分子克隆工具酶課件

第一篇基因操作原理12/10/20221第一篇基因操作原理12/10/20221

A.用于核酸操作的工具酶B.用于基因克隆的載體C.用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞用于核酸操作的工具酶有哪些？體外重組DNA技術(shù)所需的基本條件？12/10/20222A.用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶有哪些？第二章分子克隆工具酶12/10/20223第二章分子克隆工具酶12/10/2022312/10/2022412/10/20224基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對(duì)野生菌株（或真核生物如酵母）進(jìn)行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。

基因工程工具酶12/10/20225基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性

自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進(jìn)而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對(duì)基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具?；蚬こ坦ぞ呙?2/10/20226自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有

限制性內(nèi)切酶

甲基化酶

DNA連接酶

DNA聚合酶

RNA聚合酶

磷酸激酶和磷酸酶

核酸酶

核酶

基因工程工具酶12/10/20227

限制性內(nèi)切酶基因工程工具酶12/10/20227限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類—用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測(cè)等。12/10/20228限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割12/10/2限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

限制性內(nèi)切酶的分類

限制性內(nèi)切酶的命名

限制性內(nèi)切酶的活性單位限制性內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)12/10/20229限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶12/10/20一、限制與修飾

細(xì)菌的限制—修飾作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制（restriction）現(xiàn)象：E.colikE.coli

B【E.coliB限制

λ（k）】感染不感染1、限制與修飾現(xiàn)象phageλ(K)寄主控制的專一性12/10/202210一、限制與修飾

細(xì)菌的限制—修飾作用1952年，Lur噬菌體侵染細(xì)菌12/10/202211噬菌體侵染細(xì)菌12/10/202211噬菌體侵染細(xì)菌

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因?yàn)镋.coliBphage對(duì)λ(K)進(jìn)行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修飾作用）12/10/202212噬菌體侵染細(xì)菌仍有少量phageλ(K)可

細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系統(tǒng)12/10/202213細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解DNA，為避免自身DNA的降解，細(xì)菌可以修飾（甲基化酶）自身DNA，未被修飾的外來(lái)DNA則會(huì)被降解。

個(gè)別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。R-M系統(tǒng)12/10/202214R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuelease)

是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)脫氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

2、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)12/10/202215限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuele

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arber從

E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。12/10/202216

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arber限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)12/10/202217限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)12/1EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。

限制性核酸內(nèi)切酶的命名12/10/202218EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株

HindIII

HindIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶12/10/202219限制性核酸內(nèi)切酶的命名12/10/202219特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾活性雙功能單一功能雙功能識(shí)別與切割位點(diǎn)分別，隨機(jī)切割，相距較遠(yuǎn)同一位點(diǎn)相距5-10bp對(duì)基因工程中意義無(wú)用非常有用意義不大3、限制與修飾系統(tǒng)的種類12/10/202220特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾活性雙功能單一功能雙功能識(shí)別與切割二、限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由4-8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些識(shí)別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列。12/10/202221二、限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)。斷裂結(jié)果形成的DNA片段，具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。二、限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列12/10/202222在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為

4-8個(gè)堿基，最常見(jiàn)的為

6個(gè)堿基

4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Sau3AⅠ↓GATC

5個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG1、限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度12/10/202223限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為4-8個(gè)堿基，最常見(jiàn)的為

6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：

EcoRⅠG↓AATTC

HindⅢ

A↓AGCTT

7個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：

BbvCⅠ

CC↓TCAGC

PpuMⅠ

RG↓GWCCY

8個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：

NotⅠ

GC↓GGCCGC

SfiⅠGGCCNNNN↓NGGCC12/10/202224

6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：12/10/202224

當(dāng)識(shí)別序列為4個(gè)和6個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列在完全隨機(jī)的情況下，平均每256個(gè)和4096個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（44=256，46=4096）。12/10/202225當(dāng)識(shí)別序列為4個(gè)和6個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)。2、限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)12/10/202226II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性2、限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)識(shí)別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

ABB’A’

ABB’A’

或或12/10/202227識(shí)別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩DNA在限制性核酸內(nèi)切酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置被稱為切割位點(diǎn)，用↓或／表示。

3、限制酶切割的位置12/10/202228DNA在限制性核酸內(nèi)切酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二切割的位點(diǎn)：一般在識(shí)別序列內(nèi)部，如G↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓GG、AGCGC↓T等。

少數(shù)在識(shí)別序列的兩側(cè)，如↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等3、限制酶切割的位置12/10/202229切割的位點(diǎn)：一般在識(shí)別序列內(nèi)部，如G↓GATCC、AT↓CGEcoRⅠ5‘……GAATTC……3’

3’……CTTAAG……5’

不同核酸內(nèi)切酶的特異識(shí)別位點(diǎn)PstⅠ5’……CTGCAG……3’

3’……GACGTC...…5’

3、限制酶切割的位置12/10/202230EcoRⅠ5‘……GAATTC……AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位點(diǎn)核酸內(nèi)切酶HindⅢ對(duì)雙鏈DNA分子的切割作用12/10/202231AAGCTTTTCGAAA三、限制酶產(chǎn)生的末端1、限制酶產(chǎn)生匹配粘端若在對(duì)稱軸5′側(cè)切割底物，DNA雙鏈交錯(cuò)斷開(kāi)產(chǎn)生5′突出粘性末端。

5′－GAATTC－3′EcoRl5′－G－OHP－AATTC－3′

3‘—CTTAAG－5’3‘—CTTAA－P+OH－G－5'12/10/202232三、限制酶產(chǎn)生的末端1、限制酶產(chǎn)生匹配粘端若在對(duì)稱軸5

若在3‘-側(cè)切割，則產(chǎn)生3’突出粘性末端，如PstⅠ：5'—CTGCAG－3'Pstl5'—CTGCA-3'5'—G－3'3'－GACGTC-5'3'—G-5'十3'-ACGT－5'12/10/202233若在3‘-側(cè)切割，則產(chǎn)生3’突出粘性末端，如在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，如

HaeⅢ（GG↓CC）和

EcoRV（GAT↓ATC）。

2、限制酶產(chǎn)生平末端12/10/202234在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，12/10/20223512/10/202235粘性末端、平整末端200多種限制性內(nèi)切酶，切點(diǎn)各不相同。12/10/202236粘性末端、平整末端12/10/202236許多限制酶切割DNA產(chǎn)生非對(duì)稱突出末端。當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí)，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的，如

BbcⅠ,它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下：

CC↓TCAGCGGAGTCG3、限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出末端12/10/202237許多限制酶切割DNA產(chǎn)生非對(duì)稱突出末端。3、限制酶產(chǎn)生非

平齊末端（如

SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’

5’粘性末端（如

EcoRⅠ）

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’

3’粘性末端（如Pst

Ⅰ）三種酶切末端12/10/202238

平齊末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）54、同裂酶同裂酶來(lái)源不同的限制酶識(shí)別相同的核苷酸靶序列。同序同切酶、同序異切酶、同功多位等。12/10/2022394、同裂酶同裂酶12/10/202239同尾酶來(lái)源不同，識(shí)別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。5、同尾酶12/10/202240同尾酶5、同尾酶12/10/2022405’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡBamHⅠ

BclⅠ

BglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可因粘性末端的互補(bǔ)而彼此再連接起來(lái)。12/10/2022415’-GGATCC-3’BamHⅠ5’-TGATCA-3’

限制酶切割DNA時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說(shuō)在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶難以發(fā)揮切割活性。四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響12/10/202242限制酶切割DNA時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位20μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫1小時(shí)，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個(gè)酶單位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)12/10/202243限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位20μLBuff

對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛(ài)。五、位點(diǎn)偏愛(ài)（Sitepreference）

12/10/202244對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱酶切反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)組成：

酶、底物和反應(yīng)緩沖液，并且還需要合適的反應(yīng)溫度。

六、酶切反應(yīng)條件12/10/202245酶切反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)組成：六、酶切反應(yīng)條件12/10/202245II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20-100mlTT37℃1-1.5hr0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量12/10/202246II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切1、緩沖液常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定PH的緩沖劑、Mg2+、牛血清蛋白(BSA)、二硫蘇糖醇(DTT)。六、酶切反應(yīng)條件12/10/2022471、緩沖液六、酶切反應(yīng)條件12/10/2022472、反應(yīng)溫度

大多數(shù)酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度37度。3、反應(yīng)時(shí)間通常是小時(shí)或更多，許多酶延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可減少酶量。4、終止酶切的方法

EDTA可螯合Mg2+，從而可終止酶切反應(yīng)；加熱。12/10/2022482、反應(yīng)溫度12/10/202248限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬

EcoRⅠ在正常情況下識(shí)別GAATTC序列發(fā)生切割，但如果緩沖液中甘油濃度超過(guò)5%，其識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生松動(dòng)，可在AATT處發(fā)生切割，EcoRⅠ這種特殊的識(shí)別能力叫做星活性，用

EcoRⅠ*表示。星活性可造成位點(diǎn)切割機(jī)率不等，降解不完全。

七、星星活性

（Staractivity

）

12/10/202249限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬七、星星活性（Staract影響因素：甘油濃度12-20%，酶與DNA比例，離子強(qiáng)度，45%聚乙二醇(PEG)，有機(jī)溶劑，8%二甲基亞楓，二價(jià)陽(yáng)離子，12%乙醇。七、星星活性

（Staractivity

）

12/10/202250影響因素：七、星星活性（Staractivity）抑制星星活性的措施：如減少酶的用量（可避免過(guò)份酶切），減少甘油濃度，保證反應(yīng)體系中無(wú)有機(jī)溶劑或乙醇，提高離子強(qiáng)度到100～150mM（如果不會(huì)抑制酶的活性的話），降低反應(yīng)pH至pH7.0，以及保證使用Mg2+作為二價(jià)陽(yáng)離子。12/10/202251抑制星星活性的措施：12/10/202251限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)影響因素：溫度、緩沖液、時(shí)間、反應(yīng)體積和甘油濃度、DNA純度和結(jié)構(gòu)等。八、影響酶活性的因素12/10/202252限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)影響因素：八、影響酶活性的因素12/101、底物DNA

（1）DNA純度

RNA與E結(jié)合影響有效酶濃度；

八、影響酶活性的因素12/10/2022531、底物DNA八、影響酶活性的因素12（1）DNA樣品的純度蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間12/10/202254（1）DNA樣品的純度蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、S（2）DNA濃度

[DNA]過(guò)大，抑制酶活，影響酶分子擴(kuò)散

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

12/10/202255（2）DNA濃度12/10/202255（3）DNA樣品的甲基化程度

大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等。哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。12/10/202256（3）DNA樣品的甲基化程度大腸桿菌中的dam（4）識(shí)別位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)特異性序列

如：pBR322DNA有4個(gè)

NarⅠ切點(diǎn)(GGCGCC)其中2個(gè)切點(diǎn)用1U酶水解1h完全切開(kāi),2個(gè)切點(diǎn)用50U酶水解16h水解不完全。

XmaⅢ

切點(diǎn)（CGGCCG）在GGCGGCCGCC時(shí)不切割。12/10/202257（4）識(shí)別位點(diǎn)及鄰近位點(diǎn)特異性序列12/10/202257（5）DNA二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)

如：超螺旋DNA(病毒或質(zhì)粒)比線狀DNA需酶多（6）提取時(shí)混入雜質(zhì)可改變識(shí)別特異性

如：

高濃度Hg2+、酚、

氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。12/10/202258（5）DNA二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)12/10/2022582、反應(yīng)系統(tǒng)因素

高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity（星號(hào)活性）現(xiàn)象。Example：

EcoRI

在正常條件下識(shí)別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。12/10/2022592、反應(yīng)系統(tǒng)因素高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、（1）緩沖液（無(wú)菌、無(wú)污染）（2）金屬離子

如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+

代替Mg2+

（如HindⅢ，EcoRI）則特異性改變。

離子濃度不合適會(huì)抑制酶活。12/10/202260（1）緩沖液（無(wú)菌、無(wú)污染）12/10/202260（3）牛血清蛋白(BSA)BSA是酶穩(wěn)定劑，可避免熱、表面張力、化學(xué)品導(dǎo)致的酶變性。過(guò)量BSA會(huì)引起電泳拖尾。12/10/202261（3）牛血清蛋白(BSA)12/10/202261二硫蘇糖醇(DTT)或β—巰基乙醇：維持酶活性的穩(wěn)定。

Tris-HCl或Tris-Ac：維持酶活性適合的PH環(huán)境。12/10/202262二硫蘇糖醇(DTT)或β—巰基乙醇：12/10/202262重組DNA前的切割

構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交

用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針

亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用12/10/202263重組DNA前的切割限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用12/10/202甲基化酶的種類依賴甲基化酶的限制系統(tǒng)甲基化酶對(duì)限制性酶的影響第二節(jié)甲基化酶

(methylase)12/10/202264第二節(jié)甲基化酶(methylase)12/10/2022甲基化酶(methylase)Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶兩種酶分子組成。大多數(shù)限制酶都已分離出相應(yīng)的甲基化酶。甲基化酶也稱修飾酶(modificationenzyme)，用來(lái)修飾限制酶的識(shí)別序列，在該序列位點(diǎn)的胞嘧啶（C）5-氨基上加一個(gè)甲基，使得該序列可以被限制性內(nèi)切酶識(shí)別而免于切割。

12/10/202265甲基化酶(methylase)Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核1、Dam甲基化酶

Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。2、Dcm甲基化酶

Dcm甲基化酶識(shí)別CCAGG或CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。一、甲基化酶的種類12/10/2022661、Dam甲基化酶一、甲基化酶的種類12/10/202266

甲基化酶分兩類：維持性甲基化酶：用于在新合成的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。

用甲基化酶進(jìn)行甲基化的作用封閉DNA鏈中的某些識(shí)別位點(diǎn)，保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)12/10/202267

甲基化酶分兩類：12/10/2022671、修飾酶切位點(diǎn)2、產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)3、對(duì)基因組作圖的影響二、甲基化對(duì)限制酶切的影響12/10/2022681、修飾酶切位點(diǎn)二、甲基化對(duì)限制酶切的影響12/10/202大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenowDNA聚合酶T４噬菌體DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶第三節(jié)DNA聚合酶（DNApolymerase）12/10/202269大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ第三節(jié)DNA聚合酶（DNADNA聚合酶

指在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3’–OH末端聚合DNA鏈的一類酶。

DNA聚合酶在DNA復(fù)制時(shí)起關(guān)鍵作用。一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

（DNApolymerase）12/10/202270DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolDNA聚合酶DNA聚合酶主要有三類：聚合酶Ⅰ（polⅠ），聚合酶Ⅱ(polⅡ)，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ參與DNA修復(fù)，聚合酶Ⅲ參與DNA復(fù)制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。12/10/202271DNA聚合酶12/10/202271DNA聚合酶Ⅰ和

Ⅲ的比較12/10/202272DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比較12/10/202272DNA聚合酶的特點(diǎn)：

①

需模板(DNA或RNA)；

②

需引物；

③

具有三種酶活性，即5′

→3′聚合酶活性；5′

→3′外切酶活性和3′

→5′外切外切酶活性。12/10/202273DNA聚合酶的特點(diǎn)：12/10/202273來(lái)源E.coli，由染色體DNA基因編碼。商品上用的此酶來(lái)源于PhageNM964整合的溶源性

E.coli。結(jié)構(gòu)

單鏈多肽鏈，MW=109，000D。一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

（DNApolymerase）12/10/202274來(lái)源一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeras大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性交換（置換）反應(yīng)1、大腸桿菌DNA聚合酶I的活性12/10/202275大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質(zhì)：5‘→3‘的DNA聚合酶CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGGGATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′5′→3′聚合酶活性5′→3′外切酶活性

12/10/202276CCGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCTCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′3′→5′外切酶活性

交換反應(yīng)如果只有一種dNTP存在，5′→3′外切核酸酶活性將從3′－OH端降解DNA，然后在該位置發(fā)生一系列連續(xù)的合成和外切反應(yīng)，直到露出與該dNTP互補(bǔ)的堿基。12/10/202277TCGATAGCCE.coliDNApolIMg2+T2、大腸桿菌DNA聚合酶I的用途切口平移（Nicktranslation）法標(biāo)記DNA制備32P標(biāo)記的探針

DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通過(guò)DNA缺口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。此時(shí)，DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’聚合酶活性同時(shí)發(fā)生。12/10/2022782、大腸桿菌DNA聚合酶I的用途切口平移（Nicktr5‘3’5‘↓3’

3‘5’

5‘3’5‘↓3’3‘5’

5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未經(jīng)標(biāo)記的核苷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸12/10/2022795‘3’5‘↓32P標(biāo)記的DNA雜交探針的制備5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

********(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子。(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口。(c)polⅠ從5‘-P移去一個(gè)核苷酸。(d)polⅠ將32P標(biāo)記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸。(e)重復(fù)(c)(d)的步驟，缺口沿5’-3‘方向移動(dòng)，形成32P標(biāo)記的核苷酸合成的DNA鏈。12/10/20228032P標(biāo)記的DNA雜交探針的制備5‘3‘5‘3‘5探針（probe）

探針：用來(lái)探知被測(cè)物存在的小DNA或RNA叫做探針。

標(biāo)記物：探針上結(jié)合有易被檢測(cè)的化合物稱為標(biāo)記物。

分子雜交：探針DNA或RNA與被測(cè)物的互補(bǔ)結(jié)合叫做分子雜交（molecularhybridization）。12/10/202281探針（probe）探針：用來(lái)探知被測(cè)物存在的小DNA或來(lái)源

E.coliDNAPolymeraseⅠ經(jīng)蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970）DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶N端(76kd)+C

端（36kd）

Klenow

5′→3′聚合3′→5′外切5′→3′外切二、Klenow

DNA聚合酶無(wú)5′→3′外切酶活性12/10/202282來(lái)源DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶N端(76kdKlenow酶的基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5′粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列

12/10/202283Klenow酶的基本用途：12/10/2022835‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…5’

KlenowdATPdTTP補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5′粘性末端12/10/2022845‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T5‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…5’

Klenowa-32P-pppdAdTTPDNA片段的同位素末端標(biāo)記Klenow在無(wú)底物時(shí)只進(jìn)行3′→5′外切；有底物存在時(shí)則聚合。這種標(biāo)記也稱作交換標(biāo)記，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。12/10/2022855‘…G-C-T-G-OHP-A-A-TT4DNA聚合酶

來(lái)源：T4Phage感染的

E.coli

結(jié)構(gòu)：MW=114,000d

活性：

5′→3′聚合活性；

3′→5′外切活性，對(duì)單鏈活性大于雙鏈DNA，外切酶活性比Klenow大200倍

用途

填補(bǔ)或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同Klenow）3′-粘性末端的標(biāo)記制備DNA探針,同Klenow末端標(biāo)記。

12/10/202286T4DNA聚合酶

來(lái)源：T4Phage感染的E.cT7DNA聚合酶（測(cè)序酶）

來(lái)源：T7Phage感染的

E.coli

結(jié)構(gòu)：由2個(gè)蛋白亞基組成：T7phagegene5蛋白+宿主硫氧蛋白

活性：5′→3′聚合，持續(xù)反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)，所以合成的DNA鏈長(zhǎng)。故在DNA測(cè)序中很優(yōu)越。3′→5′外切，是DNA聚合酶Ⅰ的1000倍。12/10/202287T7DNA聚合酶（測(cè)序酶）

來(lái)源：T7Phage感染用途復(fù)制較長(zhǎng)的模板，在測(cè)序中可讀出較長(zhǎng)的序列用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。

與T４DNApol一樣，平齊粘性末端。定點(diǎn)突變中互補(bǔ)鏈的合成。5′3′3′5′12/10/202288用途5′3′3′5′12/10/202288修飾的T7DNA聚合酶(測(cè)序酶)

來(lái)源：

天然T７DNA聚合酶經(jīng)修飾處理

結(jié)構(gòu)：

同T７聚合酶。

用還原劑、分子氧、低濃度Fe２+與酶保溫幾天，可使PhageT7gene5蛋白N-端3′→5′外切酶活性中心失活(O-修飾)。

即：5′→3′聚合酶作用提高，持續(xù)性長(zhǎng)。3′→5′外切作用下降99%以上。12/10/202289修飾的T7DNA聚合酶(測(cè)序酶)

來(lái)源：12/10/五、TaqDNA

聚合酶(Thermusaqraticus)

來(lái)源：從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種。

結(jié)構(gòu)：?jiǎn)蝸喕鵐W=94,000d。

活性：聚合最適溫度為75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性

。12/10/202290五、TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus

用途：PCR

反應(yīng)。測(cè)序，高溫下進(jìn)行

DNA

合成可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。12/10/202291

用途：12/10/202291六、反轉(zhuǎn)錄酶

(reversetranscriptase)

依賴于RNA的DNA聚合酶來(lái)源：商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種來(lái)自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒

(AMV)。

來(lái)自能表達(dá)

Moloney

鼠白血病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶基因的

E.coli。

12/10/202292六、反轉(zhuǎn)錄酶

(reversetranscriptase酶類別肽鏈5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，000β94，000

++++M-MLV84，000++結(jié)構(gòu)和活性：12/10/202293酶類別肽鏈5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，00活性：六、反轉(zhuǎn)錄酶

(reversetranscriptase)

依賴于RNA的DNA聚合酶5‘→3‘的DNA聚合酶活性（需要Mg2+

）5‘→3‘RNA核酸外切酶活性（RNAseH）3‘→5‘RNA核酸外切酶活性（RNAseH）產(chǎn)生含5′磷酸及3′羥基的長(zhǎng)4~20個(gè)堿基的核苷酸。12/10/202294活性：六、反轉(zhuǎn)錄酶

(reversetranscript反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈。反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA12/10/202295反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP3’AAAA反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈。反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’DNA3’12/10/202296反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’對(duì)RNA:DNA

雜交體中的RNA

特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用

NaOH

降解RNA

模板的步驟。反轉(zhuǎn)錄酶用途：12/10/202297對(duì)RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了七、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)

(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）)來(lái)自小牛胸腺，只在前淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分化早期階段中存在的罕見(jiàn)的

DNA聚合酶

(Chang和Bollum,1986)。來(lái)源：MW=60,000d.結(jié)構(gòu)：12/10/202298七、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)七、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)

(不依賴模板的DNA聚合酶)催化dNTP摻入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端；反應(yīng)不需模板

DNA，需Co2+或Mg2+

?；钚裕?2/10/202299七、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)七、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)

(不依賴模板的DNA聚合酶)用途：

克隆DNA片段時(shí)加上互補(bǔ)同聚物末端，便于與載體連接。

末端標(biāo)記12/10/2022100七、末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)來(lái)TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs。5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAOH3‘p5‘12/10/2022101來(lái)TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNT5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HO

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH

3‘

p5‘

AAAAAAAAA12/10/20221025‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTCo2+依賴于DNA的RNA聚合酶連接酶T4多核苷酸激酶咸性磷酸酶第四節(jié)其他分子克隆工具酶核酸酶核酸酶抑制劑瓊脂糖酶DNA結(jié)合蛋白其他酶12/10/2022103依賴于DNA的RNA聚合酶第四節(jié)其他分子克隆工具酶核酸酶來(lái)源T7、T4噬菌體RNA聚合酶在

E.coli

（或細(xì)菌）中的克隆表達(dá)。

E.coliRNA聚合酶。SP6噬菌體RNA聚合酶

一、依賴于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）12/10/2022104來(lái)源一、依賴于DNA的RNA聚合酶（DNAdependen活性在DNA指導(dǎo)下合成RNA，結(jié)合于啟動(dòng)子部位，轉(zhuǎn)錄無(wú)意義鏈(-)產(chǎn)生與有意義鏈相似(以U代替模板中T)的鏈。

轉(zhuǎn)錄鏈為無(wú)意義鏈，負(fù)鏈(-)。

不轉(zhuǎn)錄鏈為有意義鏈，正鏈(+)。一、依賴于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）12/10/2022105活性一、依賴于DNA的RNA聚合酶（DNAdependen3′

啟動(dòng)子（promoter)

終止子(terminator)模板鏈（templattestrand）反意義鏈(antisensestrand)有意義鏈(sensestrand)非信息區(qū)DNA5′5′3′編碼鏈12/10/20221063′啟動(dòng)子（promoter)終止12/10/202210712/10/2022107用途體外合成RNA分子用于表達(dá)外源基因（詳見(jiàn)表達(dá)載體一章）一、依賴于DNA的RNA聚合酶（DNAdependentRNApolymerase）12/10/2022108用途一、依賴于DNA的RNA聚合酶（DNAdepende二、DNA連接酶（ligase）

DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)1967年，世界上有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶(1igase)。12/10/2022109二、DNA連接酶（ligase）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)12/1

DNA連接酶的作用特點(diǎn)：

能夠催化DNA中相鄰的3’-羥基和5’-磷酸基末端之間形成3′，5′-磷酸二酯鍵;吸能反應(yīng)。二、DNA連接酶（ligase）12/10/2022110DNA連接酶的作用特點(diǎn)：二、DNA連接酶（ligase）12/10/202211112/10/2022111二、DNA連接酶（ligase）

種類

T4DNA連接酶

大腸桿菌DNA連接酶

12/10/2022112二、DNA連接酶（ligase）種類12/10/2022二、DNA連接酶（ligase）T4DNA連接酶

可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈DNA分子相互連接。

反應(yīng)底物為黏端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。反應(yīng)系統(tǒng)中必須加有輔助因子ATP

12/10/2022113二、DNA連接酶（ligase）T4DNA連接酶12/1AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′

5′5′5′(1)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接AATTC······GG······CTTAA5′

5′ATGCTATAGCTAT4連接酶T4連接酶(2)(1)(2)12/10/2022114AATTC······GG······二、DNA連接酶（ligase）大腸桿菌DNA連接酶

只能連接帶匹配粘末端的DNA分子。反應(yīng)系統(tǒng)中必須含NAD作為輔助因子。12/10/2022115二、DNA連接酶（ligase）大腸桿菌DNA連接酶112/10/202211612/10/2022116

磷酸激酶催化5′-OH加P（標(biāo)記）

咸性磷酸酶去除5′-P（防止自身環(huán)化）

三、T4多核苷酸激酶和堿性磷酸酶12/10/2022117

磷酸激酶催化5′-OH加P（標(biāo)記）三、T4多核三、T4多核苷酸激酶和堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶（標(biāo)記）

在分子克隆中呈兩種反應(yīng)，其一是正反應(yīng)，指將ATP的γ－磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至無(wú)磷酸的DNA5′末端，用于對(duì)缺乏5′磷酸的DNA進(jìn)行磷酸化。其二是交換反應(yīng)，在過(guò)量ATP存在的情況下，該酶可將DNA的5′端磷酸轉(zhuǎn)移給ADP，然后DNA從ATP中獲得γ－磷酸而重新磷酸化。12/10/2022118三、T4多核苷酸激酶和堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶（標(biāo)記）1三、T4多核苷酸激酶和堿性磷酸酶堿性磷酸酶（防止自身環(huán)化）

來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來(lái)自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNAOH3‘

5‘HO5‘pppdN5‘pppNBAP/CIP5‘HOdN5‘HON12/10/2022119三、T4多核苷酸激酶和堿性磷酸酶堿性磷酸酶（防止自身環(huán)化）PNKasePMase

5′HOATTAGC………CCGTAATCG………GGCOH5′多核苷酸激酶磷酸甲酯酶Phosphomonoesterase5′pATTAGC………CCGTAATCG………GGCp5′12/10/2022120PNKasePMase5′HOATTAGC五、核酸酶（nuclease）Bal13核酸酶單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶來(lái)自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）從DNA末端同時(shí)降解兩條鏈。

用于基因表達(dá)調(diào)控序列的研究。12/10/2022121五、核酸酶（nuclease）Bal13核酸酶12/10Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+12/10/2022122Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNA五、核酸酶（nuclease）S1核酸酶

降解單鏈核酸。來(lái)自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）

用于把具粘性末端的

DNA

變?yōu)槠烬R末端

的

DNA。

在

DNA

部分變性條件下，能在富含AT

區(qū)切斷

DNA。12/10/2022123五、核酸酶（nuclease）S1核酸酶12/10/2六、核酶（ribozyme）

具有酶活性的RNA片段。

是真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物地內(nèi)含子本身含有的前導(dǎo)序列，能在離體條件下特異地催化內(nèi)含子剪切。1981Cech和Altman首次發(fā)現(xiàn)，并因此獲得1989年的諾貝爾獎(jiǎng)。

核酶可以作為RNA的限制性內(nèi)切酶用于基因操作。12/10/2022124六、核酶（ribozyme）具有酶活性的RNA片段。1（一）思考與探究1.限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開(kāi)嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)…CTGCA

(2)…AC

(3)GC…

…G

…TG

CG…（4）…G

(5)

G…

(6)…GC

…CTTAA

ACGTC…

…CG(7)GT…

(8)AATTC…

CA…

G…你是否能用DNA連接酶將它們連接起來(lái)？

12/10/2022125（一）思考與探究1.限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開(kāi)答：2和7能連接形成…ACGT…

…TGCA…；4和8能連接形成…GAATTC…

…CTTAAG…；3和6能連接形成…GCGC…

…CGCG…；1和5能連接形成…CTGCAG…

…GACGTC…。12/10/2022126答：12/10/20221262.聯(lián)系你已有的知識(shí)，想一想，為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？提示：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來(lái)的，它們各自可以識(shí)別和切斷DNA上特定的堿基序列。細(xì)菌中限制酶之所以不切斷自身DNA，是因?yàn)槲⑸镌陂L(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，對(duì)于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。12/10/20221272.聯(lián)系你已有的知識(shí)，想一想，為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本3.網(wǎng)上查詢：DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？提示：迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。12/10/20221283.網(wǎng)上查詢：DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？提示：提問(wèn)與解答環(huán)節(jié)QuestionsAndAnswers提問(wèn)與解答環(huán)節(jié)謝謝聆聽(tīng)·學(xué)習(xí)就是為了達(dá)到一定目的而努力去干,是為一個(gè)目標(biāo)去戰(zhàn)勝各種困難的過(guò)程,這個(gè)過(guò)程會(huì)充滿壓力、痛苦和挫折LearningIsToAchieveACertainGoalAndWorkHard,IsAProcessToOvercomeVariousDifficultiesForAGoal謝謝聆聽(tīng)LearningIsToAchieveAC第一篇基因操作原理12/10/2022131第一篇基因操作原理12/10/20221

A.用于核酸操作的工具酶B.用于基因克隆的載體C.用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞用于核酸操作的工具酶有哪些？體外重組DNA技術(shù)所需的基本條件？12/10/2022132A.用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶有哪些？第二章分子克隆工具酶12/10/2022133第二章分子克隆工具酶12/10/2022312/10/202213412/10/20224基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶是對(duì)野生菌株（或真核生物如酵母）進(jìn)行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。

基因工程工具酶12/10/2022135基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性

自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNA進(jìn)而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對(duì)基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具?；蚬こ坦ぞ呙?2/10/2022136自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有

限制性內(nèi)切酶

甲基化酶

DNA連接酶

DNA聚合酶

RNA聚合酶

磷酸激酶和磷酸酶

核酸酶

核酶

基因工程工具酶12/10/2022137

限制性內(nèi)切酶基因工程工具酶12/10/20227限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類—用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測(cè)等。12/10/2022138限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割12/10/2限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

限制性內(nèi)切酶的分類

限制性內(nèi)切酶的命名

限制性內(nèi)切酶的活性單位限制性內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)12/10/2022139限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶12/10/20一、限制與修飾

細(xì)菌的限制—修飾作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的限制（restriction）現(xiàn)象：E.colikE.coli

B【E.coliB限制

λ（k）】感染不感染1、限制與修飾現(xiàn)象phageλ(K)寄主控制的專一性12/10/2022140一、限制與修飾

細(xì)菌的限制—修飾作用1952年，Lur噬菌體侵染細(xì)菌12/10/2022141噬菌體侵染細(xì)菌12/10/202211噬菌體侵染細(xì)菌

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因?yàn)镋.coliBphage對(duì)λ(K)進(jìn)行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修飾作用）12/10/2022142噬菌體侵染細(xì)菌仍有少量phageλ(K)可

細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系統(tǒng)12/10/2022143細(xì)菌中存在位點(diǎn)特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解DNA，為避免自身DNA的降解，細(xì)菌可以修飾（甲基化酶）自身DNA，未被修飾的外來(lái)DNA則會(huì)被降解。

個(gè)別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。R-M系統(tǒng)12/10/2022144R-M系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。細(xì)菌限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuelease)

是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開(kāi)的內(nèi)脫氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

2、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)12/10/2022145限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuele

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arber從

E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。12/10/2022146

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1968Linn和Arber限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)12/10/2022147限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)12/1EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。

限制性核酸內(nèi)切酶的命名12/10/2022148EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株

HindIII

HindIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶12/10/2022149限制性核酸內(nèi)切酶的命名12/10/202219特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾活性雙功能單一功能雙功能識(shí)別與切割位點(diǎn)分別，隨機(jī)切割，相距較遠(yuǎn)同一位點(diǎn)相距5-10bp對(duì)基因工程中意義無(wú)用非常有用意義不大3、限制與修飾系統(tǒng)的種類12/10/2022150特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制和修飾活性雙功能單一功能雙功能識(shí)別與切割二、限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由4-8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些識(shí)別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)或靶序列。12/10/2022151二、限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)。斷裂結(jié)果形成的DNA片段，具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。二、限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列12/10/2022152在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切