RNA合成20056 生物化學(xué)　教學(xué)課件

內(nèi)容概要：第一節(jié)依賴DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二、模板鏈與非模板鏈三、E.coliRNA聚合酶的組成與功能特征四、轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程第二節(jié)RNA合成的起始小結(jié)第三節(jié)RNA合成的終止第四節(jié)真核生物細(xì)胞核RNA聚合酶第六節(jié)以RNA為模板的DNA和RNA合成第五節(jié)新生RNA的剪切和修飾第十二章RNA的生物合成內(nèi)容概要：第一節(jié)依賴DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二1引言生物遺傳信息傳遞的化學(xué)本質(zhì)，在分子水平看就是：DNARNA復(fù)制本質(zhì)：遺傳信息全部傳遞給子代DNA分子。隨分裂DNA進(jìn)入子細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)控制生長(zhǎng)發(fā)育。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者，不同時(shí)期DNA表達(dá)不同蛋白質(zhì)從而控制整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程。在生物體體系DNA如何指導(dǎo)RNA合成？引言生物遺傳信息傳遞的化學(xué)本質(zhì)，在分子水平看就2第一節(jié)原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合成的酶RNA聚合酶全稱：依賴DNA的RNA聚合酶(DNA-dependentRNApolymerase)，簡(jiǎn)稱RNA聚合酶(RNApolymerase)。又稱為轉(zhuǎn)錄酶(transcriptase)。n1ATPn2GTPn3CTPn4UTPDNA(模板)，Mg2+RNA聚合酶RNA+(n1+n2+n3+n4)PPiRNA聚合酶催化如下的反應(yīng):RNA合成中底物或原料第一節(jié)原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合3轉(zhuǎn)錄最大特點(diǎn)：信息傳遞具有選擇性①轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA兩條鏈中只有其中一條鏈作模板；因?yàn)檗D(zhuǎn)錄的RNA只能與變性DNA中的一條鏈形成雜種分子。②轉(zhuǎn)錄的RNA僅拷貝了DNA中的某個(gè)片段的信息(部分功能單位-基因)；處于轉(zhuǎn)錄過(guò)程的DNA和正在被合成的RNA用圖示意如下:新合成RNA模板鏈非模板鏈轉(zhuǎn)錄最大特點(diǎn)：信息傳遞具有選擇性①轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA兩條鏈中只有其4歷時(shí)近半個(gè)世紀(jì)已經(jīng)解決的基本問(wèn)題：1、RNA聚合酶如何催化RNA合成？2、此時(shí)此刻被轉(zhuǎn)錄的信息由誰(shuí)來(lái)識(shí)別？3、RNA合成基本過(guò)程如何？

Uchoa(西班牙)＆Kornberg因基因表達(dá)研究富有成果分享1959年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；

1965年Jacob＆Monod(法)提出并證實(shí)操縱子學(xué)說(shuō)與woff分享諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；

1975年Tiemin＆Baltimore由于發(fā)現(xiàn)腫瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；歷時(shí)近半個(gè)世紀(jì)已經(jīng)解決的基本問(wèn)題：1、RNA聚合酶如何催化R5DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程:轉(zhuǎn)錄泡~17bp模板鏈(非編碼鏈)RNA5'非模板鏈(編碼鏈)RNA-DNA雜螺旋活性位點(diǎn)：RNA3′端逐個(gè)添加NMP；速度：50~90nt/sRNA合成方向5'→3'RNA聚合酶沿模板鏈從3'→5'移動(dòng)DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化6AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板DNAAUCOOO5pppOppp~~AOHpp~~OHGOpOHpp~~UOpOHRNA聚合酶在引物3-OH上添加單核苷酸催化機(jī)理：進(jìn)位的NTP受活性中心模板上堿基限制：互補(bǔ)原則決定進(jìn)位的核苷三磷酸和被添加在3-端的核苷酸種類。進(jìn)位后聚合酶作用下形成3-磷酸酯鍵，單核苷酸被添加上。RNA聚合酶活性中心AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板7用于指導(dǎo)RNA合成的鏈叫模板鏈，也稱為負(fù)鏈或無(wú)意義鏈。互補(bǔ)于模板鏈的DNA鏈叫非模板鏈，也叫正鏈或有意義鏈。5'GACAACTTGAGAACCG3'非模板鏈（編碼鏈）3'CTGTTGAACTCTTGGC5'

模板鏈5'AACUUGAGAA3'←RNA二、模板鏈與非模板鏈DNA用于指導(dǎo)RNA合成互補(bǔ)于模板鏈的DNA鏈5'GACAACTT8RNA聚合酶全酶：亞基基因相對(duì)分子量組分功能αββ′σrpoArpoBrpoCrpoDrpoE

4.0×1041.55

×105

1.6×105

8.5×104

1.1×104核心酶核心酶核心酶σ因子結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合核苷酸結(jié)合膜板DNA負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始不明每個(gè)分子含5個(gè)亞基：α2ββ

-核心酶(coreenzyme)；σ-起始因子ββ′σ三、E.coliRNA聚合酶的組成與功能特征RNA聚合酶全酶：亞基基因相對(duì)分子量組分功9四、轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程起始RNA聚合酶從起始位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，合成pppNpN后，σ因子解離。延伸由核心酶完成。核心酶延伸核心酶沿DNA模板鏈從3'→5'移動(dòng)在反應(yīng)中心于RNA

3'逐個(gè)添加核苷酸。終止核心酶遇到終止子后，RNA自動(dòng)脫離核心酶或在ρ因子幫助下脫離核心酶，終止合成。四、轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程起始RNA聚合酶從起始位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，合成p10復(fù)制起始:RNA合成起始位點(diǎn)與其上游存在的聚合酶識(shí)別位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)成的特有DNA序列。DNA模板鏈對(duì)RNA合成起指導(dǎo)作用的第一個(gè)堿基計(jì)為+1區(qū)；也叫起始位點(diǎn)；在編碼鏈中一般為A或G。5'GCCAUGAATTGACACCAGAGCCGGAAAGAACATATAATCACCACACCAACGA3'DNA編碼鏈起始位點(diǎn)正區(qū)負(fù)區(qū)下游上游-10區(qū)(稱為Pribnow框σ70因子緊密結(jié)合區(qū))-35區(qū)(識(shí)別區(qū)，即σ70因子識(shí)別結(jié)合區(qū))啟動(dòng)子：DNA分子中用于轉(zhuǎn)錄起始的三個(gè)特殊堿基序列構(gòu)成。σ核心酶pppApN3'OHRNA合成起始，σ脫離核心酶，后續(xù)的RNA合成由核心酶完成復(fù)制起始:RNA合成起始位點(diǎn)與其上游存在的聚合酶識(shí)別位點(diǎn)、結(jié)11大腸桿菌σ因子的編碼基因及啟動(dòng)子的特征σ70σ32σ54起始因子啟動(dòng)基因功能－35區(qū)核心序列序列長(zhǎng)度－10區(qū)核心序列rpoDrpoHrpoNTTGACATCTCNCCCTTGAACTGGNA許多熱休克參與氮代謝16~1813~156TATAATCCCATNTATTGCA大腸桿菌σ因子的編碼基因及啟動(dòng)子的特征σ70σ32σ54起始12因子被啟動(dòng)基因功能－35區(qū)間距－10區(qū)

σ70

rpoD許多TTGACA

16~18σ32

rpoH熱休克TCTCNCCCTTGAA

13~15σ54

rpoN

參與氮代謝

CTGGNA

6因子被啟動(dòng)基因功能－35區(qū)13RNA合成的終止真核生物中轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程仍不清楚，在E.coli染色體DNA中已知的至少有兩種終止信號(hào)：1、具有轉(zhuǎn)錄成自身互補(bǔ)序列的區(qū)域，它能在RNA鏈末端之前15~20個(gè)核苷酸為中心處形成一個(gè)發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠的形成能打斷轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的RNA-DNA雜交部分，使RNA從整個(gè)復(fù)合物解離。不依賴于ρ因子的終止子有兩個(gè)特性：①依賴于ρ因子(蛋白質(zhì))的終止子；②不依賴于ρ因子的終止子。RNA合成的終止真核生物中轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程仍不清楚，在E.col142、由模板鏈上polyA轉(zhuǎn)錄而成的RNA3′端具有polyU序列RNA-polyU與DNA-polyA結(jié)合很不穩(wěn)定，很容易從模板DNA上解離而終止合成。CCCACACCCGGCGCCTAATGAGCGCCGATTTTTTTTGGGTGTGGGCCGCGGATTAGTCGCGGCTAAAAAAA3355回文結(jié)構(gòu)富含GC區(qū)模板鏈轉(zhuǎn)錄方向UUUUUUUUpolyUAAUUGAC3'OH5'富含G∶CCGCGGCGCGCCGCCA發(fā)夾結(jié)構(gòu)ACUGAGGA非polyUAAUUGAC3'OH5'不富含G:CAGAUGAUCUACUCCA發(fā)夾結(jié)構(gòu)不依賴于ρ因子的終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄的RNA依賴于ρ因子的終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄的RNA富含AT區(qū)2、由模板鏈上polyA轉(zhuǎn)錄而成的RNA3′端具有polyU155'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5'不依賴于ρ因子的終止信號(hào)終止過(guò)程UUUUUU不依賴于ρ因子終止信號(hào)中的polyU與模板結(jié)合疏松，會(huì)使得RNA與模板結(jié)合不牢固很容易從復(fù)合體解離。依賴于ρ因子的終止信號(hào)則沒(méi)有polyU，因此需要ρ因子幫助才能使合成的RAN從核心酶上脫落。ρ因子能沿著RNA從5'3'滑動(dòng)至核心酶中心，使合成的RNA從模板上解離。UUUUUU5'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5165'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'5'依賴于ρ因子的終止信號(hào)終止過(guò)程不依賴于ρ因子終止信號(hào)中的polyU與模板結(jié)合疏松，會(huì)使得RNA與模板結(jié)合不牢固很容易從復(fù)合體解離。依賴于ρ因子的終止信號(hào)則沒(méi)有polyU，需要ρ因子幫助才能使合成的RAN從核心酶上脫落。ρ因子能沿著RNA從5'3'滑動(dòng)至核心酶中心，使合成的RNA從模板上解離。GCUAUC5'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'517第二節(jié)真核生物核的RNA合成負(fù)責(zé)核糖體rRNA18S、5.8S、28S的前體合成1.全酶結(jié)構(gòu)比原核生物的復(fù)雜，起始因子(σ因子)種類多；2.已發(fā)現(xiàn)的有聚合酶有三種；合成過(guò)程與原核細(xì)胞基本相同；3.線粒體中具有不同于原核生物中的RNA聚合酶(小分子)。一、真核生物RNA聚合酶特點(diǎn)主要功能ⅠⅡⅢ-1RNApolase合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA合成5srRNA前體和一些小RNA前體存在核仁核質(zhì)核質(zhì)Ⅲ-2合成tRNA前體核質(zhì)第二節(jié)真核生物核的RNA合成負(fù)責(zé)核糖體rRNA18S、518二、真核細(xì)胞與原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄主要區(qū)別1.真核細(xì)胞中RNA聚合酶為聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并具有高度的分工，不同的聚合酶負(fù)責(zé)合成不同的RNA。2.真核細(xì)胞啟動(dòng)子比原核細(xì)胞啟動(dòng)子更復(fù)雜和更多樣性，不同的RNA聚合酶能識(shí)別不同的啟動(dòng)子。RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別識(shí)別Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類啟動(dòng)子。RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的Ⅱ類啟動(dòng)子主要包括4個(gè)部位：堿基大多數(shù)為A-T堿基對(duì)－25區(qū)富含AT的7個(gè)核苷酸。類似于原核啟動(dòng)子－10區(qū)的Pribnow。－75區(qū)的共有序列:GGNCAATCT，其中N為C或T。－100或更遠(yuǎn)的、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄速率的短在序列。轉(zhuǎn)錄起始部位:TATA框(TATAbox):CAAT框(CAATbox):增強(qiáng)子(enhancer):二、真核細(xì)胞與原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄主要區(qū)別1.真核細(xì)胞中RNA聚合酶19RNApolaseⅡ合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA核質(zhì)真核生物RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)序列TATAAA起始位點(diǎn)5'3'GGCCAATCT+1區(qū)起始位點(diǎn)上游或下游附近特殊的序列啟動(dòng)子-75區(qū)-25區(qū)3.原核細(xì)胞靠RNA聚合酶本身識(shí)別啟動(dòng)子，而真核細(xì)胞的RNA無(wú)法識(shí)別啟動(dòng)子，要靠轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)識(shí)別啟動(dòng)子。RNApolaseⅡ合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA核20轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)是指參與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的一類功能蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子的功能是與啟動(dòng)子結(jié)合，通過(guò)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，將RNA聚合酶錨于啟動(dòng)子處，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)于RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，分別稱為TFⅠ、TFⅡ和TFⅢ。其中TFⅡ種類較多，功能復(fù)雜，但研究也較深入?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TFⅡA、TFⅡB、TFⅡC、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH、TFⅡJ等。TF(transcriptionfactor)的功能:TF(transcriptionfactor)的種類:TFA-J是能識(shí)別結(jié)合TATA序列附近的蛋白質(zhì)因子，稱為通用轉(zhuǎn)錄因子(generalfactors,GTF)，或稱為基本轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscription)。轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)21通用轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscriptionalactivators)可以與啟動(dòng)子附近或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的順式原件結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝過(guò)程。這些因子有明顯的DNA結(jié)合域和激活轉(zhuǎn)錄所需要的激活結(jié)構(gòu)域。啟動(dòng)子特異轉(zhuǎn)錄激活因子(promoter-specfictranscriptionalactivators)通用基因轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)確起始必須因子，即在一般情況下他們都參與基因組成性表達(dá)。通用基因：糖一般代謝、脂類一般代謝、蛋白質(zhì)一般代謝所有酶等蛋白質(zhì)的編碼基因。這些特異性轉(zhuǎn)錄因子在受生物脅迫(病源菌侵入)或非生物脅迫(熱擊、冷害、干旱、重金屬毒害)時(shí)，才會(huì)調(diào)節(jié)和控制某些基因表達(dá)。即調(diào)控基因上游應(yīng)答元件，如熱擊應(yīng)答元件(heatshockresponseelement,HSE)、金屬應(yīng)答原件(metalresponseelement，MRE)等。通用轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscriptionala22TATA(關(guān)鍵亞基TBP)框結(jié)合蛋白與TFⅡD結(jié)合，穩(wěn)定TFD與TATA結(jié)合橋連蛋白:是TBP與TFⅡF-polⅡ結(jié)合的橋梁真核polⅡ在轉(zhuǎn)錄因子作用下形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物過(guò)程:5'3'TATAAA起始位點(diǎn)GGCCAATCTTFⅡD(TBP)TFⅡATFⅡBTFⅡHTFⅡJpolⅡTFⅡFTFⅡETATA(關(guān)鍵亞基TBP)框結(jié)合蛋白與TFⅡD結(jié)合，穩(wěn)定TF23真核生物RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄過(guò)程所需的轉(zhuǎn)錄因子組成及功能轉(zhuǎn)錄因子亞基數(shù)Mr(kd)功能起始階段RNA聚合酶Ⅱ1210~22催化RNA合成TBP（TATA盒138專門識(shí)別TATA盒子結(jié)合蛋白）TFⅡA312，19，35穩(wěn)定TFⅡB和TFP對(duì)啟動(dòng)子的結(jié)合TFⅡB135結(jié)合于TFP；組裝PolⅡ-TFⅡF復(fù)合物TFⅡD1215~25能與正調(diào)節(jié)、負(fù)調(diào)節(jié)蛋白相互作用TFⅡE234，57組裝TFⅡH；ATP和解旋酶活性TFⅡF230，74緊密結(jié)合于PolⅡ，結(jié)合TFⅡB，防止RNA聚合酶結(jié)合于非特異DNA順序TFⅡH1235~89啟動(dòng)子DNA解螺旋，磷酸化RNA聚合酶，組裝核苷酸切割修復(fù)復(fù)合物；真核生物RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄過(guò)程所需的轉(zhuǎn)錄因子組成及功能轉(zhuǎn)錄因24順式作用元件(cis-actingelement)，亦稱應(yīng)答元件(responseelement)。這些元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(enhancer)、和沉默子(silencer)等。4.真核生物的轉(zhuǎn)錄受許多特定的順式作用元件(cis-actingelement)和反式作用因子(trans-actingfactors)的影響。順式作用元件的本質(zhì)是存在啟動(dòng)子附近的短在DNA特有序列，對(duì)于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和調(diào)控產(chǎn)生影響的核苷酸序列。順式作用元件TATAAA起始位點(diǎn)-25區(qū)TATA盒子能控制轉(zhuǎn)錄的忠實(shí)性。5'3'GGCCAATCT-75區(qū)CAAT框能決定轉(zhuǎn)錄的起始頻率。+1區(qū)調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性決定啟動(dòng)頻率也決定打開(kāi)或沉默。順式作用元件只有與反式作用因子(特有蛋白質(zhì))結(jié)合才能對(duì)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)頻率或速度產(chǎn)生影響。下游上游順式作用元件(cis-actingelement)，亦稱應(yīng)25增強(qiáng)子增強(qiáng)子(enhancer)位于上游，距離起點(diǎn)至少100bp以上，是一種遠(yuǎn)程控制元件，又稱為上游激活序列(upstreamactivatorsequence,UAS)，它通過(guò)啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄頻率。增強(qiáng)子區(qū)由8～12bp的“核心”元件組成，共有序列為：TGGAAAG/TA/TA/T增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)一般特點(diǎn):一般具有完整或部分回文序列結(jié)構(gòu)，并以單拷貝或多拷貝的形式存在；通常距離+1區(qū)1～4kb，甚至在+1區(qū)的3kb之外起作用。增強(qiáng)子增強(qiáng)子(enhancer)位于上游，距離起點(diǎn)至少10026近年來(lái)已經(jīng)證明，UAS通過(guò)以下方式起作用：影響超螺旋密度，使DNA雙螺旋彎曲，改變模板的整體結(jié)構(gòu)，便于轉(zhuǎn)錄起始。通過(guò)增強(qiáng)子可把模板固定在細(xì)胞內(nèi)特定的位置，如連接在核基質(zhì)上，以利于拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA雙螺旋的張力，促進(jìn)RNApolyⅡ在DNA鏈上結(jié)合滑動(dòng)?？蔀镽NApolyⅡ或其他重要蛋白質(zhì)因子提供與染色質(zhì)結(jié)合的“進(jìn)入位點(diǎn)”。近年來(lái)已經(jīng)證明，UAS通過(guò)以下方式起作用：影響超螺旋密度，27第三節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄后加工原核生物mRNA一經(jīng)轉(zhuǎn)錄不需要加工、修飾就具有模板活性，但是tRNA和rRNA的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均需要經(jīng)過(guò)一系列加工，才能成為活性分子。主要包括剪切、剪接形成5'-端和3'-端的特殊結(jié)構(gòu)、堿基修飾、改變糖苷酸等過(guò)程。1.原核rRNA前體的加工E.Coli的rRNA前體分子沉降系數(shù)為30S(P30)，大約含6300個(gè)核苷酸殘基。需要經(jīng)過(guò)修飾、剪切、剪接形成16SrRNA、23SrRNA和幾個(gè)tRNA。整個(gè)過(guò)程可以簡(jiǎn)單圖示如下：第三節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄后加工原核生物mRNA2816SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1)甲級(jí)化作用(2)RNaseⅢⅢⅢⅢ(3)RNaseEEE剪切16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNAP16Per-tRNAP23P530SRNA專一核酸酶內(nèi)切酶甲級(jí)化常見(jiàn)形式2'-甲級(jí)核糖16SrRNA特有甲級(jí)化N4,2‘-O-甲級(jí)胞嘧啶(m4Cm)16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1292.原核tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工E.Coli染色體基因組共有tRNA的基因約60個(gè)，除少數(shù)幾個(gè)與rRNA一起轉(zhuǎn)錄，其余的大多數(shù)成族排列，轉(zhuǎn)錄成含兩個(gè)或多個(gè)tRNA的前體，再進(jìn)行加工。tRNA前體加工包括：①核酸內(nèi)切酶剪切；②核酸外切酶從3'-端逐個(gè)切去附加順序，進(jìn)行修剪；③在tRNA3'-端添加CCCA-3'OH；④核苷酸的修飾和異構(gòu)化。RNase與DNA內(nèi)切酶不同，RNase不能識(shí)別特異序列，它所識(shí)別的是加工部位的空間結(jié)構(gòu)。Per-tRNA加工、修飾工程簡(jiǎn)圖示意如下：2.原核tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工E.Coli染色體基因組共有30RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseFRNaseD異構(gòu)化酶異構(gòu)化酶CCA3'-OHCCA3'-OHtRNA前體加工過(guò)程中的核酸內(nèi)切酶RNaseP能切出成熟5'-端的內(nèi)切酶RNaseF加工tRNA3'-端的核酸內(nèi)切酶RNaseDtRNA3'-端成熟的核酸外切酶tRNA核苷?；D(zhuǎn)移酶per-tRNACCA3'-OH5'加工修飾RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseF31二、真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工1.前體mRNA的加工原核生物大多數(shù)是含有幾個(gè)遺傳信息的多順?lè)醋觤RNA，僅有少數(shù)為單順?lè)醋觤RNA，由于轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程偶聯(lián)所以大多數(shù)原核生物mRNA大多不需要加工就直接進(jìn)入翻譯階段。只有少數(shù)多順?lè)醋觤RNA需要加工，即需要剪切成小單位后，再進(jìn)行翻譯。真核生物的基因在DNA上是間隔排列的，這稱為斷裂基因。但是轉(zhuǎn)錄時(shí)間隔部分是被一起轉(zhuǎn)錄成前體RNA，必須經(jīng)過(guò)剪切和剪接以除去內(nèi)含子序列，轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA后，才能進(jìn)一步實(shí)施后續(xù)的蛋白質(zhì)翻譯。3'-端添加polyA，5'-端戴帽，堿基甲級(jí)化修飾等。二、真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工1.前體mRNA的加工原核生物大多數(shù)32mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或完成后在核內(nèi)進(jìn)行5'端加帽子外顯子內(nèi)含子外顯子m7Gppp核內(nèi)3'端加多聚A尾，胞質(zhì)中也有相應(yīng)酶系，還可以繼續(xù)延長(zhǎng)尾巴m7GpppAA(A)Na-OHmRNA前體剪切去除內(nèi)含子，拼接外顯子m7GpppAA(A)aA-OH轉(zhuǎn)運(yùn)核質(zhì)胞質(zhì)可翻譯的mRNAm7GpppAA(A)aA-OH成熟的mRNA核膜孔甲基化，RNA編輯mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或完成后在核內(nèi)進(jìn)行5'端加帽子外332.前體rRNA加工rRNA基因是多拷貝的，如原核生物基因中rNRA基因有5～10拷貝；真核生物中rNRA拷貝數(shù)更多，如果蠅為260拷貝。而且rRNA基因是由非轉(zhuǎn)錄區(qū)(spacer)將它們間隔開(kāi)來(lái)。在每一個(gè)rRNA基因內(nèi)，包含3～4段rRNA的編碼區(qū)，其間也有間隔區(qū)。間隔區(qū)有一些是無(wú)轉(zhuǎn)錄功能的，另有一些間隔區(qū)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是tRNA。16SrRNAtRNA23SrRNAtRNA5SrRNA3'5'RNase5'3'RNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本核酸酶5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'16SrRNAtRNA23SrRNAtRNA5SrRNARNAs前體成熟RNAs2.前體rRNA加工rRNA基因是多拷貝的，如原核生物基因34第四節(jié)以RNA為模板的DNA和RNA合成一、逆(反)轉(zhuǎn)錄酶一些感染動(dòng)物細(xì)胞的病毒含有存在與病毒顆粒中的反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)，這是一種依賴RNA的DNA聚合酶。感染后，單鏈RNA病毒基因組(約10000核苷酸長(zhǎng))和酶一起進(jìn)入宿主細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄酶催化互補(bǔ)于病毒的一條DNA鏈的合成，形成RNA-DNA雜種分子，該酶同時(shí)能降解其中的RNA鏈，進(jìn)一步合成另一條DNA鏈。雙鏈DNA經(jīng)常被整合入真核細(xì)胞的基因組中。在一定條件下該基因可被激活和轉(zhuǎn)錄，它的基因產(chǎn)物--病毒蛋白和病毒RNA一起包裝產(chǎn)生新的病毒。含有逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒叫逆病毒。RNA逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)翻譯DNA復(fù)制復(fù)制第四節(jié)以RNA為模板的DNA和RNA合成一、逆(反)轉(zhuǎn)35逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(RNaseH)病毒RNA3'5'①依賴RNA的DNA聚合作用②降解RNA-DNA雜種分子中的RNA(即RNaseH活性)③依賴DNA的DNA聚合活性整合到寄主DNA中，適當(dāng)?shù)臈l件下激活而病變病毒RNA3'5'5'cDNA3'cDNA3'5'3'5'cDNA5'3'5'3'逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(RNaseH)病毒RNA3'5'①依賴RN36二、逆轉(zhuǎn)錄病毒引起癌癥或愛(ài)滋病癌癥發(fā)病的分子機(jī)制研究證明，逆病毒起著重要的作用。絕大多數(shù)逆病毒不殺傷它們的寄主細(xì)胞，它們整合到細(xì)胞DNA上并隨之一起復(fù)制。然而，一些病毒有一額外的基因可使細(xì)胞癌變(生長(zhǎng)異常)。這種病毒被歸類為RNA腫瘤病毒。PeytonRaous第一個(gè)研究的逆病毒是雞肉瘤病毒(命名為勞氏肉瘤病毒)，這種病毒和其他腫瘤病毒中的導(dǎo)致腫瘤的基因叫做致癌基因(oncongen)。自從HaroldVarmus＆Michael

Bishop發(fā)現(xiàn)致癌基因以來(lái)，在逆病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)十幾種不同的這類基因。人類獲得性免疫缺陷病毒(humanimmunondeficience

virus,HIV)。這種艾滋病(AIDS病)的致病因子也是一種逆病毒。HIV殺死淋巴細(xì)胞，逐漸導(dǎo)致寄主免疫系統(tǒng)的抑制，而不是引起腫瘤，大部分治療HIV感染的個(gè)體所用的藥物的靶子是反轉(zhuǎn)錄酶。二、逆轉(zhuǎn)錄病毒引起癌癥或愛(ài)滋病癌癥發(fā)病的分子機(jī)制研究證明，逆371、E.coliRNA聚合酶全酶：α2ββ'σ，既能識(shí)別啟動(dòng)子，又能起始合成，不需要引物，合成起始后σ因子脫離核心酶，后續(xù)的延伸由核心酶完成；模板鏈起指導(dǎo)作用，合成的RNA與編碼鏈內(nèi)容相同(只是U代替了T)鏈延伸方向5'→3'(與復(fù)制相同)。小結(jié)2、轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)：選擇性①DNA分子只有一條鏈用作模板指導(dǎo)RNA合成，合成的RNA與模板鏈堿基互補(bǔ)，而與編碼鏈的堿基內(nèi)容和順序相同；②特定的時(shí)間只有一定的基因被轉(zhuǎn)錄；③轉(zhuǎn)錄的選擇性原理已成為基因反義技術(shù)的內(nèi)容。3、原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是DNA分子中起始位點(diǎn)－10~－35區(qū)的一段特定的核苷酸序列，該序列能被RNA全酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。1、E.coliRNA聚合酶全酶：α2ββ'σ，既能識(shí)別啟38足跡法：利用DNA序列分析原理建立的一種DNA特定序列或基因檢測(cè)技術(shù)。32P32P①DNA一條鏈末端被放射性標(biāo)記的溶液(如32P-DNA)加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶②同種溶液分成兩份限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶③保溫、酶切④變性、電泳③保溫、酶切④變性、電泳當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合DNA后，限制性內(nèi)切酶的一些切割位點(diǎn)被遮蓋，切割次數(shù)減少，相比較溶液中缺少某些長(zhǎng)度的DNA。酶作用結(jié)果酶作用結(jié)果＋－PAGE放射自顯影DNA遷移方向失去的區(qū)帶，表明是RNA聚合酶結(jié)合DNA的位點(diǎn)加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶失去的區(qū)帶，表明是RNA聚合酶結(jié)合DNA的位點(diǎn)失去的區(qū)帶，表明是RNA聚合酶結(jié)合DNA的位點(diǎn)被結(jié)合蛋白保護(hù)的樣品在電泳圖缺少的譜帶處留下空白，即所謂的“足跡”。用這種方法可了解RNA聚合酶結(jié)合的DNA順序足跡法：利用DNA序列分析原理建立的一種DNA特定序列或基因39對(duì)于一個(gè)特定的基因來(lái)說(shuō)，編碼鏈可以是給定染色體DNA雙鏈中的任意一條。3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'編碼編碼編碼編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA基因與DNA：①原核細(xì)胞、病毒DNA中基因可重疊；②生物體系基因轉(zhuǎn)錄具有不對(duì)稱性：被打開(kāi)的DNA轉(zhuǎn)錄時(shí)只是DNA分子中的一條鏈起模板作用；但另一條鏈也會(huì)反向編碼另一種RNA，或從另一處啟動(dòng)正向編碼一種RNA。重疊基因：兩條鏈不同時(shí)期分別作模板對(duì)于一個(gè)特定的基因來(lái)說(shuō)，編碼鏈可以是給定染色體DNA3'540內(nèi)容概要：第一節(jié)依賴DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二、模板鏈與非模板鏈三、E.coliRNA聚合酶的組成與功能特征四、轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程第二節(jié)RNA合成的起始小結(jié)第三節(jié)RNA合成的終止第四節(jié)真核生物細(xì)胞核RNA聚合酶第六節(jié)以RNA為模板的DNA和RNA合成第五節(jié)新生RNA的剪切和修飾第十二章RNA的生物合成內(nèi)容概要：第一節(jié)依賴DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二41引言生物遺傳信息傳遞的化學(xué)本質(zhì)，在分子水平看就是：DNARNA復(fù)制本質(zhì)：遺傳信息全部傳遞給子代DNA分子。隨分裂DNA進(jìn)入子細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)控制生長(zhǎng)發(fā)育。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者，不同時(shí)期DNA表達(dá)不同蛋白質(zhì)從而控制整個(gè)生命活動(dòng)過(guò)程。在生物體體系DNA如何指導(dǎo)RNA合成？引言生物遺傳信息傳遞的化學(xué)本質(zhì)，在分子水平看就42第一節(jié)原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合成的酶RNA聚合酶全稱：依賴DNA的RNA聚合酶(DNA-dependentRNApolymerase)，簡(jiǎn)稱RNA聚合酶(RNApolymerase)。又稱為轉(zhuǎn)錄酶(transcriptase)。n1ATPn2GTPn3CTPn4UTPDNA(模板)，Mg2+RNA聚合酶RNA+(n1+n2+n3+n4)PPiRNA聚合酶催化如下的反應(yīng):RNA合成中底物或原料第一節(jié)原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合43轉(zhuǎn)錄最大特點(diǎn)：信息傳遞具有選擇性①轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA兩條鏈中只有其中一條鏈作模板；因?yàn)檗D(zhuǎn)錄的RNA只能與變性DNA中的一條鏈形成雜種分子。②轉(zhuǎn)錄的RNA僅拷貝了DNA中的某個(gè)片段的信息(部分功能單位-基因)；處于轉(zhuǎn)錄過(guò)程的DNA和正在被合成的RNA用圖示意如下:新合成RNA模板鏈非模板鏈轉(zhuǎn)錄最大特點(diǎn)：信息傳遞具有選擇性①轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA兩條鏈中只有其44歷時(shí)近半個(gè)世紀(jì)已經(jīng)解決的基本問(wèn)題：1、RNA聚合酶如何催化RNA合成？2、此時(shí)此刻被轉(zhuǎn)錄的信息由誰(shuí)來(lái)識(shí)別？3、RNA合成基本過(guò)程如何？

Uchoa(西班牙)＆Kornberg因基因表達(dá)研究富有成果分享1959年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；

1965年Jacob＆Monod(法)提出并證實(shí)操縱子學(xué)說(shuō)與woff分享諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；

1975年Tiemin＆Baltimore由于發(fā)現(xiàn)腫瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；歷時(shí)近半個(gè)世紀(jì)已經(jīng)解決的基本問(wèn)題：1、RNA聚合酶如何催化R45DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過(guò)程:轉(zhuǎn)錄泡~17bp模板鏈(非編碼鏈)RNA5'非模板鏈(編碼鏈)RNA-DNA雜螺旋活性位點(diǎn)：RNA3′端逐個(gè)添加NMP；速度：50~90nt/sRNA合成方向5'→3'RNA聚合酶沿模板鏈從3'→5'移動(dòng)DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化46AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板DNAAUCOOO5pppOppp~~AOHpp~~OHGOpOHpp~~UOpOHRNA聚合酶在引物3-OH上添加單核苷酸催化機(jī)理：進(jìn)位的NTP受活性中心模板上堿基限制：互補(bǔ)原則決定進(jìn)位的核苷三磷酸和被添加在3-端的核苷酸種類。進(jìn)位后聚合酶作用下形成3-磷酸酯鍵，單核苷酸被添加上。RNA聚合酶活性中心AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板47用于指導(dǎo)RNA合成的鏈叫模板鏈，也稱為負(fù)鏈或無(wú)意義鏈。互補(bǔ)于模板鏈的DNA鏈叫非模板鏈，也叫正鏈或有意義鏈。5'GACAACTTGAGAACCG3'非模板鏈（編碼鏈）3'CTGTTGAACTCTTGGC5'

模板鏈5'AACUUGAGAA3'←RNA二、模板鏈與非模板鏈DNA用于指導(dǎo)RNA合成互補(bǔ)于模板鏈的DNA鏈5'GACAACTT48RNA聚合酶全酶：亞基基因相對(duì)分子量組分功能αββ′σrpoArpoBrpoCrpoDrpoE

4.0×1041.55

×105

1.6×105

8.5×104

1.1×104核心酶核心酶核心酶σ因子結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合核苷酸結(jié)合膜板DNA負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始不明每個(gè)分子含5個(gè)亞基：α2ββ

-核心酶(coreenzyme)；σ-起始因子ββ′σ三、E.coliRNA聚合酶的組成與功能特征RNA聚合酶全酶：亞基基因相對(duì)分子量組分功49四、轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程起始RNA聚合酶從起始位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，合成pppNpN后，σ因子解離。延伸由核心酶完成。核心酶延伸核心酶沿DNA模板鏈從3'→5'移動(dòng)在反應(yīng)中心于RNA

3'逐個(gè)添加核苷酸。終止核心酶遇到終止子后，RNA自動(dòng)脫離核心酶或在ρ因子幫助下脫離核心酶，終止合成。四、轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程起始RNA聚合酶從起始位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，合成p50復(fù)制起始:RNA合成起始位點(diǎn)與其上游存在的聚合酶識(shí)別位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)成的特有DNA序列。DNA模板鏈對(duì)RNA合成起指導(dǎo)作用的第一個(gè)堿基計(jì)為+1區(qū)；也叫起始位點(diǎn)；在編碼鏈中一般為A或G。5'GCCAUGAATTGACACCAGAGCCGGAAAGAACATATAATCACCACACCAACGA3'DNA編碼鏈起始位點(diǎn)正區(qū)負(fù)區(qū)下游上游-10區(qū)(稱為Pribnow框σ70因子緊密結(jié)合區(qū))-35區(qū)(識(shí)別區(qū)，即σ70因子識(shí)別結(jié)合區(qū))啟動(dòng)子：DNA分子中用于轉(zhuǎn)錄起始的三個(gè)特殊堿基序列構(gòu)成。σ核心酶pppApN3'OHRNA合成起始，σ脫離核心酶，后續(xù)的RNA合成由核心酶完成復(fù)制起始:RNA合成起始位點(diǎn)與其上游存在的聚合酶識(shí)別位點(diǎn)、結(jié)51大腸桿菌σ因子的編碼基因及啟動(dòng)子的特征σ70σ32σ54起始因子啟動(dòng)基因功能－35區(qū)核心序列序列長(zhǎng)度－10區(qū)核心序列rpoDrpoHrpoNTTGACATCTCNCCCTTGAACTGGNA許多熱休克參與氮代謝16~1813~156TATAATCCCATNTATTGCA大腸桿菌σ因子的編碼基因及啟動(dòng)子的特征σ70σ32σ54起始52因子被啟動(dòng)基因功能－35區(qū)間距－10區(qū)

σ70

rpoD許多TTGACA

16~18σ32

rpoH熱休克TCTCNCCCTTGAA

13~15σ54

rpoN

參與氮代謝

CTGGNA

6因子被啟動(dòng)基因功能－35區(qū)53RNA合成的終止真核生物中轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程仍不清楚，在E.coli染色體DNA中已知的至少有兩種終止信號(hào)：1、具有轉(zhuǎn)錄成自身互補(bǔ)序列的區(qū)域，它能在RNA鏈末端之前15~20個(gè)核苷酸為中心處形成一個(gè)發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠的形成能打斷轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的RNA-DNA雜交部分，使RNA從整個(gè)復(fù)合物解離。不依賴于ρ因子的終止子有兩個(gè)特性：①依賴于ρ因子(蛋白質(zhì))的終止子；②不依賴于ρ因子的終止子。RNA合成的終止真核生物中轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程仍不清楚，在E.col542、由模板鏈上polyA轉(zhuǎn)錄而成的RNA3′端具有polyU序列RNA-polyU與DNA-polyA結(jié)合很不穩(wěn)定，很容易從模板DNA上解離而終止合成。CCCACACCCGGCGCCTAATGAGCGCCGATTTTTTTTGGGTGTGGGCCGCGGATTAGTCGCGGCTAAAAAAA3355回文結(jié)構(gòu)富含GC區(qū)模板鏈轉(zhuǎn)錄方向UUUUUUUUpolyUAAUUGAC3'OH5'富含G∶CCGCGGCGCGCCGCCA發(fā)夾結(jié)構(gòu)ACUGAGGA非polyUAAUUGAC3'OH5'不富含G:CAGAUGAUCUACUCCA發(fā)夾結(jié)構(gòu)不依賴于ρ因子的終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄的RNA依賴于ρ因子的終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄的RNA富含AT區(qū)2、由模板鏈上polyA轉(zhuǎn)錄而成的RNA3′端具有polyU555'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5'不依賴于ρ因子的終止信號(hào)終止過(guò)程UUUUUU不依賴于ρ因子終止信號(hào)中的polyU與模板結(jié)合疏松，會(huì)使得RNA與模板結(jié)合不牢固很容易從復(fù)合體解離。依賴于ρ因子的終止信號(hào)則沒(méi)有polyU，因此需要ρ因子幫助才能使合成的RAN從核心酶上脫落。ρ因子能沿著RNA從5'3'滑動(dòng)至核心酶中心，使合成的RNA從模板上解離。UUUUUU5'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5565'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'5'依賴于ρ因子的終止信號(hào)終止過(guò)程不依賴于ρ因子終止信號(hào)中的polyU與模板結(jié)合疏松，會(huì)使得RNA與模板結(jié)合不牢固很容易從復(fù)合體解離。依賴于ρ因子的終止信號(hào)則沒(méi)有polyU，需要ρ因子幫助才能使合成的RAN從核心酶上脫落。ρ因子能沿著RNA從5'3'滑動(dòng)至核心酶中心，使合成的RNA從模板上解離。GCUAUC5'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'557第二節(jié)真核生物核的RNA合成負(fù)責(zé)核糖體rRNA18S、5.8S、28S的前體合成1.全酶結(jié)構(gòu)比原核生物的復(fù)雜，起始因子(σ因子)種類多；2.已發(fā)現(xiàn)的有聚合酶有三種；合成過(guò)程與原核細(xì)胞基本相同；3.線粒體中具有不同于原核生物中的RNA聚合酶(小分子)。一、真核生物RNA聚合酶特點(diǎn)主要功能ⅠⅡⅢ-1RNApolase合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA合成5srRNA前體和一些小RNA前體存在核仁核質(zhì)核質(zhì)Ⅲ-2合成tRNA前體核質(zhì)第二節(jié)真核生物核的RNA合成負(fù)責(zé)核糖體rRNA18S、558二、真核細(xì)胞與原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄主要區(qū)別1.真核細(xì)胞中RNA聚合酶為聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并具有高度的分工，不同的聚合酶負(fù)責(zé)合成不同的RNA。2.真核細(xì)胞啟動(dòng)子比原核細(xì)胞啟動(dòng)子更復(fù)雜和更多樣性，不同的RNA聚合酶能識(shí)別不同的啟動(dòng)子。RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別識(shí)別Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類啟動(dòng)子。RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的Ⅱ類啟動(dòng)子主要包括4個(gè)部位：堿基大多數(shù)為A-T堿基對(duì)－25區(qū)富含AT的7個(gè)核苷酸。類似于原核啟動(dòng)子－10區(qū)的Pribnow。－75區(qū)的共有序列:GGNCAATCT，其中N為C或T。－100或更遠(yuǎn)的、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄速率的短在序列。轉(zhuǎn)錄起始部位:TATA框(TATAbox):CAAT框(CAATbox):增強(qiáng)子(enhancer):二、真核細(xì)胞與原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄主要區(qū)別1.真核細(xì)胞中RNA聚合酶59RNApolaseⅡ合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA核質(zhì)真核生物RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)序列TATAAA起始位點(diǎn)5'3'GGCCAATCT+1區(qū)起始位點(diǎn)上游或下游附近特殊的序列啟動(dòng)子-75區(qū)-25區(qū)3.原核細(xì)胞靠RNA聚合酶本身識(shí)別啟動(dòng)子，而真核細(xì)胞的RNA無(wú)法識(shí)別啟動(dòng)子，要靠轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)識(shí)別啟動(dòng)子。RNApolaseⅡ合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA核60轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)是指參與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的一類功能蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子的功能是與啟動(dòng)子結(jié)合，通過(guò)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，將RNA聚合酶錨于啟動(dòng)子處，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)于RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，分別稱為TFⅠ、TFⅡ和TFⅢ。其中TFⅡ種類較多，功能復(fù)雜，但研究也較深入。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TFⅡA、TFⅡB、TFⅡC、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH、TFⅡJ等。TF(transcriptionfactor)的功能:TF(transcriptionfactor)的種類:TFA-J是能識(shí)別結(jié)合TATA序列附近的蛋白質(zhì)因子，稱為通用轉(zhuǎn)錄因子(generalfactors,GTF)，或稱為基本轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscription)。轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)61通用轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscriptionalactivators)可以與啟動(dòng)子附近或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的順式原件結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝過(guò)程。這些因子有明顯的DNA結(jié)合域和激活轉(zhuǎn)錄所需要的激活結(jié)構(gòu)域。啟動(dòng)子特異轉(zhuǎn)錄激活因子(promoter-specfictranscriptionalactivators)通用基因轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)確起始必須因子，即在一般情況下他們都參與基因組成性表達(dá)。通用基因：糖一般代謝、脂類一般代謝、蛋白質(zhì)一般代謝所有酶等蛋白質(zhì)的編碼基因。這些特異性轉(zhuǎn)錄因子在受生物脅迫(病源菌侵入)或非生物脅迫(熱擊、冷害、干旱、重金屬毒害)時(shí)，才會(huì)調(diào)節(jié)和控制某些基因表達(dá)。即調(diào)控基因上游應(yīng)答元件，如熱擊應(yīng)答元件(heatshockresponseelement,HSE)、金屬應(yīng)答原件(metalresponseelement，MRE)等。通用轉(zhuǎn)錄因子(basaltranscriptionala62TATA(關(guān)鍵亞基TBP)框結(jié)合蛋白與TFⅡD結(jié)合，穩(wěn)定TFD與TATA結(jié)合橋連蛋白:是TBP與TFⅡF-polⅡ結(jié)合的橋梁真核polⅡ在轉(zhuǎn)錄因子作用下形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物過(guò)程:5'3'TATAAA起始位點(diǎn)GGCCAATCTTFⅡD(TBP)TFⅡATFⅡBTFⅡHTFⅡJpolⅡTFⅡFTFⅡETATA(關(guān)鍵亞基TBP)框結(jié)合蛋白與TFⅡD結(jié)合，穩(wěn)定TF63真核生物RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄過(guò)程所需的轉(zhuǎn)錄因子組成及功能轉(zhuǎn)錄因子亞基數(shù)Mr(kd)功能起始階段RNA聚合酶Ⅱ1210~22催化RNA合成TBP（TATA盒138專門識(shí)別TATA盒子結(jié)合蛋白）TFⅡA312，19，35穩(wěn)定TFⅡB和TFP對(duì)啟動(dòng)子的結(jié)合TFⅡB135結(jié)合于TFP；組裝PolⅡ-TFⅡF復(fù)合物TFⅡD1215~25能與正調(diào)節(jié)、負(fù)調(diào)節(jié)蛋白相互作用TFⅡE234，57組裝TFⅡH；ATP和解旋酶活性TFⅡF230，74緊密結(jié)合于PolⅡ，結(jié)合TFⅡB，防止RNA聚合酶結(jié)合于非特異DNA順序TFⅡH1235~89啟動(dòng)子DNA解螺旋，磷酸化RNA聚合酶，組裝核苷酸切割修復(fù)復(fù)合物；真核生物RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄過(guò)程所需的轉(zhuǎn)錄因子組成及功能轉(zhuǎn)錄因64順式作用元件(cis-actingelement)，亦稱應(yīng)答元件(responseelement)。這些元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(enhancer)、和沉默子(silencer)等。4.真核生物的轉(zhuǎn)錄受許多特定的順式作用元件(cis-actingelement)和反式作用因子(trans-actingfactors)的影響。順式作用元件的本質(zhì)是存在啟動(dòng)子附近的短在DNA特有序列，對(duì)于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和調(diào)控產(chǎn)生影響的核苷酸序列。順式作用元件TATAAA起始位點(diǎn)-25區(qū)TATA盒子能控制轉(zhuǎn)錄的忠實(shí)性。5'3'GGCCAATCT-75區(qū)CAAT框能決定轉(zhuǎn)錄的起始頻率。+1區(qū)調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性決定啟動(dòng)頻率也決定打開(kāi)或沉默。順式作用元件只有與反式作用因子(特有蛋白質(zhì))結(jié)合才能對(duì)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)頻率或速度產(chǎn)生影響。下游上游順式作用元件(cis-actingelement)，亦稱應(yīng)65增強(qiáng)子增強(qiáng)子(enhancer)位于上游，距離起點(diǎn)至少100bp以上，是一種遠(yuǎn)程控制元件，又稱為上游激活序列(upstreamactivatorsequence,UAS)，它通過(guò)啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄頻率。增強(qiáng)子區(qū)由8～12bp的“核心”元件組成，共有序列為：TGGAAAG/TA/TA/T增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)一般特點(diǎn):一般具有完整或部分回文序列結(jié)構(gòu)，并以單拷貝或多拷貝的形式存在；通常距離+1區(qū)1～4kb，甚至在+1區(qū)的3kb之外起作用。增強(qiáng)子增強(qiáng)子(enhancer)位于上游，距離起點(diǎn)至少10066近年來(lái)已經(jīng)證明，UAS通過(guò)以下方式起作用：影響超螺旋密度，使DNA雙螺旋彎曲，改變模板的整體結(jié)構(gòu)，便于轉(zhuǎn)錄起始。通過(guò)增強(qiáng)子可把模板固定在細(xì)胞內(nèi)特定的位置，如連接在核基質(zhì)上，以利于拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA雙螺旋的張力，促進(jìn)RNApolyⅡ在DNA鏈上結(jié)合滑動(dòng)?？蔀镽NApolyⅡ或其他重要蛋白質(zhì)因子提供與染色質(zhì)結(jié)合的“進(jìn)入位點(diǎn)”。近年來(lái)已經(jīng)證明，UAS通過(guò)以下方式起作用：影響超螺旋密度，67第三節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄后加工原核生物mRNA一經(jīng)轉(zhuǎn)錄不需要加工、修飾就具有模板活性，但是tRNA和rRNA的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均需要經(jīng)過(guò)一系列加工，才能成為活性分子。主要包括剪切、剪接形成5'-端和3'-端的特殊結(jié)構(gòu)、堿基修飾、改變糖苷酸等過(guò)程。1.原核rRNA前體的加工E.Coli的rRNA前體分子沉降系數(shù)為30S(P30)，大約含6300個(gè)核苷酸殘基。需要經(jīng)過(guò)修飾、剪切、剪接形成16SrRNA、23SrRNA和幾個(gè)tRNA。整個(gè)過(guò)程可以簡(jiǎn)單圖示如下：第三節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄后加工原核生物mRNA6816SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1)甲級(jí)化作用(2)RNaseⅢⅢⅢⅢ(3)RNaseEEE剪切16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNAP16Per-tRNAP23P530SRNA專一核酸酶內(nèi)切酶甲級(jí)化常見(jiàn)形式2'-甲級(jí)核糖16SrRNA特有甲級(jí)化N4,2‘-O-甲級(jí)胞嘧啶(m4Cm)16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1692.原核tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工E.Coli染色體基因組共有tRNA的基因約60個(gè)，除少數(shù)幾個(gè)與rRNA一起轉(zhuǎn)錄，其余的大多數(shù)成族排列，轉(zhuǎn)錄成含兩個(gè)或多個(gè)tRNA的前體，再進(jìn)行加工。tRNA前體加工包括：①核酸內(nèi)切酶剪切；②核酸外切酶從3'-端逐個(gè)切去附加順序，進(jìn)行修剪；③在tRNA3'-端添加CCCA-3'OH；④核苷酸的修飾和異構(gòu)化。RNase與DNA內(nèi)切酶不同，RNase不能識(shí)別特異序列，它所識(shí)別的是加工部位的空間結(jié)構(gòu)。Per-tRNA加工、修飾工程簡(jiǎn)圖示意如下：2.原核tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工E.Coli染色體基因組共有70RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseFRNaseD異構(gòu)化酶異構(gòu)化酶CCA3'-OHCCA3'-OHtRNA前體加工過(guò)程中的核酸內(nèi)切酶RNaseP能切出成熟5'-端的內(nèi)切酶RNaseF加工tRNA3'-端的核酸內(nèi)切酶RNaseDtRNA3'-端成熟的核酸外切酶tRNA核苷?；D(zhuǎn)移酶per-tRNACCA3'-OH5'加工修飾RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseF71二、真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工1.前體mRNA的加工原核生物大多數(shù)是含有幾個(gè)遺傳信息的多順?lè)醋觤RNA，僅有少數(shù)為單順?lè)醋觤RNA，由于轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程偶聯(lián)所以大多數(shù)原核生物mRNA大多不需要加工就直接進(jìn)入翻譯階段。只有少數(shù)多順?lè)醋觤RNA需要加工，即需要剪切成小單位后，再進(jìn)行翻譯。真核生物的基因在DNA上是間隔排列的，這稱為斷裂基因。但是轉(zhuǎn)錄時(shí)間隔部分是被一起轉(zhuǎn)錄成前體RNA，必須經(jīng)過(guò)剪切和剪接以除去內(nèi)含子序列，轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA后，才能進(jìn)一步實(shí)施后續(xù)的蛋白質(zhì)翻譯。3'-端添加polyA，5'-端戴帽，堿基甲級(jí)化修飾等。二、真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工1.前體mRNA的加工原核生物大多數(shù)72mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或完成后在核內(nèi)進(jìn)行5'端加帽子外顯子內(nèi)含子外顯子m7Gppp核內(nèi)3'端加多聚A尾，胞質(zhì)中也有相應(yīng)酶系，還可以繼續(xù)延長(zhǎng)尾巴m7GpppAA(A)Na-OHmRNA前體剪切去除內(nèi)含子，拼接外顯子m7GpppAA(A)aA-OH轉(zhuǎn)運(yùn)核質(zhì)胞質(zhì)可翻譯的mRNAm7GpppAA(A)aA-OH成熟的mRNA核膜孔甲基化，RNA編輯mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或完成后在核內(nèi)進(jìn)行5'端加帽子外732.前體rRNA加工rRNA基因是多拷貝的，如原核生物基因中rNRA基因有5～10拷貝；真核生物中rNRA拷貝數(shù)更多，如果蠅為260拷貝。而且rRNA基因是由非轉(zhuǎn)錄區(qū)(