體外培育牛黃技術(shù)幻燈3課件

中藥一類新藥—體外培育牛黃

技術(shù)研究報告

武漢大鵬藥業(yè)有限公司

中藥一類新藥—體外培育牛黃

技術(shù)研究報告武漢大鵬藥業(yè)有限1牛黃乃百草之精華，為世之神物，諸藥莫及。

《神農(nóng)本草經(jīng)》

牛黃2體外培育牛黃概述

具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家中藥I類新藥——體外培育牛黃是我國科學(xué)家運用現(xiàn)代生物及仿生技術(shù)首創(chuàng)的醫(yī)藥原料藥生產(chǎn)技術(shù)。體外培育牛黃經(jīng)過處方、工藝、成份、結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性等一系列藥學(xué)研究和藥效學(xué)、毒理學(xué)、特殊毒理等臨床前十八個項目的一百多個指標的研究，并進行多中心臨床試驗研究，表明體外培育牛黃在技術(shù)質(zhì)量標準上，完全符合《中華人民共和國藥典》（2000版）牛黃項下的要求，其療效和性能非常接近甚至超過優(yōu)質(zhì)天然牛黃，且有效成份可控，比天然牛黃穩(wěn)定，可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn).體外培育牛黃已正式載入2005版《中華人民共和國藥典》與天然牛黃的標準完全一致。國家食品藥品監(jiān)督管理局文件，國食藥監(jiān)注[2004]21號規(guī)定，體外培育牛黃替代天然牛黃等量投料使用。體外培育牛黃概述具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家中藥I類新藥—3體外培育牛黃機理結(jié)石機理

牛黃(膽紅素鈣結(jié)石)形成原因：多種原因造成細菌性β－葡萄糖醛酸甙酶和可大量水解結(jié)合型膽紅素為游離膽紅素與葡萄糖醛酸。游離膽紅素與鈣等金屬離子結(jié)合，形成膽紅素鈣鹽顆粒和膽紅素高聚物顆粒，因此膽汁理化性改變了，稱為成石膽汁。這是成石的物質(zhì)基礎(chǔ)。成石膽汁在一定條件下，產(chǎn)生靜電效應(yīng)，高分子有機物質(zhì)架橋作用，形成膽結(jié)石。

體外培育牛黃機理結(jié)石機理4體外培育牛黃機理工藝路線(配方)

新鮮牛膽汁----生物牛膽汁----成石牛膽汁----膽汁核心----成品

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生物反應(yīng)

生化過程

牛黃機(搖轉(zhuǎn))

分層培育干燥

調(diào)節(jié)pH體外培育牛黃技術(shù)應(yīng)用膽紅素鈣結(jié)石形成的靜電效應(yīng)原理,將新鮮牛膽汁通過生物技術(shù)制成成石膽汁，在一定必備的條件下，加入生物成核觸發(fā)物，發(fā)生生物、生化反應(yīng)，使成石膽汁內(nèi)蛋白氫鍵形成，部分蛋白凝固變性，形成核心，其活動中心吸引母液中膽紅素鈣鹽顆粒等物質(zhì)，向中心沉淀。以高分子有機物質(zhì)對沉淀顆粒的架橋作用，即線型聚合物的功能對顆粒的吸附作用，層層沉附，逐漸增大，脫水，干燥。形成牛膽結(jié)石，即牛黃成品

體外培育牛黃機理

5天然牛黃分析研究不同產(chǎn)地的天然牛黃成分及含量的分析研究參照國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者對天然牛黃成分含量的分析方法和結(jié)果，對國內(nèi)外五個不同產(chǎn)地的優(yōu)質(zhì)牛黃進行了分析研究，其結(jié)果如下:(成分含量（%）)

產(chǎn)地澳大利亞牛黃1西藏牛黃2京牛黃3進口牛黃1進口牛黃2水分6.96.87.07.06.7灰分6.86.76.97.16.8膽紅素36.70±0.67*39.62±1.39*35.80±0.55*29.29±0.72**40.90±0.67**膽酸20.10±1.48*15.00±1.13*14.90±0.88*15.30±1.03**17.04±0.92**去氧膽酸6.48±0.77*4.90±0.76*4.86±0.7510.63±0.86**7.15±0.63**?；撬?.42±0.49*5.92±0.73*6.25±0.78*4.66±0.74**6.46±0.55**膽固醇4.80±1.09*5.45±1.08*5.79±0.72*10.55±0.41**4.40±0.66**磷脂1.75±0.38*1.70±0.39*1.90±0.38*1.30±0.41**2.96±0.37**無機鹽3.363.583.453.732.96氨基酸0.6550.6330.7480.5650.688糖蛋白1.742.052.591.992.06合計95.7092.3590.1992.6297.37天然牛黃分析研究不同產(chǎn)地的天然牛黃成分及含量的分析研究6體外培育牛黃成分分析研究體外培育牛黃成分含量的分析研究通過對體外培育牛黃處方、制備工藝及其原理的研究，對所生產(chǎn)出的產(chǎn)品成分含量的研究分析如下:(成分含量（%）)批號901102901128901220910220920418水分7.16.97.06.97.0灰分7.37.27.27.07.1膽紅素35.58±0.62*336.61±0.66*37.37±0.9036.87±0.67**37.96±0.82膽酸14.45±0.50*16.90±0.59*16.90±0.59*16.85±0.60**16.36±0.99**去氧膽酸6.80±0.48*6.79±0.40*6.61±0.55*6.60±0.40**6.80±0.68**牛磺酸6.48±0.66*6.70±0.44*6.72±0.46*6.83±0.48**6.70±0.44**膽固醇5.95±0.29*5.20±1.16*5.00±0.40*5.10±0.71**5.30±0.41**磷脂1.77±0.30*1.80±0.62*1.88±0.25*1.88±0.36**1.75±0.15**無機鹽3.683.403.353.433.28氨基酸0.7880.6950.6980.6700.762糖蛋白2.572.262.432.491.98合計92.4794.4695.1694.6295.26*n=12**n=6體外培育牛黃成分分析研究體外培育牛黃成分含量的分析研究7相關(guān)儀器檢測對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃相關(guān)儀器檢測對比性研究●紅外光譜分析結(jié)果：天然牛黃與體外培育牛黃在1730-1350cm-1區(qū)間，均有膽紅素鹽及膽紅素高聚物質(zhì)的特征峰。●傅立葉變換紅外分光光譜儀分析結(jié)果：體外培育牛黃與天然牛黃均見1690cm-1為羧酸類；1629-1565cm-1為酰胺類；1404cm-1為羥基類?！窀咝б合嗌V分析結(jié)果：膽酸、去氧膽酸對照品的圖譜與體外培育牛黃、天然牛黃中的膽酸、去氧膽酸一致?！癖由V分析結(jié)果：體外培育牛黃、天然牛黃色譜中，在與膽酸、去氧膽酸對照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點。●微量元素含量測定結(jié)果：體外培育牛黃與天然牛黃的微量元素及其含量均一致?！癜被岷繙y定結(jié)果：體外培育牛黃與天然牛黃含有相同的17種氨基酸。相關(guān)儀器檢測對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃相關(guān)儀器檢測對比8項目品名體外培育牛黃天然牛黃人工牛黃粉性狀外觀棕黃色球、類球形、質(zhì)輕、松、脆直徑0.5-3cm棕黃色球、類球形、質(zhì)輕、松、脆直徑0.5-3cm無形狀、粉末、淺黃色斷面斷層金黃色，有同心層紋結(jié)構(gòu)斷層金黃色，有同心層紋結(jié)構(gòu)無結(jié)構(gòu)氣味氣香、味苦而后甜氣香、味苦而后甜微腥，微苦顯微觀察光鏡10倍取少許粉末加50%甘油乙醇液裝片，鏡下見絮狀、團絮狀棕色膽紅素鈣顆粒取少許粉末加50%甘油乙醇液裝片，鏡下見絮狀、團絮狀棕色膽紅素鈣顆大量淀粉顆粒，呈圓形、多面形掃描電鏡呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔7-350u呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔7-350u

含量膽紅素35%以上35%以上0.7%膽酸12%以上7%以上12.5%去氧膽酸5%以上4%以上豬去氧膽酸15%

體外培育牛黃、天然牛黃、人工牛黃比較表

三種牛黃比較表項目品名體外培育牛黃9游離膽紅素含量對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃游離膽紅素含量對比性研究游離膽紅素含量對比表

批號1234567891011平均值天然牛黃4.4203.2382.0263.7034.3004.503.362.7561.2941.273.823.153體外培育牛黃0.5000.5000.4900.6300.6700.6220.5500.5260.4800.4600.5320.544游離膽紅素含量對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃游離膽10HPLC指紋圖譜的比較研究體外培育牛黃與天然牛黃HPLC指紋圖譜的比較研究研究內(nèi)容：根據(jù)牛黃所含化學(xué)成分，我們分別對以下主要成分進行研究：①氨基酸、肽類(蛋白質(zhì))②膽汁酸類③膽紅素類。④微量元素擬定以下樣品前處理方法：酸水用于檢測氨基酸、肽類成分；酸水/醇用于檢測膽汁酸類成分；二甲亞砜用于檢測膽紅素類成分HPLC指紋圖譜的比較研究體外培育牛黃與天然牛黃HPLC指紋111）、10批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC疊加圖譜

10批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC圖譜有很好的一致性圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究1）、10批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-M122、

4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC疊加圖譜

l

顯然，不同產(chǎn)地的天然牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC圖譜各主要膽汁酸的比例有一定差異圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究2、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MS133）、10批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC疊加圖譜

顯然，10批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC圖譜有很好的一致性圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究3）、10批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC14

4）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC疊加圖譜（2天然牛黃，13西牛黃，14巴西牛黃，15印度牛黃）

天然牛黃與體外培育牛黃比較，有紫外吸收成分的種類基本一致，但相對含量有差異圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究4）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收155）、10批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊加圖譜

顯然，10批體外培育牛黃二甲亞砜提取液的HPLC圖譜有較好的一致性圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究5）、10批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊加圖譜

顯然166）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊加圖譜（6天然牛黃，16巴西牛黃，17西牛黃，18印度牛黃）

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天然牛黃與體外培育牛黃比較，二甲亞砜提取液中成分種類基本一致，但相對含量稍有差異圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究6）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊17HPLC指紋圖譜的比較研究結(jié)論：1、體外培育牛黃與天然牛黃三個提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亞砜提取液）的成分種類均基本一致，但含量有差異。2、10批體外培育牛黃三個提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亞砜提取液）的HPLC指紋圖譜有較好的一致性，說明體外培育牛黃的工藝是穩(wěn)定的。

HPLC指紋圖譜的比較研究結(jié)論：18天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析類項體外培育牛黃（國家藥品標準）牛黃（藥典2000版）來源本品為以?？苿游锱５男迈r牛膽汁液,配成成石膽汁,在體外培育所得的牛膽紅素鈣結(jié)石。本品為?？苿游锱８稍锏哪懡Y(jié)石。宰牛時，如發(fā)現(xiàn)有牛黃，即濾去膽汁，將牛黃取出，除出外部薄膜，陰干。性狀呈球形、類球形，直徑0.5-3cm，表面光滑，呈黃紅色至棕黃色，體輕，質(zhì)松脆，有同心層紋。氣香，味苦而后甘，有清涼感，嚼之易碎，不粘牙。呈卵形、類球形，直徑0.6-3（4.5）cm，表面黃紅色至棕黃色，體輕，質(zhì)松脆，有同心層紋。氣香，味苦而后甘，有清涼感，嚼之易碎，不粘牙。鑒別粉末加清水調(diào)和，涂于指甲，能將指甲染成黃色。加清水調(diào)和，涂于指甲上，能將指甲染成黃色。顯微鑒別呈正反應(yīng)顯微鑒別呈正反應(yīng)膽紅素鑒別呈正反應(yīng)膽紅素鑒別呈正反應(yīng)膽酸鑒別呈正反應(yīng)膽酸鑒別呈正反應(yīng)去氧膽酸鑒別呈正反應(yīng)去氧膽酸鑒別呈正反應(yīng)無無檢查按藥典附錄水份測定法測定不得過9.0%按藥典附錄水份測定法測定不得過9.0%游離膽紅素吸收度不得超過0.70無含量測定按藥典測定薄層掃描法膽酸含量不得少于6.0%。按藥典薄層掃描法測定膽酸含量不得少于4.0%。按藥典分光光度法測定膽紅素含量不得少于35.0%。按藥典分光光度法測定膽紅素含量不得少35.0%。功能主治清心，豁痰，開竅，涼肝，息風，解毒。用于熱病神昏，中風痰迷，驚厥抽搐，癲癇發(fā)狂，咽喉腫痛，口舌生瘡，癰腫疔瘡。清心，豁痰，開竅，涼肝，息風，解毒。用于熱病神昏，中風痰迷，驚厥抽搐，癲癇發(fā)狂，咽喉腫痛，口舌生瘡，癰腫疔瘡。用法用量0.15-0.35g。多入丸散用；外用適量，研末敷患處。0.15-0.35g。多入丸散用；外用適量，研末敷處。貯藏置陰涼干燥處，遮光，密閉保存，防潮防壓。遮光，密閉，置陰涼干燥處，防潮，防壓。

天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析

質(zhì)量標準對比分析(一)天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析類項體外培育牛黃（國家19質(zhì)量標準對比分析（二）天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析（2005版藥典）天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準：完全一致質(zhì)量標準對比分析（二）20主要藥效學(xué)對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃主要藥效學(xué)對照性研究抗炎作用：表明ICCB對急性炎癥的滲出和白細胞的趨化均有抑制作用。ICCB的抗炎作用強度與天然牛黃相近。解熱作用：ICCB對酵母所致大鼠的發(fā)熱及對傷寒副傷寒三聯(lián)疫苗致家兔發(fā)熱均有顯著的抑制作用，其作用強度與天然牛黃相似。中樞抑制作用：ICCB對安鈉咖致小鼠驚厥，嗎啡致小鼠豎尾反應(yīng)有明顯的對抗作用，以上作用強度均與天然牛黃相近。人工牛黃粉則無上述中樞抑制作用抗菌作用：ICCB能顯著降低感染金黃色葡萄球菌小數(shù)的死亡率。

主要藥效學(xué)對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃主要藥效學(xué)對照性研21一般藥理對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃一般藥理對照性研究對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響：ICCB具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用，無鎮(zhèn)痛作用。TPN對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用與天然牛黃相同。對心血管系統(tǒng)的影響：ICCB能明顯降低大鼠的血壓，但不影響心率的心電圖。這一作用與天然牛黃一致。對呼吸系統(tǒng)的影響：ICCB和天然牛黃對大鼠的呼吸頻率和幅度均無明顯影響。一般藥理對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃一般藥理對照性研究22體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究體外培育牛黃的主要藥效集中反映在中樞作用方面：除了前述抗驚厥、鎮(zhèn)靜、解熱作用外，還有耐缺氧、清除自由基，保護腦細胞，保護心功能的作用。（1）體外培育牛對小鼠密閉缺氧耐受力的影響組別動物數(shù)劑量給藥途徑成活時間X±SD（min）NS1020ml/Kgig31.04±2.88ICCB10800mg/Kgig37.57±2089***ICCB101200mg/Kgig39.54±2.70***ICCB101600mg/Kgig40.02±3.06***PPN1020mg/Kgig38.01±2.95***:p＜0.001體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究組別動物數(shù)劑量給藥途徑23組別動物數(shù)劑量給藥途徑SOD(Nu/mgprc)X±SD腦肝血清心NS920ml/Kgig31.20±10.7980.00±10.79115.57±26.1960.44±9.29ICCB101200mg/Kgig39.90±507*94.68±14.8*203.16±23.73*69.87±8.71*:p＜0.005**:p＜0.01（3）體外培育牛對缺氧小鼠的腦、心、肝組織及血清MDA含量的影響組別動物數(shù)劑量給藥途徑MDAnmol/mg(X±SD)腦心肝血清NS920ml/Kgig5.90±0.98.45±1.968.76±1.906.89±0.71ICCB101200mg/Kgig4.70±11*5.51±1.4**7.29±1.5*5.20±1.02*:p＜0.05**:p＜0.01***:p＜0.001（2）體外培育牛對缺氧小鼠的血清及腦、心、肝組織勻漿SOD活性影響

體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究組別動物數(shù)劑量給藥途徑SOD(Nu/mgprc)X±SD腦24（4）缺氧小鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)改變之電鏡所見對照組治療組神經(jīng)元細胞水腫，胞漿內(nèi)細胞器不同程度變性，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核糖體數(shù)量減少，部分膠質(zhì)細胞核周積液，胞漿空亮，細胞器溶解，部分有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂，部分無髓神經(jīng)纖維腫脹，呈大小不等泡狀，神經(jīng)絲消失，見局限性神經(jīng)纖維溶解灶。毛細血管管徑不等，內(nèi)皮細胞腫脹，胞漿內(nèi)空泡增多，大部分毛細血管周圍見積液性間隙。僅少量神經(jīng)元細胞輕微變性。線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴張。核糖體數(shù)量基本正常，少數(shù)膠質(zhì)細胞核周間隙增寬，有髓及無髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)規(guī)則。毛細血管內(nèi)皮細胞無明顯腫脹，毛細血管周圍無積液性間隙。體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究（4）缺氧小鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)改變之電鏡所見對照組治療組神經(jīng)元25體外培育牛黃急性、長期毒性試驗體外培育牛黃急性毒性試驗從急性毒性試驗結(jié)果可以看出，體外培育牛黃給予小鼠和大鼠口服后的急性毒性很低。小鼠口服TPN的LD50為9.0（8.0-10.1）g/kg，是人口服用量（0.3g或5mg/kg）的1800倍。大鼠口服TPN的LD50大于10g/kg，是人口服用量的2000倍以上。

體外培育牛黃長期毒性試驗在長期毒性試驗中，大鼠耐受TPN1500mg/kg達35天，犬耐受TPN500mg/kg達33天。結(jié)果表明TPN長期口服大鼠和犬各系統(tǒng)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能無不良影響，而且用藥組動物的體重增長均高于對照組。體外培育牛黃急性、長期毒性試驗體外培育牛黃急性毒性試驗26體外培育牛黃致突變、染色體畸變試驗體外培育牛黃致突變試驗體外培育牛黃在本試驗條件下，從定性的標準和平皿摻入試驗的觀測結(jié)果，其對各受試菌株引起的回復(fù)菌落數(shù)均未超過對照組自發(fā)突變菌落數(shù)的2倍，表明試驗結(jié)果為陰性顯示體外培育牛黃對組氨酸缺陷型沙門氏菌無明顯的致回復(fù)突變作用。

培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗在體外培育牛黃的劑量分別為1.0、10.0和100ug/ml的試驗條件下，對人外周血淋巴細胞誘發(fā)的染色體細胞畸變率增加與溶劑對照組比較，均無統(tǒng)計學(xué)顯著性差別意義，試驗結(jié)果為陰性，表明在試驗條件下，對人外周血淋巴細胞染色體無明顯的致畸變性作用。體外培育牛黃致突變、染色體畸變試驗體外培育牛黃致突變試驗27體外培育牛黃對小鼠微核、生殖毒性試驗體外培育牛黃對小鼠微核試驗體外培育牛黃的劑量為50、150、500mg/kg體重的試驗條件下，對小鼠的骨髓嗜多染紅細胞微核率未引起顯著增加，表明體外培育牛黃未呈現(xiàn)明顯的致突變性作用。

生殖毒性試驗本試驗條件下，體外培育牛黃對大鼠的生殖行為和能力、著床數(shù)及著床后胚胎存活數(shù)、存活胎仔的生長發(fā)育等方面均未觀察到不良影響；對存活的胎仔亦未見有明顯的致畸作用。

體外培育牛黃對小鼠微核、生殖毒性試驗體外培育牛黃對小鼠微核試28體外培育牛黃食品安全性評價體外培育牛黃食品安全性評價：根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評價程序與方法》對體外培育牛黃的食品安全性毒理學(xué)進行了第一二階段的檢驗。結(jié)果顯示其通過食品安全性毒理學(xué)第一、第二階段的檢驗。根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評價程序與方法》對體外培育牛黃的食品安全性毒理學(xué)進行了大鼠90天喂養(yǎng)試驗，結(jié)果顯示其結(jié)果為陰性。體外培育牛黃食品安全性評價體外培育牛黃食品安全性評價：29臨床對比性研究體外培育牛黃與天然牛黃單劑和復(fù)方制劑II、III期臨床對比性研究總結(jié)用體外培育牛黃及以其為原料藥的復(fù)方制劑治療中風、乙腦、急性咽炎、牙周炎、癤腫病人共1852例，療效良好，與優(yōu)質(zhì)天然牛黃無差異（見附表）；臨床試驗表明體外培育牛黃無明顯毒副作用。（注:ICCB:體外培育牛黃,NN:天然牛黃）II、III期臨床試驗共1852例治療結(jié)果：組別藥名病名總例數(shù)愈顯率（%）總有效率（%）治療組安宮牛黃丸（ICCB）乙腦18293.9599.45對照組安宮牛黃丸（NN）乙腦7888.4697.43治療組單味（ICCB）乙腦12492.7499.20對照組單味（NN）乙腦4175.6087.80治療組安宮牛黃丸（ICCB）中風24847.9884.78對照組安宮牛黃丸（NN）中風14847.9784.93治療組單味（ICCB）中風9537.986.30對照組單味（NN）中風3232.2580.60治療組片仔癀（ICCB）急性咽炎41675.5096.64對照組片仔癀（NN）急性咽炎10280.3897.06治療組單味（ICCB）牙周炎14890.5499.32對照組單味（NN）牙周炎3984.6194.87治療組單味（ICCB）癤腫11076.3696.36對照組單味（NN）癤腫3966.6794.87臨床對比性研究體外培育牛黃與天然牛黃單劑和復(fù)方制劑II、II30國家藥典委員會意見

國家藥典委員會

國藥典字[2003]64號

關(guān)于盡快解決牛黃系列產(chǎn)品在中成藥處方中合理使用問題的請示

國家食品藥品監(jiān)督管理局：今年以來，我們受局委托，對牛黃系列產(chǎn)品在中成藥處方中使用問題，組織有關(guān)專家進行了多次研討論證。在6月份就牛黃與人工牛黃使用問題形成明確意見和建議的基礎(chǔ)上，在9月及10月份又分別組織中醫(yī)藥專家就體外培育牛黃、培植牛黃在中藥制劑中使用的有關(guān)問題進行了研究論證，現(xiàn)將其會議紀要一并上報。我委綜合了各專家意見，希望我局盡快予以解決牛黃、體外培育牛黃、培植牛黃及人工牛黃在中成藥處方中合理使用的問題，以確保人民群眾用藥需求，促進中醫(yī)藥的可持續(xù)發(fā)展，推動醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化，為我國醫(yī)藥衛(wèi)生的健康發(fā)展做出新的貢獻。附：關(guān)于體外培育牛黃與培植牛黃應(yīng)用問題會議紀要

二00三年十一月十四日國家藥典委員會意見國家藥典委員會31關(guān)于體外培育牛黃與培植牛黃應(yīng)用問題會議紀要（一）

受國家食品藥品監(jiān)督管理局委托，國家藥典委員會于2003年9月19-20日，在武漢組織召開了“體外培育牛黃在中藥成方制劑中使用有關(guān)問題研討會”。王永炎、周超凡、高學(xué)敏、張伯禮、季紹良、姚達木等十名著名中醫(yī)藥專家參加了會議。國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊司呂藥處麻廣霖同志以及武漢市藥監(jiān)局的領(lǐng)導(dǎo)亦參加了會議。會議由藥典委員會中藥處錢忠直處長主持，周福成副秘書長扼要介紹了藥品標準工作情況并對開好這次會議提了要求。會上，聽取了體外培育牛黃發(fā)明人蔡紅嬌教授關(guān)于體外培育牛黃的研制過程、臨床試驗、藥理作用、單味藥材與牛黃質(zhì)量標準中所含成分的對比、臨床對照，以及與幾個含牛黃成分的中藥成方制劑的臨床對照（如片仔癀、安宮牛黃丸、牛黃解毒片等）的試驗結(jié)果介紹。廣州中醫(yī)藥大學(xué)賴世隆教授詳細介紹了II期和III期臨床驗證情況。江蘇中康新藥指紋圖譜開發(fā)公司的盛龍生研究員介紹了用指紋圖譜對體外培育牛黃與天然牛黃主要化學(xué)成分的研究成果。會議期間，代表們還就體外培育牛黃的全部生產(chǎn)流程進行了實地參觀考察并作進一步了解。會議由王永炎院士和高學(xué)敏教授分別擔任專家組組長。經(jīng)認真討論，與會專家一致認為：體外培育牛黃工藝成熟，質(zhì)量穩(wěn)定，安全有效，與牛黃可以等同使用。另外，藥典委員、中科院陳可冀院士雖未能到會，但特地提交了書面意見，亦與各專家意見一致。我們認為:一、在中藥成方制劑的處方中，凡含牛黃的中成藥，體外培育牛黃、培植牛黃與牛黃均可等量投料使用。二、從國家藥品標準管理角度應(yīng)履行相應(yīng)的程序，在藥品說明書中必須寫明所使用的是何種牛黃，同時相應(yīng)修訂國家藥品標準，使其名副其實，確保臨床效果和質(zhì)量可控。三、為確保中醫(yī)藥的可持續(xù)發(fā)展，今后尤其要對瀕危動植物藥材資源替代品的研究與應(yīng)用制訂鼓勵政策，并大力推動醫(yī)藥原材料高新技術(shù)成果產(chǎn)業(yè)化。四、為確保臨床效果，用藥安全有效，建議今后中藥新藥研究中，盡可能推廣使用體外培育牛黃或培植牛黃。二OO三年十一月十四日關(guān)于體外培育牛黃與培植牛黃應(yīng)用問題會議紀要（一）受國家食品32關(guān)于體外培育牛黃與培植牛黃應(yīng)用問題會議紀要（二）“體外培育牛黃在中藥成方制劑中使用有關(guān)問題研討會”國家藥典委員會主要成員：陳可冀院士、王永炎院士、高學(xué)敏教授、張伯禮教授、周文泉教授、姚達木主任藥師、錢忠直教授、周超凡研究員、賴世隆教授、季紹良教授、張啟明主任藥師、張立群主任藥師

關(guān)于體外培育牛黃與培植牛黃應(yīng)用問題會議紀要（二）“體外培育牛33關(guān)于體外培育牛黃與培植牛黃應(yīng)用問題會議紀要（三）

受國家食品藥品監(jiān)督管理局委托，國家藥典委員會于2003年9月19-20日，在武漢組織召開了“體外培育牛黃在中藥成方制劑中使用有關(guān)問題研討會”。王永炎、周超凡、高學(xué)敏、張伯禮、季紹良、姚達木等十名著名中醫(yī)藥專家參加了會議。國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊司呂藥處麻廣霖同志以及武漢市藥監(jiān)局的領(lǐng)導(dǎo)亦參加了會議。會議由藥典委員會中藥處錢忠直處長主持，周福成副秘書長扼要介紹了藥品標準工作情況并對開好這次會議提了要求。會上，聽取了體外培育牛黃發(fā)明人蔡紅嬌教授關(guān)于體外培育牛黃的研制過程、臨床試驗、藥理作用、單味藥材與牛黃質(zhì)量標準中所含成分的對比、臨床對照，以及與幾個含牛黃成分的中藥成方制劑的臨床對照（如片仔癀、安宮牛黃丸、牛黃解毒片等）的試驗結(jié)果介紹。廣州中醫(yī)藥大學(xué)賴世隆教授詳細介紹了II期和III期臨床驗證情況。江蘇中康新藥指紋圖譜開發(fā)公司的盛龍生研究員介紹了用指紋圖譜對體外培育牛黃與天然牛黃主要化學(xué)成分的研究成果。會議期間，代表們還就體外培育牛黃的全部生產(chǎn)流程進行了實地參觀考察并作進一步了解。會議由王永炎院士和高學(xué)敏教授分別擔任專家組組長。經(jīng)認真討論，與會專家一致認為：體外培育牛黃工藝成熟，質(zhì)量穩(wěn)定，安全有效，與牛黃可以等同使用。另外，藥典委員、中科院陳可冀院士雖未能到會，但特地提交了書面意見，亦與各專家意見一致。我們認為:一、在中藥成方制劑的處方中，凡含牛黃的中成藥，體外培育牛黃、培植牛黃與牛黃均可等量投料使用。二、從國家藥品標準管理角度應(yīng)履行相應(yīng)的程序，在藥品說明書中必須寫明所使用的是何種牛黃，同時相應(yīng)修訂國家藥品標準，使其名副其實，確保臨床效果和質(zhì)量可控。三、為確保中醫(yī)藥的可持續(xù)發(fā)展，今后尤其要對瀕危動植物藥材資源替代品的研究與應(yīng)用制訂鼓勵政策，并大力推動醫(yī)藥原材料高新技術(shù)成果產(chǎn)業(yè)化。四、為確保臨床效果，用藥安全有效，建議今后中藥新藥研究中，盡可能推廣使用體外培育牛黃或培植牛黃。二OO三年十一月十四日關(guān)于體外培育牛黃與培植牛黃應(yīng)用問題會議紀要（三）受國家食品34國家食品藥品監(jiān)督管理局文件（一）

國家食品藥品監(jiān)督管理局文件國食藥監(jiān)注[2004]21號

國家食品藥品監(jiān)督管理局文件（一）國家食品藥品監(jiān)督管理局文件35國家食品藥品監(jiān)督管理局文件（二）關(guān)于牛黃及其代用品使用問題的通知各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局（藥品監(jiān)督管理局）：牛黃是傳統(tǒng)名貴中藥材，是中成藥的重要原料。長期以來，藥源緊缺，難以滿足臨床用藥的需要，大量牛黃依賴進口。為此，國家藥品監(jiān)督管理部門自1972年陸續(xù)批準了3個牛黃代用品，即：人工牛黃、培植牛黃和體外培育牛黃。但由于歷史原因，在國家藥品標準處方中牛黃代用品的使用問題一直沒有明確，在一定程度上造成中成藥生產(chǎn)和使用過程中牛黃與牛黃代用品混用的情況。為加強國家藥品標準處方中含牛黃品種的監(jiān)督管理，現(xiàn)將有關(guān)事宜通知如下：一、對于國家藥品標準處方中含牛黃的臨床急重病癥用藥品種（見附件1）和國家藥品監(jiān)督管理部門批準的含牛黃的新藥，可以將處方中的牛黃以培植牛黃、體外培育牛黃等量投料使用，但不得以人工牛黃替代。其他含牛黃的品種可以將處方中的牛黃以培植牛黃、體外培育牛黃或人工牛黃替代牛黃等量投料使用。

二、各藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的含牛黃的品種應(yīng)按照上述規(guī)定，固定使用牛黃、培植牛黃、體外培育牛黃或人工牛黃中的一種，并將品種的詳細處方于2004年6月30日前報所在地省級藥品監(jiān)督管理部門，各省級藥品監(jiān)督管理部門應(yīng)按照上述規(guī)定進行審查，并將審查意見及本轄區(qū)內(nèi)含牛黃品種替代情況（見附件2）匯總后，于2004年7月31日前報我局藥品注冊司，同時抄送國家藥典委員會。（續(xù)）國家食品藥品監(jiān)督管理局文件（二）關(guān)于牛黃及其代用品使用問題的36國家食品藥品監(jiān)督管理局文件（三）三、含牛黃或其代用品的藥品必須在包裝標簽及使用說明書中的【成份】或【主要成份】項下明確牛黃或其代用品名稱，并將該品種的包裝標簽及使用說明書報所在地省級藥品監(jiān)督管理部門備案。四、生產(chǎn)含牛黃或其代用品品種的藥品生產(chǎn)企業(yè)在2004年6月30日以后必須按上述規(guī)定組織生產(chǎn)，此前已進入流通領(lǐng)域的可在其有效期內(nèi)繼續(xù)銷售使用。五、已明確處方使用牛黃或其代用品的品種如需變更處方使用牛黃或其代用品，應(yīng)按照《藥品注冊管理辦法》的有關(guān)規(guī)定辦理。六、國家藥典委員會應(yīng)按照上述規(guī)定統(tǒng)一組織含牛黃或其代用品品種的質(zhì)量標準修訂工作。七、醫(yī)療機構(gòu)制劑處方中牛黃、培植牛黃、體外培育牛黃以及人工牛黃的使用，由所在地省級藥品監(jiān)督管理部門參照上述要求另行規(guī)定。各省級藥品監(jiān)督管理部門接此通知后應(yīng)及時將以上規(guī)定通知轄區(qū)內(nèi)相關(guān)藥品生產(chǎn)企業(yè)，并督促相關(guān)藥品生產(chǎn)企業(yè)做好此項工作，切實加強對含牛黃、培植牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃藥品的監(jiān)督管理。

二OO四年一月二十一日

國家食品藥品監(jiān)督管理局文件（三）三、含牛黃或其代用品的藥品必37附件體外培育牛黃部分相關(guān)文件1、國家技術(shù)發(fā)明二等獎證書（證書號：2002-F-234-2-01-01）2、體外培育牛黃發(fā)明專利證書（第24328號）3、偏心搖轉(zhuǎn)機實用新型專利證書（證書號：第386457號）4、體外培育牛黃新藥證書（編號（97）衛(wèi)藥證字Z-125號）5、體外培育牛黃質(zhì)量標準（WS3-45（Z-051）-2003（Z））6、體外培育牛黃藥品GMP證書（證書編號：D1670）7、國家重點新產(chǎn)品（2003ED761004）8、國家重大科技專項（863）課題（2002AA2Z3212）9、國家經(jīng)貿(mào)委“雙高一優(yōu)”項目（＜2001＞1000號）10、科技部中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目（01C26114210557）附件體外培育牛黃部分相關(guān)文件38致謝

謝謝！

武漢大鵬藥業(yè)有限公司致謝謝謝！武漢大鵬藥業(yè)有限公司39中藥一類新藥—體外培育牛黃

技術(shù)研究報告

武漢大鵬藥業(yè)有限公司

中藥一類新藥—體外培育牛黃

技術(shù)研究報告武漢大鵬藥業(yè)有限40牛黃乃百草之精華，為世之神物，諸藥莫及。

《神農(nóng)本草經(jīng)》

牛黃41體外培育牛黃概述

具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家中藥I類新藥——體外培育牛黃是我國科學(xué)家運用現(xiàn)代生物及仿生技術(shù)首創(chuàng)的醫(yī)藥原料藥生產(chǎn)技術(shù)。體外培育牛黃經(jīng)過處方、工藝、成份、結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性等一系列藥學(xué)研究和藥效學(xué)、毒理學(xué)、特殊毒理等臨床前十八個項目的一百多個指標的研究，并進行多中心臨床試驗研究，表明體外培育牛黃在技術(shù)質(zhì)量標準上，完全符合《中華人民共和國藥典》（2000版）牛黃項下的要求，其療效和性能非常接近甚至超過優(yōu)質(zhì)天然牛黃，且有效成份可控，比天然牛黃穩(wěn)定，可工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn).體外培育牛黃已正式載入2005版《中華人民共和國藥典》與天然牛黃的標準完全一致。國家食品藥品監(jiān)督管理局文件，國食藥監(jiān)注[2004]21號規(guī)定，體外培育牛黃替代天然牛黃等量投料使用。體外培育牛黃概述具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家中藥I類新藥—42體外培育牛黃機理結(jié)石機理

牛黃(膽紅素鈣結(jié)石)形成原因：多種原因造成細菌性β－葡萄糖醛酸甙酶和可大量水解結(jié)合型膽紅素為游離膽紅素與葡萄糖醛酸。游離膽紅素與鈣等金屬離子結(jié)合，形成膽紅素鈣鹽顆粒和膽紅素高聚物顆粒，因此膽汁理化性改變了，稱為成石膽汁。這是成石的物質(zhì)基礎(chǔ)。成石膽汁在一定條件下，產(chǎn)生靜電效應(yīng)，高分子有機物質(zhì)架橋作用，形成膽結(jié)石。

體外培育牛黃機理結(jié)石機理43體外培育牛黃機理工藝路線(配方)

新鮮牛膽汁----生物牛膽汁----成石牛膽汁----膽汁核心----成品

↑↑↑↑

生物反應(yīng)

生化過程

牛黃機(搖轉(zhuǎn))

分層培育干燥

調(diào)節(jié)pH體外培育牛黃技術(shù)應(yīng)用膽紅素鈣結(jié)石形成的靜電效應(yīng)原理,將新鮮牛膽汁通過生物技術(shù)制成成石膽汁，在一定必備的條件下，加入生物成核觸發(fā)物，發(fā)生生物、生化反應(yīng)，使成石膽汁內(nèi)蛋白氫鍵形成，部分蛋白凝固變性，形成核心，其活動中心吸引母液中膽紅素鈣鹽顆粒等物質(zhì)，向中心沉淀。以高分子有機物質(zhì)對沉淀顆粒的架橋作用，即線型聚合物的功能對顆粒的吸附作用，層層沉附，逐漸增大，脫水，干燥。形成牛膽結(jié)石，即牛黃成品

體外培育牛黃機理

44天然牛黃分析研究不同產(chǎn)地的天然牛黃成分及含量的分析研究參照國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者對天然牛黃成分含量的分析方法和結(jié)果，對國內(nèi)外五個不同產(chǎn)地的優(yōu)質(zhì)牛黃進行了分析研究，其結(jié)果如下:(成分含量（%）)

產(chǎn)地澳大利亞牛黃1西藏牛黃2京牛黃3進口牛黃1進口牛黃2水分6.96.87.07.06.7灰分6.86.76.97.16.8膽紅素36.70±0.67*39.62±1.39*35.80±0.55*29.29±0.72**40.90±0.67**膽酸20.10±1.48*15.00±1.13*14.90±0.88*15.30±1.03**17.04±0.92**去氧膽酸6.48±0.77*4.90±0.76*4.86±0.7510.63±0.86**7.15±0.63**?；撬?.42±0.49*5.92±0.73*6.25±0.78*4.66±0.74**6.46±0.55**膽固醇4.80±1.09*5.45±1.08*5.79±0.72*10.55±0.41**4.40±0.66**磷脂1.75±0.38*1.70±0.39*1.90±0.38*1.30±0.41**2.96±0.37**無機鹽3.363.583.453.732.96氨基酸0.6550.6330.7480.5650.688糖蛋白1.742.052.591.992.06合計95.7092.3590.1992.6297.37天然牛黃分析研究不同產(chǎn)地的天然牛黃成分及含量的分析研究45體外培育牛黃成分分析研究體外培育牛黃成分含量的分析研究通過對體外培育牛黃處方、制備工藝及其原理的研究，對所生產(chǎn)出的產(chǎn)品成分含量的研究分析如下:(成分含量（%）)批號901102901128901220910220920418水分7.16.97.06.97.0灰分7.37.27.27.07.1膽紅素35.58±0.62*336.61±0.66*37.37±0.9036.87±0.67**37.96±0.82膽酸14.45±0.50*16.90±0.59*16.90±0.59*16.85±0.60**16.36±0.99**去氧膽酸6.80±0.48*6.79±0.40*6.61±0.55*6.60±0.40**6.80±0.68**?；撬?.48±0.66*6.70±0.44*6.72±0.46*6.83±0.48**6.70±0.44**膽固醇5.95±0.29*5.20±1.16*5.00±0.40*5.10±0.71**5.30±0.41**磷脂1.77±0.30*1.80±0.62*1.88±0.25*1.88±0.36**1.75±0.15**無機鹽3.683.403.353.433.28氨基酸0.7880.6950.6980.6700.762糖蛋白2.572.262.432.491.98合計92.4794.4695.1694.6295.26*n=12**n=6體外培育牛黃成分分析研究體外培育牛黃成分含量的分析研究46相關(guān)儀器檢測對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃相關(guān)儀器檢測對比性研究●紅外光譜分析結(jié)果：天然牛黃與體外培育牛黃在1730-1350cm-1區(qū)間，均有膽紅素鹽及膽紅素高聚物質(zhì)的特征峰?！窀盗⑷~變換紅外分光光譜儀分析結(jié)果：體外培育牛黃與天然牛黃均見1690cm-1為羧酸類；1629-1565cm-1為酰胺類；1404cm-1為羥基類?！窀咝б合嗌V分析結(jié)果：膽酸、去氧膽酸對照品的圖譜與體外培育牛黃、天然牛黃中的膽酸、去氧膽酸一致?！癖由V分析結(jié)果：體外培育牛黃、天然牛黃色譜中，在與膽酸、去氧膽酸對照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點。●微量元素含量測定結(jié)果：體外培育牛黃與天然牛黃的微量元素及其含量均一致。●氨基酸含量測定結(jié)果：體外培育牛黃與天然牛黃含有相同的17種氨基酸。相關(guān)儀器檢測對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃相關(guān)儀器檢測對比47項目品名體外培育牛黃天然牛黃人工牛黃粉性狀外觀棕黃色球、類球形、質(zhì)輕、松、脆直徑0.5-3cm棕黃色球、類球形、質(zhì)輕、松、脆直徑0.5-3cm無形狀、粉末、淺黃色斷面斷層金黃色，有同心層紋結(jié)構(gòu)斷層金黃色，有同心層紋結(jié)構(gòu)無結(jié)構(gòu)氣味氣香、味苦而后甜氣香、味苦而后甜微腥，微苦顯微觀察光鏡10倍取少許粉末加50%甘油乙醇液裝片，鏡下見絮狀、團絮狀棕色膽紅素鈣顆粒取少許粉末加50%甘油乙醇液裝片，鏡下見絮狀、團絮狀棕色膽紅素鈣顆大量淀粉顆粒，呈圓形、多面形掃描電鏡呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔7-350u呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔7-350u

含量膽紅素35%以上35%以上0.7%膽酸12%以上7%以上12.5%去氧膽酸5%以上4%以上豬去氧膽酸15%

體外培育牛黃、天然牛黃、人工牛黃比較表

三種牛黃比較表項目品名體外培育牛黃48游離膽紅素含量對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃游離膽紅素含量對比性研究游離膽紅素含量對比表

批號1234567891011平均值天然牛黃4.4203.2382.0263.7034.3004.503.362.7561.2941.273.823.153體外培育牛黃0.5000.5000.4900.6300.6700.6220.5500.5260.4800.4600.5320.544游離膽紅素含量對比性研究體外培育牛黃、天然牛黃游離膽49HPLC指紋圖譜的比較研究體外培育牛黃與天然牛黃HPLC指紋圖譜的比較研究研究內(nèi)容：根據(jù)牛黃所含化學(xué)成分，我們分別對以下主要成分進行研究：①氨基酸、肽類(蛋白質(zhì))②膽汁酸類③膽紅素類。④微量元素擬定以下樣品前處理方法：酸水用于檢測氨基酸、肽類成分；酸水/醇用于檢測膽汁酸類成分；二甲亞砜用于檢測膽紅素類成分HPLC指紋圖譜的比較研究體外培育牛黃與天然牛黃HPLC指紋501）、10批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC疊加圖譜

10批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC圖譜有很好的一致性圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究1）、10批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-M512、

4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC疊加圖譜

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顯然，不同產(chǎn)地的天然牛黃酸水提取液HPLC-MSTIC圖譜各主要膽汁酸的比例有一定差異圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究2、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸水提取液HPLC-MS523）、10批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC疊加圖譜

顯然，10批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC圖譜有很好的一致性圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究3）、10批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC53

4）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC疊加圖譜（2天然牛黃，13西牛黃，14巴西牛黃，15印度牛黃）

天然牛黃與體外培育牛黃比較，有紫外吸收成分的種類基本一致，但相對含量有差異圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究4）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃酸醇提取液中有紫外吸收545）、10批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊加圖譜

顯然，10批體外培育牛黃二甲亞砜提取液的HPLC圖譜有較好的一致性圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究5）、10批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊加圖譜

顯然556）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊加圖譜（6天然牛黃，16巴西牛黃，17西牛黃，18印度牛黃）

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天然牛黃與體外培育牛黃比較，二甲亞砜提取液中成分種類基本一致，但相對含量稍有差異圖譜HPLC指紋圖譜的比較研究6）、4批天然牛黃與1批體外培育牛黃二甲亞砜提取液HPLC疊56HPLC指紋圖譜的比較研究結(jié)論：1、體外培育牛黃與天然牛黃三個提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亞砜提取液）的成分種類均基本一致，但含量有差異。2、10批體外培育牛黃三個提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亞砜提取液）的HPLC指紋圖譜有較好的一致性，說明體外培育牛黃的工藝是穩(wěn)定的。

HPLC指紋圖譜的比較研究結(jié)論：57天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析類項體外培育牛黃（國家藥品標準）牛黃（藥典2000版）來源本品為以?？苿游锱５男迈r牛膽汁液,配成成石膽汁,在體外培育所得的牛膽紅素鈣結(jié)石。本品為?？苿游锱８稍锏哪懡Y(jié)石。宰牛時，如發(fā)現(xiàn)有牛黃，即濾去膽汁，將牛黃取出，除出外部薄膜，陰干。性狀呈球形、類球形，直徑0.5-3cm，表面光滑，呈黃紅色至棕黃色，體輕，質(zhì)松脆，有同心層紋。氣香，味苦而后甘，有清涼感，嚼之易碎，不粘牙。呈卵形、類球形，直徑0.6-3（4.5）cm，表面黃紅色至棕黃色，體輕，質(zhì)松脆，有同心層紋。氣香，味苦而后甘，有清涼感，嚼之易碎，不粘牙。鑒別粉末加清水調(diào)和，涂于指甲，能將指甲染成黃色。加清水調(diào)和，涂于指甲上，能將指甲染成黃色。顯微鑒別呈正反應(yīng)顯微鑒別呈正反應(yīng)膽紅素鑒別呈正反應(yīng)膽紅素鑒別呈正反應(yīng)膽酸鑒別呈正反應(yīng)膽酸鑒別呈正反應(yīng)去氧膽酸鑒別呈正反應(yīng)去氧膽酸鑒別呈正反應(yīng)無無檢查按藥典附錄水份測定法測定不得過9.0%按藥典附錄水份測定法測定不得過9.0%游離膽紅素吸收度不得超過0.70無含量測定按藥典測定薄層掃描法膽酸含量不得少于6.0%。按藥典薄層掃描法測定膽酸含量不得少于4.0%。按藥典分光光度法測定膽紅素含量不得少于35.0%。按藥典分光光度法測定膽紅素含量不得少35.0%。功能主治清心，豁痰，開竅，涼肝，息風，解毒。用于熱病神昏，中風痰迷，驚厥抽搐，癲癇發(fā)狂，咽喉腫痛，口舌生瘡，癰腫疔瘡。清心，豁痰，開竅，涼肝，息風，解毒。用于熱病神昏，中風痰迷，驚厥抽搐，癲癇發(fā)狂，咽喉腫痛，口舌生瘡，癰腫疔瘡。用法用量0.15-0.35g。多入丸散用；外用適量，研末敷患處。0.15-0.35g。多入丸散用；外用適量，研末敷處。貯藏置陰涼干燥處，遮光，密閉保存，防潮防壓。遮光，密閉，置陰涼干燥處，防潮，防壓。

天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析

質(zhì)量標準對比分析(一)天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析類項體外培育牛黃（國家58質(zhì)量標準對比分析（二）天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準對比分析（2005版藥典）天然牛黃與體外培育牛黃質(zhì)量標準：完全一致質(zhì)量標準對比分析（二）59主要藥效學(xué)對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃主要藥效學(xué)對照性研究抗炎作用：表明ICCB對急性炎癥的滲出和白細胞的趨化均有抑制作用。ICCB的抗炎作用強度與天然牛黃相近。解熱作用：ICCB對酵母所致大鼠的發(fā)熱及對傷寒副傷寒三聯(lián)疫苗致家兔發(fā)熱均有顯著的抑制作用，其作用強度與天然牛黃相似。中樞抑制作用：ICCB對安鈉咖致小鼠驚厥，嗎啡致小鼠豎尾反應(yīng)有明顯的對抗作用，以上作用強度均與天然牛黃相近。人工牛黃粉則無上述中樞抑制作用抗菌作用：ICCB能顯著降低感染金黃色葡萄球菌小數(shù)的死亡率。

主要藥效學(xué)對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃主要藥效學(xué)對照性研60一般藥理對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃一般藥理對照性研究對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響：ICCB具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用，無鎮(zhèn)痛作用。TPN對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用與天然牛黃相同。對心血管系統(tǒng)的影響：ICCB能明顯降低大鼠的血壓，但不影響心率的心電圖。這一作用與天然牛黃一致。對呼吸系統(tǒng)的影響：ICCB和天然牛黃對大鼠的呼吸頻率和幅度均無明顯影響。一般藥理對照性研究體外培育牛黃、天然牛黃一般藥理對照性研究61體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究體外培育牛黃的主要藥效集中反映在中樞作用方面：除了前述抗驚厥、鎮(zhèn)靜、解熱作用外，還有耐缺氧、清除自由基，保護腦細胞，保護心功能的作用。（1）體外培育牛對小鼠密閉缺氧耐受力的影響組別動物數(shù)劑量給藥途徑成活時間X±SD（min）NS1020ml/Kgig31.04±2.88ICCB10800mg/Kgig37.57±2089***ICCB101200mg/Kgig39.54±2.70***ICCB101600mg/Kgig40.02±3.06***PPN1020mg/Kgig38.01±2.95***:p＜0.001體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究組別動物數(shù)劑量給藥途徑62組別動物數(shù)劑量給藥途徑SOD(Nu/mgprc)X±SD腦肝血清心NS920ml/Kgig31.20±10.7980.00±10.79115.57±26.1960.44±9.29ICCB101200mg/Kgig39.90±507*94.68±14.8*203.16±23.73*69.87±8.71*:p＜0.005**:p＜0.01（3）體外培育牛對缺氧小鼠的腦、心、肝組織及血清MDA含量的影響組別動物數(shù)劑量給藥途徑MDAnmol/mg(X±SD)腦心肝血清NS920ml/Kgig5.90±0.98.45±1.968.76±1.906.89±0.71ICCB101200mg/Kgig4.70±11*5.51±1.4**7.29±1.5*5.20±1.02*:p＜0.05**:p＜0.01***:p＜0.001（2）體外培育牛對缺氧小鼠的血清及腦、心、肝組織勻漿SOD活性影響

體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究組別動物數(shù)劑量給藥途徑SOD(Nu/mgprc)X±SD腦63（4）缺氧小鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)改變之電鏡所見對照組治療組神經(jīng)元細胞水腫，胞漿內(nèi)細胞器不同程度變性，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核糖體數(shù)量減少，部分膠質(zhì)細胞核周積液，胞漿空亮，細胞器溶解，部分有髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂，部分無髓神經(jīng)纖維腫脹，呈大小不等泡狀，神經(jīng)絲消失，見局限性神經(jīng)纖維溶解灶。毛細血管管徑不等，內(nèi)皮細胞腫脹，胞漿內(nèi)空泡增多，大部分毛細血管周圍見積液性間隙。僅少量神經(jīng)元細胞輕微變性。線粒體輕度腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴張。核糖體數(shù)量基本正常，少數(shù)膠質(zhì)細胞核周間隙增寬，有髓及無髓神經(jīng)纖維的髓鞘結(jié)構(gòu)規(guī)則。毛細血管內(nèi)皮細胞無明顯腫脹，毛細血管周圍無積液性間隙。體外培育牛黃耐缺氧、中樞神經(jīng)作用的研究（4）缺氧小鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)改變之電鏡所見對照組治療組神經(jīng)元64體外培育牛黃急性、長期毒性試驗體外培育牛黃急性毒性試驗從急性毒性試驗結(jié)果可以看出，體外培育牛黃給予小鼠和大鼠口服后的急性毒性很低。小鼠口服TPN的LD50為9.0（8.0-10.1）g/kg，是人口服用量（0.3g或5mg/kg）的1800倍。大鼠口服TPN的LD50大于10g/kg，是人口服用量的2000倍以上。

體外培育牛黃長期毒性試驗在長期毒性試驗中，大鼠耐受TPN1500mg/kg達35天，犬耐受TPN500mg/kg達33天。結(jié)果表明TPN長期口服大鼠和犬各系統(tǒng)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能無不良影響，而且用藥組動物的體重增長均高于對照組。體外培育牛黃急性、長期毒性試驗體外培育牛黃急性毒性試驗65體外培育牛黃致突變、染色體畸變試驗體外培育牛黃致突變試驗體外培育牛黃在本試驗條件下，從定性的標準和平皿摻入試驗的觀測結(jié)果，其對各受試菌株引起的回復(fù)菌落數(shù)均未超過對照組自發(fā)突變菌落數(shù)的2倍，表明試驗結(jié)果為陰性顯示體外培育牛黃對組氨酸缺陷型沙門氏菌無明顯的致回復(fù)突變作用。

培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗在體外培育牛黃的劑量分別為1.0、10.0和100ug/ml的試驗條件下，對人外周血淋巴細胞誘發(fā)的染色體細胞畸變率增加與溶劑對照組比較，均無統(tǒng)計學(xué)顯著性差別意義，試驗結(jié)果為陰性，表明在試驗條件下，對人外周血淋巴細胞染色體無明顯的致畸變性作用。體外培育牛黃致突變、染色體畸變試驗體外培育牛黃致突變試驗66體外培育牛黃對小鼠微核、