溶液（如6.2mol/lNaCl），或使用某些有機(jī)溶劑的水溶液降低反應(yīng)溫度現(xiàn)在認(rèn)為，適當(dāng)選擇甲酰胺和鹽水濃度及合適的反應(yīng)溫度，可使DNA復(fù)性和DNA-RNA雜交獲得高特異性和更快的反應(yīng)速度。六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化雜交的嚴(yán)格性影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體Tm值25℃時(shí)雜交最佳通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性在實(shí)際應(yīng)用中，寡核苷酸探針的最佳雜交溫度必須精確確定。最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶DNA和非特異靶DNA（如魚精或大腸桿菌DNA）的膜。在不同溫度下使膜與探針雜交，特異靶序列結(jié)合探針信號(hào)很強(qiáng)，而非特異靶序列與探針無任何反應(yīng)的溫度就是最適溫度六、核酸分