真菌學實驗報告

..v真菌學實驗報告一.實驗目的：1.1了解真菌形態(tài)的基本特征。1.2掌握絲狀真菌制片方法。1.3掌握內(nèi)生真菌的分離方法1.4掌握真菌的鑒定方法。二.前言：真菌廣泛分布于地球表面,從高山、湖泊到田野、森林，從海洋、高空到赤道、兩極，到處都有真菌。真菌雖然不在空氣中生長繁殖，但它的孢子卻成群的漂浮在天空，只要稍微注意你會發(fā)現(xiàn)人類原來生活在真菌的汪洋大海中。當今世界，生物技術(shù)已邁入世界經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)，真菌學在生物技術(shù)的大潮中得到了長足的發(fā)展。真菌是原始的真核生物，具有廣泛的多樣性，真菌生長我繁殖迅速，在很短的時間內(nèi)就可以得到比動物和植物多得多的后代，能夠直接、快速地進行遺傳性狀分離的分析。因此，真菌可以作為研究基礎(chǔ)生物學過程中的一個重要工具，真菌基因的多樣性以及真菌分子生物學的發(fā)展，為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)提供了一個廣闊的天地。植物的生長環(huán)境直接影響內(nèi)生真菌的生物多樣性，植物物種的年代越久遠，其生物內(nèi)生真菌的多樣性越豐富：抗病原性能越強的植物，其所含的內(nèi)生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的內(nèi)生真菌有可能產(chǎn)生與植物相同或相似的抗菌無知或產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)可能參與了藥用植物的抗菌過程，本實驗通過植物病原真菌和G+、G-細菌的抑制實驗發(fā)現(xiàn)莖，根，花，種子或果實內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物具有不同程度的抑菌能力，并且對G+、G-有普片遍的抑菌作用。研究和開發(fā)內(nèi)生真菌的尋找新的抗菌活性物質(zhì)具有廣泛的應用前景。三.材料與方法：3.1.1材料：在校園內(nèi)采集銀杏、喜樹、桂花樹樣品包括葉、莖、根、花、種子或果實。3.1.2.藥品與試劑：葡萄糖、蛋白胨、KH2P04·3H2O、MgSO4·7H2O，馬鈴薯、瓊脂。孟加拉紅，青霉素，鏈霉素，甲基藍，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸鹽，葡萄糖，瓊脂條，無菌水等。消毒劑：75%的乙醇，0.1%升汞（HgCl2），次氯酸鈉溶液（含活性氯10%），30%雙氧水。雙蒸水、瓊脂糖，Tris飽和酚、巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)，石英砂，Tris飽和酚，氯仿，異戊醇，無水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化鈉，鹽酸，氫氧化鈉，EDTA，CTAB。3.1.3.培養(yǎng)基：3.1.3.1馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基馬鈴薯汁1000ml，葡萄糖20g，瓊脂20g

（注：取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，瓊脂15克，溶化后分裝，15磅滅菌30分鐘3.1.3.2察氏瓊脂培養(yǎng)基蔗糖30g，NaNO33g，MgSO4.7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4.7H2O0.01g，K2HPO41g，瓊脂13g，蒸餾水1000ml，自然pH3.1.3.3沙氏培養(yǎng)基蛋白胨1g，葡萄糖或麥芽糖4g，瓊脂1.5克，水100ml。制法：1將上述物質(zhì)稱好，放入水中煮沸溶解（不必調(diào)PH即有5左右）分中號試管（約4毫升）包扎，高壓115℃20分鐘。趁熱斜好，凝固備用。3.1.3.4馬丁氏培養(yǎng)基葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4?7H2O0.5g，1%孟加拉紅3.3mL，瓊脂20g，水1000mL，pH值自然。抗生素用法與用量：培養(yǎng)基滅菌之后分裝前按鏈霉素40U/mL，青霉素30U/mL用量加入，冷卻到45℃左右未凝固時加入抗生素，混勻倒平板。四.方法：4.1.1采樣方法：在校園內(nèi)找到銀杏、喜樹、桂花樹并用刀采集葉、莖、根、皮、種子。4.1.2樣品前處理：分別取根、莖、葉、果實，用洗滌劑在自來水下洗凈。老樹皮用75%酒精進行表面消毒后，用鑷子取出，于酒精燈上燒灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固體培養(yǎng)基上。對于根、莖、葉、果實按下列程序進行表面消毒：75%的酒精漂（浸）洗2-3min→無菌水沖洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒時間（見表2-2，共設(shè)置7個梯度）→無菌水沖洗4-6次→用滅菌濾紙吸干多余水分→無菌刀片將材料切成小塊將根、莖的表皮、韌皮部、木質(zhì)部大致分開，并切成0.5×0.5cm2大小。將果實的外種皮去掉，消毒之后將內(nèi)種皮去掉。滅菌時，瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯中，記好時間，倒入消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前1-2分鐘，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時為止。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。4.1.3內(nèi)生菌的分離方法：將上述組織塊置于分離培養(yǎng)基上（每一平皿培養(yǎng)5塊組織塊）于27℃恒溫培養(yǎng)，同時將上述消毒過程中最后一次沖洗組織塊后的無菌水滴在培養(yǎng)基上平行培養(yǎng)，用以檢測消毒是否徹底。觀察菌絲生長情況及污染情況。4.1.4純化方法：培養(yǎng)3-4天后及時采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌絲或菌落移種到新鮮PDA培養(yǎng)基上。純化3-4次以保證所得菌落為純培養(yǎng)。4.2形態(tài)鑒定方法：4.2.1培養(yǎng)方法：4.2.1.1培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。4.2.1.2將4℃保存菌種活化2次；4.2.1.3將活化菌種分別點種PDA、沙氏、察氏平板，每重復4.2.1.425℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天；4.2.1.5然后進行菌落特征描述，取一個平行進行制片（膠帶子粘片法），觀察個體形態(tài)；4.2.1.6另兩個平行繼續(xù)培養(yǎng)至14天，取出；4.2.1.7重復步驟4，作為最終描述結(jié)果；4.2.1.8根據(jù)真菌分類鑒定手冊和相關(guān)資料分析確該菌的歸屬。4.2.2制片方法：膠帶粘貼法：選用在顯微鏡油鏡下觀察細致不粗糙且粘性好的膠帶。取一小段膠帶從菌落表面的中心向邊緣粘，75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉藍染色液染色，將粘有菌絲的一面向上，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征。4.2.3鑒定標準：觀察的要點：4.2.4菌落宏觀形態(tài)：大?。阂跃涞闹睆剑╩m）表示。顏色：包括菌落表面和背面的顏色，及色素是否滲入培養(yǎng)基。菌落表面的紋飾：如皺紋、輻射溝紋、同心環(huán)、整個菌落致密或疏松等。菌落的質(zhì)地：氈狀、毯狀、絨毛狀、棉絮狀、粉粒狀、革質(zhì)狀、有無成束狀或繩狀的氣生菌絲。菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分狀況等。菌落邊緣：全緣、鋸齒狀、樹枝狀等。滲出物：菌落表面有無液滴及液滴的顏色等。4.2.5個體形態(tài)：菌絲的特征：表面性狀（粗糙或光滑），寬度等分生孢子梗：分支情況--簡單或復雜，輪生或單生等；長短；基部粗糙或光滑等。產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征：形狀，大小，著生狀況（位置，單生、互生或成輪生體）分生孢子的形態(tài)：形狀，大小，表面狀況，聚集方式（直鏈、斜鏈或聚集成頭）4.3分子生物學鑒定：4.3.1培養(yǎng)方法：培養(yǎng)基成分與不加瓊脂的PDA固體培養(yǎng)基成分相同。將液體培養(yǎng)基以100mL每瓶分裝至250mL三角瓶中，用8層紗布封口。121℃，蒸汽滅菌20min。將菌絲致密的真菌接種到液體培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中27℃、120rpm培養(yǎng)5-7天。用兩層滅菌紗布過濾菌絲球，用無菌蒸餾水沖洗菌絲球5次，避免培養(yǎng)基中的糖類和蛋白對DNA提取的影響。40℃下烘干菌絲，但是不要過于干燥，然后進行DNA的提取。4.3.2基因組DNA的提取DNA提取采用CTAB法。CTAB（cetyltriethylammoniumbromide，十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度時，從溶液中沉淀，通過離心可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。CTAB法的好處是能很好地去掉糖類雜質(zhì)，提取前期可得到高含量的DNA。4.3.2.1用CTAB法提取材料DNA的具體步驟如下：將CTABbuffer在65℃水浴鍋中預熱，研缽用液氮預冷；4.3.2.2取0.1g左右菌絲體，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入5mL預熱的提取液及10μLβ-巰基乙醇，混合均勻后把混合液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中700μL/管；4.3.2.3于65℃水浴保溫0.5-1h，時間不能超過1.5h。保溫期間要輕輕振搖幾次；4.3.2.4冷卻至室溫后，加入等體積(700μL)的飽和酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，充分混勻后靜置10min。4.3.2.5離心(12000rpm，10min，室溫)，去沉淀，將上清液轉(zhuǎn)入干凈離心管中。4.3.2.6根據(jù)雜質(zhì)的去除情況重復步驟4、5數(shù)次，直至無雜質(zhì)；4.3.2.7加入等體積氯仿：異戊醇(24：1)抽提一次以去除飽和酚，離心(12000rpm，10min，室溫)；4.3.2.8將上清液逐滴加入兩倍體積的-20℃預冷無水乙醇，以沉淀出DNA。室溫放置10-20min，可以過夜；4.3.2.9挑取或離心去上清液(10000rpm，5min)的方法取出DNA；用75%乙醇洗滌兩次；<10>37℃保溫箱中干燥后溶于適量的TE緩沖液中4℃?zhèn)溆谩?.4所用引物ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC4.4.1PCR反應條件：4.4.1.1體系：PCR反應體系為50μL體系，包括：10×PCRbuffer： 1/10MgCl2： 1.5mM，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）： 各200μM，Primer1 0.2μM，Primer2 0.2μM，Taq酶： 1~2.5U，DNA模板： 約100ng。4.4.2條件：擴增條件預變性95℃5min變性95℃1min復性51℃1min30~35個循環(huán)延伸72℃1min延伸補齊72℃10min4.4.3測序方法：送測序公司。4.4.4序例分析：五．結(jié)果及分析：結(jié)果：試驗分離到兩種真菌5.1八爪金盤分離到菌種查氏正反照5.1.1菌落宏觀形態(tài)：大?。壕涞闹睆?.2（mm）。顏色：包括菌落表面棕黑色背面灰色，色素滲入培養(yǎng)基。菌落表面的紋飾：如皺紋、整個菌落致密。菌落的質(zhì)地：氈狀菌落的高度：凸起或隆起。菌落邊緣：鋸齒狀。滲出物：菌落表面無液滴。5.1.2個體形態(tài)：菌絲的特征：表面粗糙。分生孢子梗：分支復雜，輪生。5.1.3分子生物學鑒定通過PCR擴增和序列分析，送公司檢測得到的序列為：TGAAGTTAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTGACCCCGGTCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCATCGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAATCGGAGGAA通過blast序列分析得到的結(jié)果為：Distributionof100BlastHitsontheQuerySequenceSequencesproducingsignificantalignments：5.2桂花樹莖分離到PDA正反照鏡檢：5.2.1菌落形態(tài)：大小：菌落的直徑22mm。顏色：菌落表面的顏色為棕黃色背面為黃色。菌落表面的紋飾：有皺紋、同心環(huán)、整個菌落致密。菌落的質(zhì)地：革質(zhì)狀。菌落的高度：扁平。菌落邊緣：全緣。滲出物：菌落表面無液體。5.2.2個體形態(tài)：菌絲的特征：表面光滑分生孢子梗：分支復雜，輪生，較短，基部粗糙。六分析：6.1試驗中我們發(fā)現(xiàn),同種菌種在不同的培養(yǎng)基上面呈現(xiàn)出不同的菌落形態(tài)特征，如菌落形態(tài)大小、顏色、紋飾、質(zhì)地、高度、邊緣、有無滲出物及其滲出物的顏色等。6.2試驗中我們對各種材料進行了菌種分離，用了三種培養(yǎng)基，但由于操作原因和設(shè)備原因，試驗中有很多培養(yǎng)基都被污染了。七實驗總結(jié)：7.1植物的生長環(huán)境直接影響內(nèi)生真菌的生物多樣性，不同植株的內(nèi)