實驗一：質(zhì)粒提取實驗

實驗一質(zhì)粒DNA的提取、酶切及瓊脂糖凝膠電泳分子生物學(xué)實驗實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!一實驗?zāi)康恼莆諌A裂解法分離質(zhì)粒DNA的基本原理和操作要點。了解限制性內(nèi)切酶作用的原理、特點和酶切質(zhì)粒DNA的試驗方法學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)

質(zhì)粒是一種染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子，具有雙鏈共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。是染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。

二實驗原理實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!

培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增收集和裂解細(xì)菌分離和純化質(zhì)粒DNA

共價閉環(huán)DNA（cccDNA）線狀DNA（lcDNA）開環(huán)DNA（ocDNA）

三個基本步驟質(zhì)粒存的形態(tài)實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!堿裂解法利用宿主菌巨大線狀染色體DNA與相對較小的閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)的差異來提取質(zhì)粒DNA。堿變性DNA時，線狀基因組DNA變性充分而質(zhì)粒DNA處于拓?fù)淅p繞的自然狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)去除變性條件時（酸中和），質(zhì)粒DNA迅速準(zhǔn)確配置重新形成完全天然超螺旋狀分子，而難于復(fù)性的長鏈線狀的基因組DNA則與破裂的細(xì)胞壁、細(xì)菌蛋白相互纏繞成大型復(fù)合物，被SDS包蓋，當(dāng)K+取代Na+時這些復(fù)合物會從溶液中沉淀下來，附在細(xì)胞碎片上一起被離心除去。實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!Ⅱ型酶識別的DNA序列一般含有4～6個核苷酸。有的在識別順序的對稱軸上對雙鏈DNA同時切割產(chǎn)生平末端；有的在識別順序的雙側(cè)末端DNA雙鏈產(chǎn)生粘性末端。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ型酶所識別的序列具有反向?qū)ΨQ的結(jié)構(gòu)，或稱為回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒DNA通常都具有一個或多個限制性內(nèi)切酶酶切識別序列，可被相應(yīng)限制性內(nèi)切酶切出相應(yīng)數(shù)量的切口，從而產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的酶切片斷。本實驗采用的EcoRⅠ和Hind的識別序列和酶切位點分別為

GAATTC和AAGCTTCTTAAGTTCGAA

實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!4℃，10000rpm，離心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管加700μL的氯仿：異戊醇［V:V＝24:1］（混勻），冰上靜置5min4℃，10000rpm，離心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管

加1.0mL無水乙醇（充分混勻），-20℃放置20min4℃，10000rpm，離心10min

，棄上清加入500μL70%乙醇，將沉淀懸起

4℃，5000r/min離心5min，棄上清（用軟紙將管內(nèi)乙醇吸干）即可。實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!四實驗結(jié)果實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!質(zhì)粒檢測：

電泳檢測：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說明有RNA污染。實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。

在堿性環(huán)境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小?？梢苑蛛x相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。共價閉環(huán)超螺旋DNA＞直線DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!接含質(zhì)粒的單菌落于2mlLBAmp+液體培養(yǎng)基中370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過夜取2.0mL菌液入2.0ml的dorf管中5000rpm、離心5min，棄上清，收集菌體200uL溶液I+5uLRNA酶懸浮菌體（充分混勻），冰上靜置5min

加入400uL溶液II（輕輕混勻），室溫靜置5min裂解菌體加入300uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置5min質(zhì)粒DNA復(fù)性三實驗步驟

實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!取實驗一中提取的質(zhì)粒，向其中加入10μL滅菌的雙蒸水使其充分溶解，測定其dsDNA濃度。然后按下表進行操作：實驗組對照組(不做）Buffer40EcolⅠ30HindⅢ30質(zhì)粒XXddH2O10-X20-X總體積2020充分混勻后于37℃保溫2-3h。（注最終反應(yīng)體系中質(zhì)粒濃度至少達(dá)到1.2μg/μL）實驗一：質(zhì)粒提取實驗共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!三實驗步驟

制膠

——1.0％瓊脂糖凝膠(50ml)

凝膠板的制備

——小心加入2－3μlEB，搖勻（污染EB吸頭，不宜再回收使用）

點樣——樣品20μl，與4μl溴酚蘭混勻(DNAmaker3μl加入10μl水與4μl溴酚蘭混勻)電泳——穩(wěn)壓80v，DNA向陽極移動,大約50-60min