中藥指紋圖譜3

中藥指紋圖譜盛習(xí)鋒

第一章中藥指紋圖譜技術(shù)與中藥質(zhì)量控制

1.1指紋圖譜的起源與發(fā)展

現(xiàn)代指紋鑒定始于19世紀(jì)末20世紀(jì)初的范罪學(xué)和法醫(yī)學(xué)。每個(gè)人的指紋在微小的細(xì)節(jié)構(gòu)造上各有不同，可以據(jù)以鑒別每個(gè)人的特征。指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于植物藥質(zhì)量控制，是從20世紀(jì)70年代，色譜技術(shù)的發(fā)展，人們大量采用薄層色譜（TLC）方法，將植物中化學(xué)成分展載于由各種擔(dān)體鋪成的薄層板上。根據(jù)薄層板上的斑點(diǎn)的位置、斑點(diǎn)大小、斑點(diǎn)顏色、斑點(diǎn)數(shù)目的多少進(jìn)行定性鑒別，這種薄層鑒別方法具備了指紋圖譜的特征。20世紀(jì)70年代及80年代，出現(xiàn)薄層掃描儀，日本和我國部分學(xué)者用薄層掃描儀得到復(fù)方成藥掃描圖作為色譜指紋圖嘗試應(yīng)用于藥材及成藥分析。20世紀(jì)80年代及90年代，高效液相技術(shù)得到發(fā)展，同時(shí)植物藥中化學(xué)成分的分離鑒定、活性成分的不斷闡明，高效液相廣泛應(yīng)用于定性、定量分析。西方普遍采用高效液相色譜法對植物藥中已知及未知組分進(jìn)行控制，并形成相應(yīng)的規(guī)范。目前高效液相色譜法已成為當(dāng)前研究指紋圖譜的主要手段。

1.2中藥指紋圖譜的定義

中藥指紋圖譜鑒別借用了法醫(yī)學(xué)的指紋鑒定的概念。定義：運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)對中藥化學(xué)信息以圖形（圖像）的方式進(jìn)行表征并加以描述。由次生代謝產(chǎn)物組成的中藥提取物的色譜指紋圖譜不僅具備個(gè)體的絕對的惟一性，更強(qiáng)調(diào)的是物種特征的惟一性與同種植物中的相似性。

現(xiàn)代分析技術(shù)：包括光譜、波譜、色譜、核磁共振、X射線衍射及各種技術(shù)的聯(lián)用。

中藥化學(xué)信息：植物藥（包括來源于植物的中藥材）的提取物（包括中藥的湯藥）與化學(xué)合成藥最根本的區(qū)別是，它（即使是單味藥材）是多種化學(xué)成分的混合體。這種多種化學(xué)成分的綜合體構(gòu)成了“中藥化學(xué)信息”。由于中藥的療效由多種成分協(xié)同作用或“相克作用”，中藥中的化學(xué)信息有一定的模糊性。只有部分化學(xué)信息（包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分）可表征于指紋圖譜中。

表征和描述：“表征”是將中藥化學(xué)信息通過色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖）等方式進(jìn)行表達(dá)；“描述”是對指紋圖譜經(jīng)過計(jì)算、分析、比較、評價(jià)等過程，以技術(shù)參數(shù)、指紋特征等加以說明。中藥指紋圖譜研究須經(jīng)過制備、分析、比較、評價(jià)和校驗(yàn)等過程。分析色譜指紋圖要求“準(zhǔn)確的辨認(rèn)”，不是“精密的測量”；比較供試品與對照品的色譜指紋圖譜是要求“相似”，而不是“相同”；評價(jià)色譜比較的結(jié)果，是根據(jù)色譜指紋圖譜的模糊屬性，著眼于宏觀的規(guī)律性的特征分析，即著重辨認(rèn)完整色譜的“圖貌”，而不是求索細(xì)枝末節(jié)。分析比較的結(jié)果，是對供試品與對照品之間的差異或一致性作出評價(jià)。

1.3中藥指紋圖譜與中藥安全、有效、穩(wěn)定和可控的關(guān)系藥物研究的主要內(nèi)容包括藥物安全性、有效性、穩(wěn)定性和可控性，四者缺一不可。已生產(chǎn)并臨床使用的注射劑等中成藥，由于經(jīng)過了藥效學(xué)測試、臨床評價(jià)，安全性與有效性沒有，但是，現(xiàn)有的質(zhì)量控制方法的不全面性及生產(chǎn)過程中的不穩(wěn)定性導(dǎo)致各批次產(chǎn)品之間質(zhì)量出現(xiàn)差異，在臨床應(yīng)用過程中往往出現(xiàn)非正常的醫(yī)療事故。指紋圖譜研究的直接目的有兩個(gè)方面：

（1）

對中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充和提高。現(xiàn)有《中國藥典》質(zhì)量控制方法及新藥申報(bào)資料7，往往以1個(gè)或個(gè)以上成分為控制指標(biāo)，在一定程度上反映了原藥材、中間體及成品的質(zhì)量，但任何單一的成分都難以準(zhǔn)確、全面地評價(jià)中藥質(zhì)量，不僅不能進(jìn)行真?zhèn)舞b別和優(yōu)劣判別，在很多情況下，所檢測的指標(biāo)成分（活性成分）還不具有“惟一性”，使用器材比較簡單，操作比較粗糙，有時(shí)重現(xiàn)性差。《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》要求將指紋圖譜檢測指標(biāo)及持續(xù)術(shù)要求作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)單列項(xiàng)目，是對現(xiàn)行中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的有益補(bǔ)充。一個(gè)理想的指紋圖譜不僅能達(dá)到定性鑒別的目的，色譜圖中大部分藥譜理應(yīng)達(dá)到基線分離，對大部分成分應(yīng)可進(jìn)行定量分析。在沒有對照品的情況下，也可以已知標(biāo)準(zhǔn)品針對其他未知或無標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰進(jìn)行定量。因此，中藥指紋圖譜是對現(xiàn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)近控制方法的提高。（2）

控制中間體、成品的一致性，減少批間差異中藥生產(chǎn)的原材料，因土壤、氣候等環(huán)境因素及采收加工的不同，實(shí)際使用時(shí)不能保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，經(jīng)加工提取得到的中間體，每個(gè)批次在成分含量、成分組成及各成分比例方面都不能保持一致。通過指紋圖譜研究，可以掌握每一個(gè)批次的原藥材、中間體中成分變化，進(jìn)行有指導(dǎo)的合理“勾兌“，保證成品在成分含量、組成比例上一致，減少批間差異。無論是原藥材、中間體還是成品，因組方已固定、生產(chǎn)工藝相對恒定，藥品的安全性不可能直接通過指紋圖譜來保障，但中藥指紋圖譜可直接解決中間體、成品的批間一致性及穩(wěn)定性問題，從而可以間接并最終保障成品的安全性和有效性。一致性安全性指紋圖譜可控性有效性

1.4中藥指紋圖譜建立的意義與原則中藥指紋圖譜建立的是全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而反映中藥的質(zhì)量?，F(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確，采用中藥指紋圖譜的方式，將有效地表征中藥質(zhì)量。指紋圖譜已為國際社會所認(rèn)可，有利于中藥及產(chǎn)品進(jìn)入國際市場。中藥指紋圖譜的建立，應(yīng)以系統(tǒng)的化學(xué)成分和藥理學(xué)研究為依托，應(yīng)體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性、重現(xiàn)性三個(gè)基本原則。系統(tǒng)性：“系統(tǒng)性“是指指紋圖譜所反映的化學(xué)成分應(yīng)包括中藥有效部位所含大部分成妥的種類，或指標(biāo)成分的全部。如：中藥人參中所含的有效成分多為皂苷類化合物，則其指紋圖譜應(yīng)盡可能多地反映其中的皂苷成分；銀杏葉中的有效成分是黃酮和銀杏內(nèi)酯類，則其指紋圖譜可采用兩種方法針對這兩類成分，分別分析，以達(dá)到系統(tǒng)、全面的目的。特征征性性：“特特征征性性““是是指指指指紋紋圖圖譜譜中中反反映映的的化化學(xué)學(xué)成成分分信信息息（（具具體體表表現(xiàn)現(xiàn)為為保保留留時(shí)時(shí)間間或或位位移移值值））是是具具有有高高度度選選擇擇性性的的，，這這些些信信息息的的綜綜合合結(jié)結(jié)果果，，將將能能特特征征地地區(qū)區(qū)分分中中藥藥的的真真?zhèn)蝹闻c與優(yōu)優(yōu)劣劣，，成成為為中中藥藥自自身身的的””化化學(xué)學(xué)條條碼碼““。。如：北北五味味婦的的高效效液相相色譜譜和薄薄層色色譜指指紋圖圖譜，，不僅僅包括括多種種已知知的五五味子子木脂脂素成成分，，而且且還有有很多多未知知成分分，這這些成成分之之間的的順序序、比比值在在一定定范圍圍內(nèi)是是固定定的，，并且且隨藥藥材品品種的的不同同而不不同。。通過過這些些整體體信息息，可可以很很好地地區(qū)分分北五五味子子與南南五味味子以以及其其它來來源的的五味味子藥藥材，，辨別別藥材材的真真?zhèn)闻c與優(yōu)劣劣。重現(xiàn)性性：“重現(xiàn)現(xiàn)性““是指指所建建立的的指紋紋圖譜譜，在在規(guī)定定的方方法與與條件件下，，不同同的操操作者者和不不同的的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室應(yīng)應(yīng)能作作出相相同的的指紋紋圖譜譜，其其誤差差應(yīng)在在允許許的范范例內(nèi)內(nèi)，這這樣才才可以以保證證指紋紋圖譜譜的使使用具具有通通用性性和實(shí)實(shí)用性性，也也是作作為標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)方方法所所必備備的特特征之之一。。實(shí)現(xiàn)指指紋圖圖譜的的重現(xiàn)現(xiàn)性，，除在在樣品品制備備方法法、分分析過過程、、結(jié)果果處理理待環(huán)環(huán)節(jié)規(guī)規(guī)范操操作外外，還還應(yīng)建建立相相應(yīng)的的評價(jià)價(jià)機(jī)制制，對對指紋紋圖譜譜進(jìn)行行客觀觀評價(jià)價(jià)，并并公布布標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)指紋紋圖譜譜。實(shí)現(xiàn)中中藥指指紋圖圖譜的的三原原則，，保證證其標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化化，做做到統(tǒng)統(tǒng)一規(guī)規(guī)范，，這樣樣才可可以使使中藥藥指紋紋圖譜譜得以以推廣廣應(yīng)用用。1.5國國外外植物物藥指指紋圖圖譜的的應(yīng)用用美國FDA：允允許草草藥保保健品品申報(bào)報(bào)資料料可以以提供供色譜譜指紋紋圖；；WHO：1996年年草藥藥評價(jià)價(jià)指導(dǎo)導(dǎo)原則則中規(guī)規(guī)定，，如果果草藥藥的活活性成成分不不明，，可以以提供供色譜譜指紋紋圖譜譜以證證明產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)質(zhì)量的的一致致。歐共體體：在在草藥藥質(zhì)量量指南南中稱稱，單單靠測測定某某有效效成分分考察察質(zhì)量量的穩(wěn)穩(wěn)定性性是不不夠的的，因因?yàn)椴莶菟幖凹捌渲浦苿┦鞘且哉w為為活性性物質(zhì)質(zhì)。在在歐共共體藥藥品申申請注注冊表表格中中植物物藥制制品的的“藥藥物專專家報(bào)報(bào)告““要求求通過過已知知的具具有治治療作作用的的活性性物質(zhì)質(zhì)對原原料、、中間間體及及成品品進(jìn)行行標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)化控控制。。第二章章中中藥指指紋圖圖譜研研究方方法學(xué)學(xué)2.1常常用指紋紋圖譜研究究的方法與與技術(shù)研究對象的的不同，指指紋圖譜研研究的方法法與技術(shù)也也不同，并并都隨著現(xiàn)現(xiàn)代科技技技術(shù)的發(fā)展展而發(fā)展。。中藥指紋紋圖譜研研究所采采用的方方法大致致分為：：色譜法法、光譜譜法及其其它。色譜法包包括：薄薄層色譜譜法（TLC））、液相相色譜法法（LC）、氣氣相色譜譜法（GC）、、高效毛毛細(xì)管電電泳法（（CE））；光譜法包包括：紫紫外光譜譜法（UV）、、紅外光光譜法（（IR））、近紅紅外光譜譜法（NIR））；X射線衍衍射法、、核磁共共振法（（NMR）等。。（1）X射線衍衍射法及及核磁共共振法這兩種方方法能給給出藥效效物質(zhì)基基礎(chǔ)的結(jié)結(jié)構(gòu)信息息，部分分信息也也可能與與特定化化學(xué)成分分直接關(guān)關(guān)聯(lián)。但但該兩種種方法所所使用的的儀器在在國內(nèi)尚尚未普及及，不適適應(yīng)該方方法的應(yīng)應(yīng)用與推推廣。在在中藥指指紋圖譜譜研究過過程中不不建議采采用X射射線衍射射法及核核磁共振振法。（2）紫外可見見分光光光度法和和紅外光光譜法這兩種方方法能夠夠給出藥藥效物質(zhì)質(zhì)基礎(chǔ)的的結(jié)構(gòu)信信息，但但所給出出的信息息是所有有化學(xué)物物質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)結(jié)構(gòu)信信息的加加和，不不具備指指紋特征征，但可可作為中中藥指紋紋圖譜研研究的輔輔助方法法。（3）近紅外光光譜法此方法與與紅外光光譜法原原理相同同，但檢檢測時(shí)采采用近紅紅外波長長，所給給出的信信息是所所有化學(xué)學(xué)物質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)信息息的加和和，通過過一系列列樣本的的檢測（（必須預(yù)預(yù)先知道道樣品中中相關(guān)成成分的含含量或樣樣本的定定性歸屬屬），運(yùn)運(yùn)用化學(xué)學(xué)計(jì)量學(xué)學(xué)手段，，建立了了樣本與與信息之之間的數(shù)數(shù)學(xué)模型型。運(yùn)用用該模型型即可對對未知樣樣本（如如：新近近購進(jìn)的的原藥材材或新生生產(chǎn)的成成品等））進(jìn)行辨辨別分析析（給出出結(jié)果：：合格與與否、含含量多少少等）。。優(yōu)點(diǎn)：檢測速速度快（通常常為1min）、操作作簡單、適宜宜過程控制等等。數(shù)據(jù)處理需掌掌握一定的化化學(xué)計(jì)量學(xué)知知識。近紅外技術(shù)在在農(nóng)藥、化工工、農(nóng)業(yè)等相相關(guān)領(lǐng)域已廣廣泛應(yīng)用，方方法的成熟度度較高，在中中藥質(zhì)量控制制方面有較好好的應(yīng)用前景景，可大力推推廣近紅外技技術(shù)在原材料料質(zhì)量控制中中的應(yīng)用。（4）薄層色譜法法薄層色譜法法為傳統(tǒng)的的定性、定定量分析方方法，廣泛泛應(yīng)用于道道地藥材的的定性鑒定定。2000版版《中國藥藥典》，采采用薄層色色譜法進(jìn)行行定性鑒別別，列于【【鑒別】項(xiàng)項(xiàng)下；采用用薄層掃描描法進(jìn)行含含量測定，，列于【含含量測定】】項(xiàng)下。優(yōu)點(diǎn)：操作作簡單、分分析速度快快、一次分分析樣品數(shù)數(shù)量多。缺點(diǎn)：重現(xiàn)現(xiàn)性、精密密度差?？勺鳛橹兴幩幹讣y圖譜譜研究的借借鑒與補(bǔ)充充。（5）液相色譜法法最常用的指指紋圖譜研研究方法，，其中高效效液相色譜譜法（HPLC）具具有分離效效能高、選選擇性高、、檢測靈敏敏高、分析析速度快、、應(yīng)用范圍圍廣等特點(diǎn)點(diǎn)。中藥樣品中中含有的成成分絕大多多數(shù)可在高高效液相色色譜儀上進(jìn)進(jìn)行分析檢檢測，方法法成熟，中中藥指紋圖圖譜研究應(yīng)應(yīng)優(yōu)先考慮慮高效液相相色譜法。。（6）氣相色譜法法氣相色譜法法主要用于于分析氣體體、揮發(fā)性性和半揮發(fā)發(fā)性液體以以及能夠產(chǎn)產(chǎn)生足夠蒸蒸氣壓的固固體，或者者沸點(diǎn)在500℃以以下，相對對分子質(zhì)量量400以以下的物質(zhì)質(zhì)。在中中藥藥質(zhì)質(zhì)量量控控制制中中主主要要用用于于揮揮發(fā)發(fā)油油、、極極性性較較小小的的成成分分或或衍衍生生化化后后的的可可揮揮發(fā)發(fā)性性成成分分（（如如脂脂肪肪酸酸的的酯酯））。。特點(diǎn)點(diǎn)：：靈靈敏敏度度高高、、分分離離度度好好、、分分析析速速度度快快，，定定量量分分析析的的精精密密度度優(yōu)優(yōu)于于1%，，但但分分析析范范圍圍只只局局限限于于低低沸沸點(diǎn)點(diǎn)成成分分是是其其主主要要不不足足。。為為中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜研研究究的的主主要要方方法法之之一一。。（7））高效效毛毛細(xì)細(xì)管管電電泳泳法法高效效毛毛細(xì)細(xì)管管電電泳泳法法是是以以毛毛細(xì)細(xì)管管為為分分離離通通道道、、以以高高壓壓直直流流電電場場為為驅(qū)驅(qū)動(dòng)動(dòng)力力的的新新型型分分離離分分析析技技術(shù)術(shù)。。適適用用于于中中藥藥中中帶帶電電荷荷的的化化合合物物（（蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)、、氨氨基基酸酸、、黃黃酮酮、、生生物物堿堿））、、有有機(jī)機(jī)酸酸、、單單糖糖及及一一些些中中性性分分子子的的分分離離分分析析，，可可作作為為中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜研研究究的的補(bǔ)補(bǔ)充充。。（8））其它它高效效液液相相色色譜譜與與質(zhì)質(zhì)譜譜聯(lián)聯(lián)用用（（HPLC-MS））、、氣氣相相色色譜譜與與質(zhì)質(zhì)譜譜聯(lián)聯(lián)用用（（GC-MS））、、毛毛細(xì)細(xì)管管電電泳泳與與質(zhì)質(zhì)譜譜聯(lián)聯(lián)用用（（CE-MS））等等。。這些些方方法法可可在在指指紋紋圖圖譜譜中中的的部部分分色色譜譜峰峰在在無無標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)物物質(zhì)質(zhì)驗(yàn)驗(yàn)證證的的情情況況下下，，起起到到定定性性鑒鑒別別的的作作用用。。最常常用用為為：：TLC、、HPLC、、GC。。2.2指指紋紋圖圖譜譜研研究究常常用用的的儀儀器器與與設(shè)設(shè)備備2.2.1薄薄層層掃描儀儀（1）薄層掃描描流程點(diǎn)樣洗洗脫展開開掃掃描檢檢測數(shù)數(shù)據(jù)處理理（2）薄層掃描描儀主要要部件典型的薄薄層掃描描儀主要要由機(jī)械械掃描裝裝置和數(shù)數(shù)據(jù)處理理兩部分分組成，，新型的的薄層掃掃描儀配配有自動(dòng)動(dòng)點(diǎn)樣器器等。（3）主要廠家家及儀器器型號日本島津津CS系系列；美美國SchoeffelSD3000等等。2.2.2高高效效液相色色譜儀22.2.3氣氣相色色譜儀2.3指指紋紋圖譜研研究對高高效液相相色譜儀儀的要求求2.3.1柱柱外效效應(yīng)應(yīng)特別注注意“柱柱外效應(yīng)應(yīng)”對分分析結(jié)果果的影響響。由于樣品品分子在在液體流流動(dòng)相的的擴(kuò)散系系數(shù)比在在氣體中中小4~5個(gè)數(shù)數(shù)量級，，液體流流動(dòng)相的的流速也也比氣相相慢1~2個(gè)數(shù)數(shù)量級，，因此，，樣品注注入色譜譜柱后，，在柱子子以外任任何死空空間（如如進(jìn)樣器器、柱接接連接管管和檢測測器）中中，樣品品分子的的擴(kuò)散和和滯留都都會顯著著引起色色譜峰的的擴(kuò)散，，而使柱柱效降低低，所以以柱外死死體積的的影響量量不能忽忽略。在制造和和使用高高效液相相色譜儀儀時(shí)，應(yīng)應(yīng)使柱外外效應(yīng)減減至最小小,以獲獲得理想想的分析析結(jié)果。。建議：色譜柱柱及檢測測器前死體積應(yīng)應(yīng)最小。2.3.2流流動(dòng)相的的脫氣流動(dòng)相在在使用前前必須進(jìn)進(jìn)行脫氣氣處理，，以除去去其中溶溶解的氣氣體（如如O2）），防止止在洗脫脫過程中中，因壓壓力降低低而產(chǎn)生生氣泡。。若在低低死體積積檢測池池中存在在氣泡，，會增加加基線噪噪聲，嚴(yán)嚴(yán)重時(shí)會會造成分分析靈敏敏度下降降而無法法進(jìn)行分分析。溶解在流流動(dòng)相中中的氧氣氣會造成成熒光猝猝滅，影影響熒光光檢測器器的檢測測；可導(dǎo)導(dǎo)致樣品品中的某某些級組組分被子子氧化或或使柱中中固定相相發(fā)生降降解而改改變柱的的分離性性能。常用的脫脫氣方法法有離線式脫脫氣和在線式脫脫氣。離線式脫脫氣：吹氦脫脫氣法、、加熱回回流法、、抽真空空脫氣法法、超聲聲波脫氣氣法等。。離線式式脫氣會會因流動(dòng)動(dòng)相存放放時(shí)間的的延長以以致有空空氣重新新溶解在在流動(dòng)相相中；在線式脫脫氣技術(shù)是是把真真空脫脫氣裝裝置串串接到到貯液液系統(tǒng)統(tǒng)中，，并結(jié)結(jié)合膜膜過濾濾器，，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)流動(dòng)動(dòng)相在在進(jìn)入入輸液液泵前前的連連續(xù)脫脫氣。。在線線式脫脫氣法法的脫脫氣效效果明明顯優(yōu)優(yōu)于離離線式式脫氣氣法，，并適適用于于多元元溶劑劑體系系。建議：選擇擇在線脫脫氣。2.3.3梯梯度度洗脫脫梯度洗洗脫是是流動(dòng)動(dòng)相中中含有有兩種種或兩兩種以以上的的不同同極性性的溶溶劑，，在洗洗脫過過程中中連續(xù)續(xù)或間間斷改改變流流動(dòng)相相的組組成，，以調(diào)調(diào)節(jié)它它的極極性，，使每每個(gè)流流出的的組分分獲得得最理理想的的分離離效果果，并并使樣樣品中中的所所有組組分可可在最最短的的分析析時(shí)間間內(nèi)，，以適適用的的分離離度獲獲得圓圓滿的的選擇擇性分分離。。分為為高壓壓梯度度和低低壓梯梯度兩兩種方方式進(jìn)進(jìn)行操操作。。由于高高壓梯梯度裝裝置中中，每每種溶溶劑是是分別別由泵泵輸送送的，，進(jìn)入入混合合器后后，溶溶劑的的可壓壓縮性性和溶溶劑混混合時(shí)時(shí)的熱熱力學(xué)學(xué)體積積的變變化，，可能能影響響輸入入到色色譜柱柱的流流動(dòng)相相的組組成，，因此此高壓壓梯度度洗脫脫過程程中為為保證證流速速穩(wěn)定定必須須使用用恒流流泵，，否則則很難難獲得得重復(fù)復(fù)性結(jié)結(jié)果。。低壓梯梯度是是在常常壓下下將多多元溶溶劑輸輸至混混合器器中。。優(yōu)點(diǎn)是是：①①僅需需要使使用一一個(gè)高高壓輸輸液泵泵；②②減小小了溶溶劑可可壓縮縮性的的影響響，并并能完完全消消除由由于溶溶劑混混合引引起的的熱力力學(xué)體體積變變化帶帶來的的誤差差。建議：選擇擇低壓梯梯度。2.3.4樣樣品進(jìn)進(jìn)樣進(jìn)樣器器有以以下幾幾種：：（1））停流進(jìn)進(jìn)樣裝裝置為防止止在帶帶壓操操作下下引起起流動(dòng)動(dòng)相泄泄露，，此裝裝置要要求進(jìn)進(jìn)樣前前壓降降至常常壓下下再進(jìn)進(jìn)樣，，操作作繁瑣瑣，已已較少少使用用。（2））六通通閥閥進(jìn)進(jìn)樣樣裝裝置置該方方法法重重現(xiàn)現(xiàn)性性較較好好，，較較常常用用。。（3））自動(dòng)動(dòng)進(jìn)進(jìn)樣樣器器自動(dòng)動(dòng)進(jìn)進(jìn)樣樣器器由由計(jì)計(jì)算算機(jī)機(jī)自自動(dòng)動(dòng)控控制制定定量量閥閥，，按按預(yù)預(yù)先先編編制制的的注注射射樣樣品品操操作作程程序序工工作作。。取取樣樣、、進(jìn)進(jìn)樣樣、、復(fù)復(fù)位位、、樣樣品品管管路路清清洗洗和和樣樣品品盤盤的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動(dòng)動(dòng)，，全全部部按按預(yù)預(yù)定定程程序序自自動(dòng)動(dòng)進(jìn)進(jìn)行行，，一一次次可可進(jìn)進(jìn)行行幾幾十十個(gè)個(gè)或或上上百百個(gè)個(gè)樣樣品品的的分分析析。。自動(dòng)動(dòng)進(jìn)進(jìn)樣樣的的樣樣品品量量可可連連續(xù)續(xù)調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)，，適適合合大大量量樣樣品品分分析析，，節(jié)節(jié)省省人人力力。。（4））建議：中藥藥指紋紋圖譜譜研究究過程程中，，由于于對樣樣品的的進(jìn)樣樣量精精確度度要求求不高高，因因此對對進(jìn)樣樣器的的選擇擇可結(jié)結(jié)合研研究者者的實(shí)實(shí)際情情況，，建議議選擇擇六通閥閥手動(dòng)動(dòng)進(jìn)樣樣裝置置。2.3.5色色譜柱柱2.3.6柱柱溫溫不同柱柱溫下下同一一成分分在的的保留留時(shí)間間往往往發(fā)生生遷移移，有有時(shí)還還影響響成分分之間間的分分離效效果。。由于于中中藥藥樣樣品品成成分分的的復(fù)復(fù)雜雜性性，，尤尤其其是是中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜技技術(shù)術(shù)要要求求色色譜譜峰峰的的相相對對保保留留時(shí)時(shí)間間、、峰峰面面積積比比值值的的相相對對恒恒定定，，對對柱柱溫溫的的要要求求應(yīng)應(yīng)嚴(yán)嚴(yán)格格控控制制，，以以保保證證分分析析方方法法的的重重現(xiàn)現(xiàn)性性。。建議議：選選擇擇柱溫溫箱箱。2.3.7檢檢測測器器（1））紫外外線線檢檢測測器器應(yīng)用用最最廣廣，，要要求求分分析析樣樣品品必必須須在在紫紫外外線線區(qū)區(qū)有有吸吸收收。。特點(diǎn)點(diǎn)：：靈靈敏敏度度高高、、線線性性范范圍圍寬寬，，可可做做成成很很小小池池體體積積的的流流通通，，對對流流動(dòng)動(dòng)相相的的流流速速和和溫溫度度變變化化不不太太敏敏感感，，易易操操作作，，不不破破壞壞樣樣品品，，波波長長可可以以選選擇擇及及可可用用于于梯梯度度洗洗脫脫。。（2））示差差折折光光檢檢測測器器示差差折折光光檢檢測測器器是是通通用用型型檢檢測測器器，，對對在在可可見見光光或或紫紫外外線線區(qū)區(qū)無無吸吸收收的的樣樣品品一一般般選選用用。。不不破破壞壞樣樣品品，，缺缺點(diǎn)點(diǎn)是是對對溫溫度度變變化化敏敏感感，，不不能能用用低低梯梯度度洗洗脫脫，，靈靈敏敏度度低低，，不不能能用用于于痕痕量量分分析析。。（3）熒光檢測器器（4）電化學(xué)檢測測器（5）二極管陣列列檢測器光束通過流流通池、分分光系統(tǒng)后后，使所有有波長在二二級管陣列列檢測器同同時(shí)檢測器器，可得三三維的時(shí)間間-色譜信信號-吸收收光譜圖。。特點(diǎn)：可進(jìn)進(jìn)行全波長長檢測，一一次進(jìn)樣可可以檢測到到樣品中不不同波長下下的所有組組分；光譜譜分辨率高高，可以檢檢測色譜峰峰的純度；；靈敏度高高，線性范范圍寬，基基線噪聲小小?？傻玫剿杏薪M分的全全波長掃描描圖，可用用于定性分分析，通過過對三維色色譜圖的分分析，可以以優(yōu)化檢測測波長。（6））蒸發(fā)激激光光光散射射檢測測器通用性性檢測測器。?？梢砸詸z測測揮發(fā)發(fā)性低低于流流動(dòng)相相的任任何樣樣品，，可作作于無無生色色團(tuán)物物質(zhì)的的檢測測，如如碳水水化合合物（（多糖糖）、、類脂脂類（（磷脂脂）、、皂苷苷、不不進(jìn)行行衍生生化的的脂肪肪酸和和氨基基酸，，以及及結(jié)構(gòu)構(gòu)不明明又無無標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)樣品品的未未知物物。根據(jù)具具體情情況，，進(jìn)行行選擇擇。據(jù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)，95%的中中藥組組分在在可見見光或或紫外外線區(qū)區(qū)有吸吸收，，可首首選配配置可可編波波長紫紫外線線檢測測器（（VWD））。建議：在指指紋圖圖譜研研究過過程中中，由由于并并不完完全了了解樣樣品中中所含含組分分的化化學(xué)結(jié)結(jié)構(gòu)，，尤其其是復(fù)復(fù)方制制劑所所含組組分結(jié)結(jié)構(gòu)類類型不不一，，最大大吸收收波長長各不不相同同，很很難一一次成成功地地選擇擇好檢檢測波波長。。因此此最好選選用二二極管管陣列列檢測測器。第三章章中中藥藥色譜譜指紋紋圖譜譜研究究過程程中的的關(guān)鍵鍵問題題指紋圖圖譜技技術(shù)在在植物物藥領(lǐng)領(lǐng)域已已應(yīng)用用十余余年，，研究究方法法與研研究思思路相相對成成熟，，已形形成共共識，，普遍遍采用用HPLC、TLC、GC或或NIR（（近紅紅外技技術(shù)）），對對植物物藥有有效組組分進(jìn)進(jìn)行全全成分分質(zhì)量量控制制，即即指紋紋圖譜譜技術(shù)術(shù)。3.1方方案設(shè)設(shè)計(jì)與與思路路3.1.1研研究對對象的的確定定植物藥藥或中中藥的的成分分可分分為：：蛋白白質(zhì)、、脂類類、糖糖及衍衍生物物、有有機(jī)酸酸、酚酚類、、鞣質(zhì)質(zhì)、醌醌類、、內(nèi)酯酯、香香豆精精、黃黃酮類類、皂皂苷類類、生生物堿堿類、、甾體體類、、萜類類、揮揮發(fā)油油等。。當(dāng)研究究某個(gè)個(gè)注射射劑品品種的的指紋紋圖譜譜時(shí)，，首先先必須須調(diào)研研相關(guān)關(guān)的文文獻(xiàn)、、新藥藥申報(bào)報(bào)資料料（質(zhì)質(zhì)量部部分和和工藝藝部分分）及及其它它研究究結(jié)果果，盡盡可能能詳盡盡地了了解藥藥材、、中間間體及及成品品中所所含水水量成成分的的種類類及其其理化化性質(zhì)質(zhì)，經(jīng)經(jīng)綜合合分析析后找找出成成品中中的藥藥效成成妥或或有效效成分分，作作為成成品或或中間間體指指紋圖圖譜的的研究究對象象，即即分析析檢測測目標(biāo)標(biāo)。如：黃芪含含黃酮、皂皂苷及多糖糖；黃芪多多糖注射液液是以黃芪芪中的多糖糖為原料，，因此對黃黃芪多糖注注射液進(jìn)行行指紋圖譜譜研究時(shí)應(yīng)應(yīng)以多糖作作為研究對對象；研究究其中間體體時(shí)也應(yīng)以以多糖為研研究對象；；研究原藥藥材的指紋紋圖譜時(shí)應(yīng)應(yīng)把黃酮、、皂苷及多多糖作為研研究對象。。復(fù)方應(yīng)以以君藥、、臣藥中中有效成成分作為為主要研研究對象象，佐使使藥中的的成分可可采用其其它指紋紋圖譜方方法進(jìn)行行輔助、、補(bǔ)充研研究。3.1.2研研究究方法的的選擇主要采用用色譜法法。各種種色譜法法是互補(bǔ)補(bǔ)的，應(yīng)應(yīng)根據(jù)研研究對象象的實(shí)際際需要和和可能以以及按照照不同色色譜技術(shù)術(shù)的特點(diǎn)點(diǎn)和優(yōu)勢勢而定，，目的是是保證方方法的重重現(xiàn)性和和確能反反映產(chǎn)品品質(zhì)量的的主要化化學(xué)成分分。一個(gè)中藥藥制劑指指紋圖譜譜應(yīng)可以以同時(shí)采采用兩種種或更多多種方法法進(jìn)行研研究。指紋圖譜譜研究方方法應(yīng)根根據(jù)研究究對象的的物理化化學(xué)性質(zhì)質(zhì)來選擇擇，大多多數(shù)方法法可采用用HPLC法。。通常揮揮發(fā)油類類采用GC。一一些難以以檢測或或采用上上述方法法得不到到較理想想的分離離效果時(shí)時(shí)，可采采用TLC或CE。3.1.3研研究究內(nèi)容根據(jù)國家家藥品監(jiān)監(jiān)督管理理局下發(fā)發(fā)的《中中藥注射射劑指紋紋圖譜研研究的技技術(shù)要求求》（暫暫行）的的規(guī)定，，主要研研究內(nèi)容容有原藥藥材、中中間體、、注射劑劑的指紋紋圖譜，，涉及樣樣品名稱稱、來源源、制備備、測定定方法、、指紋圖圖譜及技技術(shù)參數(shù)數(shù)等研究究項(xiàng)。3.2原原藥藥材、中中間體及及注射劑劑樣品選選擇與收收集中藥是天天然產(chǎn)物物，中藥藥的活性性成分都都是次生生的代謝謝產(chǎn)物，，本身有有它內(nèi)在在的不穩(wěn)穩(wěn)定性。。我國藥藥材品種種多、產(chǎn)產(chǎn)地廣、、分散度度大，造造成了中中藥材基基源復(fù)雜雜，形成成許多同同名異物物的品種種，這些些品種在在傳統(tǒng)中中醫(yī)臨床床中并未未加以細(xì)細(xì)分，其其中多數(shù)數(shù)已收入入《中華華人民共共和國藥藥典》。。對于《《中國藥藥典》收收載的品品種，從從中醫(yī)的的角度均均可入藥藥，這種種多基源源藥材增增加了色色譜指紋紋圖譜研研究的難難度。近年由于于藥材量量需求增增大，藥藥材資源源破壞嚴(yán)嚴(yán)重，藥藥材內(nèi)在在質(zhì)量下下降，炮炮制加工工的粗放放造成有有效成分分的流失失，人為為因素造造成了藥藥材質(zhì)量量不穩(wěn)定定，不利利于色譜譜指紋圖圖譜的研研究與應(yīng)應(yīng)用。我國藥材材GAP工程已已起步，，將有利利于中藥藥注射劑劑及其它它制劑的的質(zhì)量控控制。已生產(chǎn)的的注射劑劑，因生生產(chǎn)中藥藥材來源源基本確確定，在在補(bǔ)充其其指紋圖圖譜時(shí)，，原藥材材樣品的的收集應(yīng)應(yīng)遵循以以下原則則：①藥材盡盡可能固固定產(chǎn)地地（如道道地藥材材）、采采收期、、炮制方方法；②對已往生產(chǎn)產(chǎn)使用過的藥藥材應(yīng)結(jié)合臨臨床使用情況況選擇收集樣樣品，對工藝藝穩(wěn)定、療效效恒定、臨床床使用中很少少出現(xiàn)異常醫(yī)醫(yī)療事故的藥藥材批次應(yīng)重重點(diǎn)選擇；③另外還應(yīng)收收集不同產(chǎn)地地、不同采收收期的藥材，，這些藥材雖雖然含量高低低不同，組成成比例各異，，但當(dāng)正常使使用的藥材一一旦出現(xiàn)偏差差時(shí)，可通過過這些批次的的藥材實(shí)行合合理“勾兌””。通過對指指紋圖譜的研研究，可以對對“勾兌”過過程進(jìn)行指導(dǎo)導(dǎo)。中間體、注射射劑因其生產(chǎn)產(chǎn)工藝已經(jīng)恒恒定，樣品的的收集原則也也應(yīng)重點(diǎn)選擇擇工藝穩(wěn)定、、療效恒定、、臨床使用中中很少出現(xiàn)醫(yī)醫(yī)療事故的批批次。根據(jù)《中藥注注射劑指紋圖圖譜研究的技技術(shù)要求》（（暫行）之規(guī)規(guī)定，原藥材材、中間體及及注射劑樣品品至少應(yīng)收集集10批次。。不可以同一一批次的樣品品分散成數(shù)個(gè)個(gè)批次，充當(dāng)當(dāng)樣品。3．3原藥藥材、中間體體及注射劑的的預(yù)處理在指紋圖譜研研究過程中，，供試品（原原藥材、中間間體及注射劑劑）溶液的制制備過程不是是關(guān)鍵性的技技術(shù)問題，但但操作煩瑣。。原藥材的供試試品制備最為為復(fù)雜。原藥藥材所含的多多種組分混雜雜在一起，樣樣品制備時(shí)，，應(yīng)根據(jù)所含含成分和物理理化學(xué)性質(zhì)，，通過萃取、、沉淀、吸附附或通過化學(xué)學(xué)反應(yīng)，分離離富集樣品。。如：黃芪藥材材中的黃酮類類成分通過堿堿水萃取，皂皂苷類成分通通過大孔樹脂脂吸附；苦參參中的總生物物堿通過陽離離子樹脂吸附附與解吸附。。中間體是原藥藥材經(jīng)過了多多步處理而得得，已經(jīng)濾過過了大部分成成分，只保留留一小部部分有效效組分，樣品品制備時(shí)，可可針對有效成成分處理，并并參照原藥材材的制備方法法。樣品富集后，，尚需過氧化化鋁預(yù)柱、C18預(yù)柱、、硅膠預(yù)柱、、聚酰胺預(yù)柱柱等，以除去去色素等雜質(zhì)質(zhì)，避免干擾擾或?qū)ιV柱柱的損耗。注射液中除少少數(shù)品種添加加助溶劑外，，所含化學(xué)成成分均具有較較好的水溶解解性能，面且且研究生產(chǎn)工工藝時(shí)考慮到到色素、生物物大分子等因因素，生產(chǎn)過過程中已通過過微孔濾膜、、脫色等操作作，因此，樣樣品無需特殊殊處理，可直直接分析檢測測。3.4色色譜條件選擇擇指紋圖譜的色色譜條件是研研究檢測方法法過程中最重重要、關(guān)鍵性性的內(nèi)容。我們們以以HPLC法法為為例例，，闡闡述述各各影影響響因因素素及及解解決決途途徑徑。。3.4.1流流動(dòng)動(dòng)相相可用用作作流流動(dòng)動(dòng)相相的的溶溶劑劑有有：：乙乙腈腈、、甲甲醇醇、、乙乙醇醇、、四四氫氫呋呋喃喃、、氯氯仿仿、、二二氯氯甲甲烷烷、、正正已已烷烷等等。。反反相相高高效效液液相相，，以以乙乙腈腈-水水系系統(tǒng)統(tǒng)比比較較適適合合梯梯度度洗洗脫脫。。醇醇-水水系系統(tǒng)統(tǒng)由由于于熱熱力力學(xué)學(xué)和和可可壓壓縮縮性性因因素素，，在在梯梯度度洗洗脫脫時(shí)時(shí)易易導(dǎo)導(dǎo)致致基基線線漂漂移移。。在流流動(dòng)動(dòng)相相中中可可加加入入磷磷酸酸、、乙乙酸酸、、三三乙乙胺胺、、二二乙乙胺胺、、正正丁丁基基溴溴化化胺胺、、十十二二烷烷基基磺磺酸酸鈉鈉等等各各種種改改性性劑劑，，或或采采用用磷磷酸酸-磷磷酸酸氫氫二二鈉鈉/磷磷酸酸二二氫氫鈉鈉、、乙乙酸酸-乙乙酸酸鈉鈉緩緩沖沖溶溶液液，，以以達(dá)達(dá)到到改改善善色色譜譜峰峰分分離離程程度度及及改改善善峰峰形形的的目目的的。。樣品品中中如如有有部部分分成成分分的的極極性性較較小小，，在在流流動(dòng)動(dòng)相相中中可可加加入入少少量量異異丙丙醇醇、、四四氫氫呋呋喃喃、、氯氯仿仿、、環(huán)環(huán)糊糊精精等等，，增增加加流流動(dòng)動(dòng)相相對對樣樣品品的的溶溶解解性性，，一一方方面面改改善善峰峰形形，，另另一一方方面面可可快快速速洗洗脫脫。。對黃酮類、酚酚酸類成分可可參考選擇乙乙膊-水-酸酸系統(tǒng)的流動(dòng)動(dòng)相；對皂苷苷類成分可參參考選擇乙腈腈-水系統(tǒng)的的流動(dòng)相，生生物堿類成分分可參考選擇擇乙腈-水-三乙胺等系系統(tǒng)的流動(dòng)相相。3.4.2檢檢測波波長選擇有以下方方法：①參照樣品的的全波長紫外外線吸收圖，，選擇吸收峰峰值；②參照對照品品的全波長紫紫外線吸收圖圖，選擇吸收收峰值；③根據(jù)君、臣臣、佐、使的的組方理論，，在盡可能兼兼顧佐使藥的的同時(shí)，主要要選擇君、臣臣藥中有效成成妥的及收峰峰值。一個(gè)檢測波長長下的色譜圖圖如不能達(dá)到到控制質(zhì)量的的目的，可建建立多個(gè)檢測測波長下的指指紋圖譜。3.4.3柱柱溫柱溫的選擇與與恒定是影響響指紋圖譜技技術(shù)穩(wěn)定的主主要因素之一一。適宜的柱柱溫不僅影響響色譜峰的分分離效果，而而且柱溫發(fā)生生變化將導(dǎo)致致色譜峰保留留時(shí)間的遷移移，技術(shù)參數(shù)數(shù)的設(shè)置就失失去了意義，，因此，柱溫溫必須限定。。當(dāng)色譜圖某個(gè)個(gè)色譜峰因溶溶解度差而峰峰形較“鈍””時(shí)，可適當(dāng)當(dāng)提高柱溫（（30~50℃）；如樣樣品中組分在在常溫或高溫溫下不穩(wěn)定，，易發(fā)生水解解、分解等變變化時(shí)，可降降低柱溫。3.4.4色色譜柱不同廠家的色色譜柱由于采采用的填料不不同，柱效相相差較大。即即使流動(dòng)相條條件一致，用用不同填料的的色譜柱重復(fù)復(fù)測試時(shí)，不不僅分離效果果大不相同，，而且保留時(shí)時(shí)間的遷移程程度也比較明明顯?？晒┻x擇的色色譜柱填料型型號：Zorbax、Polaris、Kromasil、MataSil、Nucleosil。由于中藥樣品品的復(fù)雜性，，一方面所含含成分極性高高低不等，另另一方面部分分成分結(jié)構(gòu)相相似，極性相相差不大，分分離比較困難難，因此選擇擇色譜柱時(shí)應(yīng)應(yīng)以主要成分分得到分離為為目的，柱效效不易過高。。同時(shí)要考慮填填料的穩(wěn)定性性和載樣量。。指紋圖譜一一般選用5~10μmC18填料柱柱，以4。6mm*250mm較適適宜，其它特特殊的色譜柱柱，如氨基柱柱、腈基柱、、酸性柱、堿堿性柱等，可可視研究對象象的不同而采采用。3.4.5進(jìn)進(jìn)樣量進(jìn)樣量對指紋紋圖譜的結(jié)果果影響不大，，但加大進(jìn)樣樣量，可以減減弱梯度洗脫脫時(shí)基線漂移移的程度；然然而色譜柱的的載樣量有一一定的限度，，進(jìn)樣量過大大，色譜柱超超載，導(dǎo)致色色譜峰峰寬增增加或色譜峰峰尖鈍化，并并影響柱的壽壽命。研究發(fā)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣量量應(yīng)控制最高高色譜峰的吸吸收值在1000mAU以下適合。。當(dāng)?shù)榷认疵撁摃r(shí)，基線平平穩(wěn)，進(jìn)樣量量較平穩(wěn)，進(jìn)進(jìn)樣量應(yīng)盡量量減少，一般般控制最高色色譜峰的吸收收值在100mAU左右右，不宜超過過500mAU。3.4.6色色譜條件件的優(yōu)化當(dāng)一個(gè)指紋圖圖譜初步建立立后，尚需進(jìn)進(jìn)一步優(yōu)化。。首先應(yīng)選擇擇不同操作者者、不同型號號的儀器進(jìn)行行測試；其次次應(yīng)在其它實(shí)實(shí)驗(yàn)室、研究究單位進(jìn)行測測試。國外一個(gè)成熟熟的指紋圖譜譜在形成法規(guī)規(guī)之前，選擇擇世界各地有有名的檢測機(jī)機(jī)構(gòu)（分布于于公司、醫(yī)院院、大學(xué)等的的獨(dú)立分析檢檢測室）進(jìn)行行復(fù)核，以保保證所建立的的指紋圖譜技技術(shù)穩(wěn)定、可可靠。3.5指指紋特征選擇擇指紋圖譜一量量建立，按照照《中藥注射射劑指紋圖譜譜研究的技術(shù)術(shù)要求》（暫暫行）規(guī)定，，除提供指紋紋圖譜外，還還應(yīng)說明相應(yīng)應(yīng)的技術(shù)參數(shù)數(shù)。但大量的的相對保留時(shí)時(shí)間、共有峰峰峰面積比值值等技術(shù)參數(shù)數(shù)，不能直觀觀地用來鑒定定、判別。通過大樣本的的指紋圖譜的的挖掘，找出出隱藏其中的的指紋特征，，是指紋圖譜譜研究的直接接目的。如：歐美植植物藥領(lǐng)域域普遍采用用以人參皂皂苷Rg1和人參皂皂苷Re的的峰面積作作為鑒別中中國人參、、朝鮮人參參、越南人人參、西洋洋參及三七七參的特征征參數(shù)；淫淫羊藿中的的“五指峰峰”是《中中國藥典》》收載品種種EpimediumbreuvicornumMaxim。的典型型特征，根根據(jù)“五指指峰”特征征區(qū)色譜峰峰的組成及及相互間峰峰面積的比比值，可定定性鑒別、、定量分析析不同產(chǎn)地地、不同提提取工藝及及不同品種種的淫羊藿藿。指紋圖譜研研究的建立立、分析、、比較、評評價(jià)和校驗(yàn)驗(yàn)應(yīng)逐漸形形成規(guī)范并并取得共識識。指紋圖圖譜的研究究應(yīng)結(jié)合當(dāng)當(dāng)前的實(shí)際際情況，同同時(shí)結(jié)合生生產(chǎn)工藝的的篩選及藥藥效和臨床床觀察，當(dāng)當(dāng)前階段宜宜簡不宜繁繁、宜易不不宜難，基基本保證產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量的的基本穩(wěn)定定和一致.第四四章章中中藥藥色色譜譜指指紋紋圖圖譜譜的的建建立立與與評評價(jià)價(jià)按技術(shù)要求分分析/抽檢成成品，并與對對照色譜指紋紋圖譜及技術(shù)術(shù)參數(shù)比較，，判別檢測產(chǎn)產(chǎn)品是否合格格，是實(shí)施中中藥指紋圖譜譜的最終目的的。實(shí)現(xiàn)中藥指紋紋國庫券譜技技術(shù)革新，除除了研究中藥藥色譜指紋圖圖譜，還包括括對照指紋圖圖譜及其技術(shù)術(shù)參數(shù)的建立立與指紋圖譜譜評價(jià)等過程程。4.1對照指紋紋圖譜的建立立與指紋圖譜譜評價(jià)目前對中藥材材、中間體及及成品（主要要為注射劑））的指紋圖譜譜研究大多采采用圖譜法，，經(jīng)分析檢測測得到了大量量的色譜數(shù)據(jù)據(jù)。按《中藥藥注射劑指紋紋圖譜研究的的技術(shù)要求》》（暫行），，需對以上色色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行行處理，才能能得到指紋圖圖譜技術(shù)參數(shù)數(shù)。如：相相對保保留時(shí)時(shí)間、、峰面面積比比值、、相對對標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差差等。。目前多多采用用人工工手動(dòng)動(dòng)計(jì)算算的方方法或或借助助于MicrosoftExcell等等應(yīng)用用軟件件計(jì)算算這些些參數(shù)數(shù)，繁繁瑣，，易出出差錯(cuò)錯(cuò)，計(jì)計(jì)算操操作的的過程程了也也不規(guī)規(guī)范?！，F(xiàn)在在已對對計(jì)算算公式式及計(jì)計(jì)算過過程要要求規(guī)規(guī)范。。4.1.1有有關(guān)關(guān)技術(shù)術(shù)參數(shù)數(shù)的計(jì)計(jì)算公公式（1））相對對保留留時(shí)間間RRTRT（i））RT（S））RT（i））各色譜譜峰的的保留留時(shí)間間RT（i））為各色色譜峰峰的保保留時(shí)時(shí)間（2））積分分相對對比值值RAA（i））RA=A（s））A（i））為各色色譜峰峰積分分面積積；A（s））為參考考峰積積分面面積。。RRT（（i））=（3））相對對標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差差RSD%∑（Xi–X））2n-1RSD%=XXi為樣品相應(yīng)應(yīng)參數(shù)；X為均值；；n為樣品品數(shù)量（個(gè)個(gè)）。4.1.2中藥藥色譜對照照指紋圖譜譜的建立與與中藥色譜譜指紋圖譜譜評價(jià)的原原則中藥指紋圖圖譜及技術(shù)術(shù)參數(shù)一旦旦建立，就就可以作為為“標(biāo)準(zhǔn)””或“對照照”/“參參照”，所所起作用如如同對照藥藥材，樣品品的色譜圖圖譜可與對對照指紋圖圖譜進(jìn)行比比較。在對對照指紋圖圖譜建立及及與中藥指指紋圖譜評評價(jià)過程中中須綜合考考慮以下原原則。4.1.2.1整整體性對照指紋圖圖譜的建與與評價(jià)應(yīng)注注意指紋特特征的整體體性。一個(gè)品種的的對照指紋紋圖譜是由由各個(gè)具有有指紋意義義的峰組成成的完整圖圖譜構(gòu)成的的，各個(gè)有有指紋意義義的峰（或或薄層色譜譜的斑點(diǎn)））其位置（（保留時(shí)間間或比移值值）、大小小或高你（（積分面積積或峰高））、各峰之之間相對的的比例是指指紋圖譜的的綜合參數(shù)數(shù)，建立和和評價(jià)時(shí)從從整體的角角度綜合考考慮，注意意各有指紋紋意義的峰峰相互的依依存關(guān)系。。中藥色譜指指紋圖譜在在一定程度度上與臨床床療效的穩(wěn)穩(wěn)定性及用用藥安全性性方面有相相關(guān)性，因因此對照指指紋圖譜中中所有色譜譜峰在樣品品指紋圖譜譜中均應(yīng)體體現(xiàn)且可追追溯。只有有在對照指指紋圖譜中中所有色譜譜峰的穩(wěn)定定體現(xiàn)，才才是保證產(chǎn)產(chǎn)品真正穩(wěn)穩(wěn)定可控的的前提。為為保證色譜譜指紋圖譜譜在整體上上相似，在在建立對照照指紋圖譜譜時(shí)：①應(yīng)盡可能包包含所有具有有指紋意義的的特征峰，尤尤其是含量少少面指紋意義義顯著的色譜譜峰、指紋特特征區(qū)、共有有特征區(qū)；②排除溶劑峰峰及其他可以以追溯的雜質(zhì)質(zhì)峰，供試品品的制備應(yīng)與與工業(yè)生產(chǎn)相相似，并盡可可能采用流動(dòng)動(dòng)相來溶解。。通過比較指紋紋圖譜在整體體上的相似，，楞以判斷出出樣品的真實(shí)實(shí)性。4.1.2.2模糊性性在實(shí)際過程中中由于受到各各種因素的影影響，樣品指指紋圖譜中有有可能出現(xiàn)個(gè)個(gè)別色譜峰的的增加/減少少，色譜峰圖圖譜行為可能能發(fā)生改變，，如峰形、峰峰寬、峰高發(fā)發(fā)生變化及保保留時(shí)間發(fā)生生偏移等，不不可機(jī)械性地地通過色譜