基因工程制藥蘇州培訓(xùn)

基因工程制藥簡介張義浜2017-05-20概述目的基因的獲得基因的表達(dá)基因工程菌的培養(yǎng)基因工程藥物的分離純化傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在的問題:1.材料來源或制造技術(shù)困難而無法研制出產(chǎn)品；

2.從動(dòng)物臟器中提取易感染病毒；

3.存在免疫原性，使用受限制?；蚬こ讨扑幍膬?yōu)點(diǎn)大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)利用基因工程和蛋白質(zhì)工程對(duì)生理活性物質(zhì)進(jìn)行修飾和改造，提高藥效價(jià)值獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物

用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的，主要是藥用活性蛋白質(zhì)/多肽，包括：（1）免疫相關(guān)蛋白各種抗原、單克隆抗體。（2）細(xì)胞因子如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO（3）激素胰島素、生長激素、心鈉素、人腦激素、人松馳激素。（4）酶類尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。早期部分基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時(shí)間產(chǎn)品研制國家用途上市國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗1983美國乙肝1986歐洲人白細(xì)胞介素（IL）1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國我國批準(zhǔn)上市的部分生物技術(shù)藥物批準(zhǔn)年份藥品批準(zhǔn)年份藥品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰島素、Anti-CD3鼠源單抗1992IFN-α2a2000人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表皮生長因子（EGF）、EGF衍生物霍亂疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源單抗凝乳劑1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核嵌合抗體注射液重組葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）2004重組人p53腺病毒注射液抗EGFR人源單抗1997粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）重組鏈激酶（γ-SK）、EPO2005重組人腦利鈉肽、重組人血管內(nèi)皮抑素重組人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生長激素（GH）痢疾疫苗、牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）2006重組TNFR-Fc融合蛋白

什么是基因工程技術(shù)？ 基因工程（geneticengineering）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體DNA技術(shù)，基因克隆或分子克隆，指將不同生物的遺傳物質(zhì)——基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。制備基基因工工程藥藥物的的基本本過程程獲得目目的基基因↓↓構(gòu)構(gòu)建重重組質(zhì)質(zhì)粒↓↓組組建基基因工工程菌菌(或細(xì)胞胞)↓↓培養(yǎng)工工程菌菌↓↓產(chǎn)產(chǎn)物物分離離純化化↓↓除除菌菌過濾濾↓↓半半成品品檢定定↓↓成成品品檢定定↓↓包包裝裝上游階段選擇表表達(dá)系系統(tǒng)主主要考考慮：：必須保保證所所表達(dá)達(dá)的蛋蛋白質(zhì)質(zhì)具有有生物物活性性考慮基基因工工程蛋蛋白質(zhì)質(zhì)表達(dá)達(dá)量的的多少少蛋白質(zhì)質(zhì)分離離純化化的難難易程程度下游階段基因的的克隆工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基目的基基因的的獲得得一、反反轉(zhuǎn)錄錄法二、反反轉(zhuǎn)錄錄PCR三、化化學(xué)合合成法法常用的的方法法:一、反反轉(zhuǎn)錄錄法為了克克隆編編碼某某種特特異蛋蛋白質(zhì)質(zhì)多肽的的DNA序列，，可以以從產(chǎn)產(chǎn)生該該蛋白質(zhì)的的真核核細(xì)胞胞中提提取mRNA,以其為模模板，，在反反轉(zhuǎn)錄錄酶的的作用用下，，反轉(zhuǎn)錄錄生成成該蛋蛋白質(zhì)質(zhì)mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈鏈），，再以以cDNA第一鏈鏈為模模板，，在DNA聚合酶酶Ⅰ作用下，，最終終合成成編碼碼該多多肽的的雙鏈鏈DNA序列。。cDNA克隆示意圖DNA聚合酶ImRNA

反轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1二、反反轉(zhuǎn)錄錄PCR提取組組織或或細(xì)胞胞中的的總RNA，以其其中的的mRNA作為模模板，采采用Oligo(dT)或隨機(jī)機(jī)引物物利用用逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶酶反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄成成cDNA第一鏈，直直接以以其為為模板（不需需要合合成cDNA第二鏈鏈）進(jìn)行行PCR擴(kuò)增，獲得得目的基基因，，用于于重組組、克克隆。。三、化化學(xué)合合成法法前提：：核苷苷酸序列已已知；；或已知知其蛋蛋白質(zhì)質(zhì)的氨氨基酸酸序列列，再再推導(dǎo)導(dǎo)出核核苷酸酸序列列限制性性：1）不能能直接合成太太長的的基因因；2）遺傳傳密碼碼的簡簡并性性可導(dǎo)導(dǎo)致中中性突突變；；3）成本較高DNA合成儀基因的克隆隆與表表達(dá)基因表表達(dá)：：基因在在生物物體中中的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄、、翻譯譯及所所有加加工過過程。?；蚋吒咝П肀磉_(dá)：：外源源基因因在某某種宿宿主細(xì)細(xì)胞中中的表表達(dá)活活動(dòng)，，即剪剪切下下一個(gè)個(gè)外源源基因因片段段，重重組到到另一一個(gè)基基因表表達(dá)體體系中中，使使其能能獲得得既有有原生生物活活性又又可高高產(chǎn)的的表達(dá)達(dá)產(chǎn)物物。基因表表達(dá)研研究的的主要要問題題：目目的基基因的的表達(dá)達(dá)產(chǎn)量量、表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的的穩(wěn)定定性、、產(chǎn)物物的生生物學(xué)學(xué)活性性和表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的的分離離純化化。建立最最佳的的基因因表達(dá)達(dá)體系系，是是基因因表達(dá)達(dá)設(shè)計(jì)計(jì)的關(guān)關(guān)鍵一、宿宿主菌菌的選選擇宿主菌菌應(yīng)滿滿足以以下要要求：：具有高高濃度度、高高產(chǎn)量量、高高產(chǎn)率率；能利用用易得得廉價(jià)價(jià)原料料；不致病病、不不產(chǎn)生生內(nèi)毒毒素；；發(fā)熱量量低，，需氧氧低，，適當(dāng)當(dāng)?shù)陌l(fā)發(fā)酵溫溫度和和細(xì)胞胞形態(tài)態(tài)；容易進(jìn)進(jìn)行代代謝調(diào)調(diào)控；；方便重重組DNA操作；產(chǎn)物容容易提提取純純化。。1.原核細(xì)細(xì)胞（1）大腸腸桿菌菌表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的的形式式：細(xì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)不溶溶性表表達(dá)(包涵體體)、胞內(nèi)內(nèi)可溶溶性表表達(dá)、、細(xì)胞胞周質(zhì)質(zhì)表達(dá)達(dá)，極極少數(shù)數(shù)情況況下也也可分分泌到到細(xì)胞胞外。。不同同的表表達(dá)形形式具具有不不同的的表達(dá)達(dá)水平平及完完全不不同的的雜質(zhì)質(zhì)。大腸桿桿菌表表達(dá)外源基基因的的優(yōu)勢勢全基因因組測測序，，遺傳傳背景景清楚楚（共共4405ORF）基因克克隆表表達(dá)系系統(tǒng)成成熟完完善繁殖迅迅速、、培養(yǎng)養(yǎng)簡單單、操操作方方便、、遺傳傳穩(wěn)定定被美國國FDA批準(zhǔn)為為安全全的基基因工工程受受體生物缺陷缺乏對(duì)對(duì)真核核生物物蛋白白質(zhì)的的復(fù)性性功能能缺乏對(duì)對(duì)真核核生物物蛋白白質(zhì)的的修飾飾加工工系統(tǒng)統(tǒng)內(nèi)源性性蛋白白酶降降解空空間構(gòu)構(gòu)象不不正確確的異異源蛋蛋白細(xì)胞周周質(zhì)內(nèi)內(nèi)含有有種類類繁多多的內(nèi)內(nèi)毒素素（2）枯草草芽孢孢桿菌菌分泌能能力強(qiáng)強(qiáng)，可可將蛋蛋白質(zhì)質(zhì)產(chǎn)物物直接接分泌泌到培培養(yǎng)液液中，，不形形成包涵體；不能能使蛋蛋白質(zhì)質(zhì)糖基基化，，另外外由于于它有有很強(qiáng)強(qiáng)的胞胞外蛋蛋白酶酶，會(huì)會(huì)對(duì)產(chǎn)產(chǎn)物進(jìn)進(jìn)行不不同程程度的的降解（3）鏈霉霉菌重要的的工業(yè)業(yè)微生生物。。不致致病、、使用用安全全，分分泌能能力強(qiáng)強(qiáng)，可可將表表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物直直接分分泌到到培養(yǎng)養(yǎng)液中中，具有一一定的的糖基化能力2、真核細(xì)胞胞（1）酵母特點(diǎn)：真核生物細(xì)細(xì)胞，表達(dá)達(dá)產(chǎn)物能糖糖基化；基因組小，，僅為大腸腸桿菌的4倍；世代時(shí)間短短，繁殖迅迅速；基因操作與與原核生物物相似；建立了有分分泌功能的的表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)，將產(chǎn)物物分泌出胞胞外，分離離純化工藝藝相對(duì)簡單單。（2）絲狀真菌菌特點(diǎn)：有很強(qiáng)的蛋蛋白分泌能能力；能正確進(jìn)行行翻譯后加加工，包括括肽剪切和和糖基化等等;其糖基化方方式與高等等真核生物物相似；絲狀真菌（（如曲霉等等）等被確確認(rèn)是安全全菌株，有有成熟的發(fā)發(fā)酵和后處處理工藝。。真核生物和和原核生物物基因表達(dá)過程示意圖圖克隆載體:克隆了外源DNA后，轉(zhuǎn)入宿宿主細(xì)胞中中進(jìn)行繁殖殖，使克隆的DNA片段數(shù)量大大大增加表達(dá)載體:將外源基因或或DNA片段在宿主主細(xì)胞中表表達(dá)蛋白質(zhì)插入型載體體:將外源基因因或DNA插入其中置換型載體體:切除載體部分DNA，代之以外外源基因或或DNA。載體（vector）質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒是生物物細(xì)胞內(nèi)固固有的、能能獨(dú)立于寄寄主細(xì)胞染染色體外而而自主復(fù)制制、并被穩(wěn)穩(wěn)定遺傳的的一類核酸酸分子。絕大多數(shù)數(shù)質(zhì)粒是DNA型的，天然然DNA質(zhì)粒具有共共價(jià)、封閉閉、環(huán)狀的的分子結(jié)構(gòu)構(gòu)，即cccDNA?；蚩寺〉牡妮d體質(zhì)粒粒DNA分子都具有有復(fù)制子、、選擇性標(biāo)標(biāo)記、克隆隆位點(diǎn)。原核細(xì)胞表達(dá)載體非融合型pKK223-3分泌型PINⅢ-ompA1融合蛋白表表達(dá)載體pGEX結(jié)構(gòu)包涵體型pBV220結(jié)構(gòu)融合蛋白表表達(dá)載體非融合型表表達(dá)載體分泌型表達(dá)達(dá)載體包涵體型表表達(dá)載體（一）表達(dá)達(dá)載體表達(dá)載體必必須具備的的條件：載體能夠獨(dú)獨(dú)立的復(fù)制制；具有靈活的的克隆位點(diǎn)點(diǎn)和方便的的篩選標(biāo)記記,且克隆位點(diǎn)點(diǎn)應(yīng)在啟動(dòng)動(dòng)子序列后后，以便外外源基因表表達(dá)；具有很強(qiáng)的的啟動(dòng)子，，能為大腸腸桿菌的RNA聚合酶識(shí)別別；具有阻遏子子，使啟動(dòng)動(dòng)子受到控控制，只有有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)時(shí)才能進(jìn)行行轉(zhuǎn)錄；具有很強(qiáng)的的終止子，，使RNA聚合酶集中中力量轉(zhuǎn)錄錄克隆的外外源基因，，而不轉(zhuǎn)錄錄無關(guān)的基基因；所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻翻譯的起始始信號(hào)，即即起始密碼碼AUG和SD序列，以便便轉(zhuǎn)錄后能能順利翻譯譯。（二）影響響目的基因因在大腸桿桿菌中表達(dá)達(dá)的因素外源基因的的劑量外源基因的的表達(dá)效率率：A、啟動(dòng)子的的強(qiáng)弱：將將目的基因因插入大腸腸桿菌RNA聚合酶能識(shí)識(shí)別的強(qiáng)啟啟動(dòng)子下游游B、核糖體結(jié)結(jié)合位點(diǎn)的的有效性C、SD序列和起始始密碼的間間距D、密碼子組組成：設(shè)計(jì)計(jì)引物或合合成基因時(shí)時(shí)選擇大腸腸桿菌“偏偏愛”的密密碼子表達(dá)產(chǎn)物的的穩(wěn)定性：：A、組建融合合蛋白；B、利用信號(hào)號(hào)肽將真核核基因產(chǎn)物物搬至周質(zhì)質(zhì)空隙中；；C、位點(diǎn)特異異性突變，，增加蛋白白的穩(wěn)定性性；D、采用蛋白白酶缺陷型型大腸桿菌菌，減弱降降解作用細(xì)胞的代謝謝負(fù)荷：A、宿主細(xì)胞胞的生長與與外源基因因的表達(dá)分分開；B、宿主細(xì)胞胞的生長與與重組質(zhì)粒粒的復(fù)制分分開；C、形成不溶溶性的包涵涵體工程菌的培培養(yǎng)條件（三）真核核基因在大大腸桿菌中中表達(dá)的形形式1.以融合蛋白白的形式表表達(dá)藥物基基因其氨基端是是原核序列列，羧基端端是真核序序列，以原原核多肽和和真核蛋白白結(jié)合在一一起，稱融融合蛋白。。優(yōu)點(diǎn)：操作作簡便，表表達(dá)蛋白在在菌體內(nèi)穩(wěn)穩(wěn)定，不易易被細(xì)菌酶類降降解；易實(shí)實(shí)現(xiàn)高效表表達(dá)；缺點(diǎn)：有免免疫原性，，需切除原原核多肽2.以非融合蛋蛋白的形式式表達(dá)藥物物基因非融合蛋白白指在大腸腸桿菌中表表達(dá)的蛋白白質(zhì)以真核核蛋白的mRNA的AUG為起始，在在其氨基端端不含細(xì)菌菌多肽序列列。優(yōu)點(diǎn)：保持持原有蛋白白活性；缺點(diǎn)：易被被蛋白酶破破壞；可能能引起人體體免疫反應(yīng)應(yīng)3.分泌型表達(dá)達(dá)蛋白藥物物基因?qū)⑼庠椿蛞蛉诤系骄幘幋a信號(hào)肽肽序列的下下游。常用的信號(hào)號(hào)肽有：堿堿性磷酸酶酶信號(hào)肽；；膜外周質(zhì)質(zhì)蛋白信號(hào)肽；霍霍亂弧菌毒毒素B亞單位；優(yōu)點(diǎn)：在周周質(zhì)中穩(wěn)定定，有活性性，不含甲甲硫氨酸殘殘基；缺點(diǎn)：產(chǎn)量量不高，信號(hào)肽不被切割或或不在特定定位置上切切割。酵母中的基因表達(dá)達(dá)（一）表達(dá)達(dá)載體1.載體的復(fù)制制序列（1）YEp類（酵母附附加體質(zhì)粒粒）（2）YRp類（酵母復(fù)復(fù)制型質(zhì)粒粒）（3）YCp類（酵母著著絲粒質(zhì)粒粒）（4）YIp類（酵母整合型型質(zhì)粒）2.克隆載體向酵母載體體中引入大大腸桿菌質(zhì)質(zhì)粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，這樣樣構(gòu)成的克克隆載體同同時(shí)帶有細(xì)菌和酵酵母的復(fù)制制原點(diǎn)和選選擇標(biāo)記。。酵母常用的的選擇性標(biāo)標(biāo)記：氨基基酸或核苷苷酸合成酶酶系基因，對(duì)對(duì)抑制酵母母生長的藥藥物具有抵抵抗力的抗抗性基因3.表達(dá)載體普通表達(dá)載載體：只能能方便地引引入外源基基因并進(jìn)行行表達(dá)，對(duì)表達(dá)達(dá)產(chǎn)物的組組成，特別別是對(duì)其N末端氨基酸酸是否增減并并無嚴(yán)格要要求。精確表達(dá)載載體：要求求在啟動(dòng)子子或前導(dǎo)肽肽編碼序列列的適當(dāng)部位有有內(nèi)切酶位位點(diǎn)，以利利于接入外外源基因，，并使它在表達(dá)達(dá)和加工后后N末端氨基酸酸序列與天天然產(chǎn)物相同，既無無多余的氨氨基酸，也也無缺失的的氨基酸。。（二）影響響目的基因因在酵母菌菌中表達(dá)的的因素1.外源基因的的劑量：質(zhì)質(zhì)?？截悢?shù)數(shù)及其在宿宿主細(xì)胞內(nèi)內(nèi)的穩(wěn)定性性2.外源基因的的表達(dá)效率率：A、啟動(dòng)子B、分泌信號(hào)號(hào)的效率C、終止序列列的影響3.外源蛋白的的糖基化4.宿主菌株的的影響：A、菌體生長長力強(qiáng)；B、菌體內(nèi)源源蛋白酶要要弱；C、菌株性能能穩(wěn)定；D、分泌能力力強(qiáng)基因工程菌菌的培養(yǎng)基因工程菌菌發(fā)酵的基基本操作方方式有：分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)操操作簡單，，但因不能能控制生長長，獲得的的菌體密度度也有限半連續(xù)培養(yǎng)養(yǎng)（補(bǔ)料分分批）在一次投料發(fā)發(fā)酵的基礎(chǔ)礎(chǔ)上，流加加一定量的的營養(yǎng)，使使細(xì)胞進(jìn)一一步的生長，或得到更更多的代謝謝產(chǎn)物連續(xù)培養(yǎng)不斷地流加加營養(yǎng)，并并不斷地取取出發(fā)酵液液。連續(xù)培培養(yǎng)則多用用于動(dòng)力學(xué)學(xué)特性和穩(wěn)穩(wěn)定性等研研究。透析培養(yǎng)固定化培養(yǎng)養(yǎng)基因工程菌菌培養(yǎng)方式式補(bǔ)料分批培培養(yǎng)補(bǔ)料分批培培養(yǎng)是將種種子接入發(fā)發(fā)酵反應(yīng)器器中進(jìn)行培培養(yǎng)，經(jīng)過過一段時(shí)間間，間歇或或連續(xù)地補(bǔ)補(bǔ)加新鮮培培養(yǎng)基，使使菌體進(jìn)一一步生長的的培養(yǎng)方法法。在分批培養(yǎng)養(yǎng)中，為保保持基因工工程菌生長長所需的良良好微環(huán)境境，延長其其生長對(duì)數(shù)數(shù)期，獲得得高密度菌菌體，通常常把溶氧控控制和流加加補(bǔ)料措施施結(jié)合起來來，根據(jù)基基因工程菌菌的生長規(guī)規(guī)律來調(diào)節(jié)節(jié)補(bǔ)料的流流加速率。。連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是是將種子接接入發(fā)酵反反應(yīng)器中，，攪拌培養(yǎng)養(yǎng)至菌體濃濃度達(dá)到一一定程度后后，開動(dòng)進(jìn)進(jìn)料和出料料蠕動(dòng)泵，，以一定稀稀釋率進(jìn)行行不間斷培培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)可可以為微生生物提供恒恒定的生活活環(huán)境，控控制其比生生長速率，，為研究基基因工程菌菌的發(fā)酵動(dòng)動(dòng)力學(xué)、生生理生化特特性、環(huán)境境因素對(duì)基基因表達(dá)的的影響等創(chuàng)創(chuàng)造了良好好的條件。。但由于基因因工程菌的的不穩(wěn)定性性，連續(xù)培培養(yǎng)比較困困難。為了了解決這一一問題，人人們將工程程菌的生長長階段和基基因表達(dá)階階段分開，，進(jìn)行兩階階段連續(xù)培培養(yǎng)。在這這樣的系統(tǒng)統(tǒng)中關(guān)鍵的的控制參數(shù)數(shù)是誘導(dǎo)水水平、稀釋釋率和細(xì)胞胞比生長速速率。優(yōu)化化這三個(gè)參參數(shù)以保證證在第一階階段培養(yǎng)時(shí)時(shí)質(zhì)粒穩(wěn)定定，菌體進(jìn)進(jìn)入第二階階段后可獲獲得最高表表達(dá)水平或或最大產(chǎn)率率。透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技技術(shù)是利用用膜的半透透性原理使使培養(yǎng)物和和培養(yǎng)基分分離，其主主要目的是是通過去除除培養(yǎng)液中中的代謝產(chǎn)產(chǎn)物來解除除其對(duì)生產(chǎn)產(chǎn)菌的不利利影響。采用膜透析析裝置是在在發(fā)酵過程程中用蠕動(dòng)動(dòng)泵將發(fā)酵酵液抽出打打入罐外的的膜透析器器的一側(cè)循循環(huán)，其另另一側(cè)通入入透析液循循環(huán)，在補(bǔ)補(bǔ)料分批培培養(yǎng)中，大大量乙酸在在透析器中中透過半透透膜，降低低培養(yǎng)基中中的乙酸濃濃度，并可可通過在透透析液中補(bǔ)補(bǔ)充養(yǎng)分而而維持較合合適的基質(zhì)質(zhì)濃度，從從而獲得高高密度菌體體。膜的種類、、孔徑、面面積，發(fā)酵酵液和透析析液的比例例，透析液液的組成，，循環(huán)流速速，開始透透析的時(shí)間間和透析培培養(yǎng)的持續(xù)續(xù)時(shí)間段都都對(duì)產(chǎn)物的的產(chǎn)率有影影響固定化培養(yǎng)養(yǎng)基因工程菌菌培養(yǎng)的一一大難題是是如何維持持質(zhì)粒的穩(wěn)穩(wěn)定性。有有人將固定定化技術(shù)應(yīng)應(yīng)用到這一一領(lǐng)域，發(fā)發(fā)現(xiàn)基因工工程菌經(jīng)固固定化后，，質(zhì)粒的穩(wěn)穩(wěn)定性大大大提高，便便于進(jìn)行連連續(xù)培養(yǎng)，，特別是對(duì)對(duì)分泌型菌菌更為有利利。由于這這一優(yōu)點(diǎn)，，基因工程程菌固定化化培養(yǎng)研究究已得到迅迅速開展。。基因工程菌菌發(fā)酵中試試基因工程菌菌中試應(yīng)考考慮的問題題：適宜商商品化生產(chǎn)產(chǎn)的工程菌菌，設(shè)計(jì)發(fā)發(fā)酵反應(yīng)器器，選擇反反應(yīng)過程，，發(fā)酵培養(yǎng)養(yǎng)基組分，，維持生產(chǎn)產(chǎn)工藝最佳佳化的方法法，工藝監(jiān)監(jiān)測方法，，工藝控制制方法，工工藝自動(dòng)化化使用方法法，生物催催化劑使用用，產(chǎn)品提提取方法的的選擇，分分離精制技技術(shù)的選擇擇?；蚬こ叹牟环€(wěn)定定性主要表現(xiàn)在重組組質(zhì)粒的不不穩(wěn)定性，，兩種表現(xiàn)形式：：1）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定定性重組DNA分子上某一一區(qū)域發(fā)生生缺失、重重排、修飾飾，導(dǎo)致其其表觀生物物學(xué)功能的的喪失2）分配不穩(wěn)定定性整個(gè)重組DNA分子從受體體細(xì)胞中逃逸基因工程菌菌不穩(wěn)定性性的可能產(chǎn)產(chǎn)生機(jī)制：受體細(xì)胞中限制修飾飾系統(tǒng)對(duì)外源重組組DNA分子的降解解外源基因的的高效表達(dá)達(dá)嚴(yán)重干擾擾受體細(xì)胞胞正常生長代代謝能量、物質(zhì)的匱乏乏和外源基基因表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物的毒性性誘導(dǎo)受體體細(xì)胞產(chǎn)生生應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)：關(guān)閉合合成途徑，，啟動(dòng)降解解程序重組質(zhì)粒在在受體細(xì)胞胞分裂時(shí)的的不均勻分配重組質(zhì)粒逃逸的基本本原因受體細(xì)胞中中內(nèi)源性的的轉(zhuǎn)座元件件促進(jìn)重組組分子的缺缺失重排培養(yǎng)基比生長速率率限制性基質(zhì)溫度pH和溶氧外源基因表達(dá)遺傳特性影響基因工工程菌穩(wěn)定定性的因素素載體的選擇擇宿主的選擇擇外源基因整整合到宿主主染色體上上發(fā)酵工藝1.培養(yǎng)基一些基因重重組菌在復(fù)復(fù)合培養(yǎng)基基中顯示較較高的質(zhì)粒粒穩(wěn)定性微生物在含含有有機(jī)氮氮源如酵母母抽提物、、蛋白胨等等營養(yǎng)豐富富的復(fù)合培培養(yǎng)基中培培養(yǎng)時(shí)，由由于培養(yǎng)基基提供了生生長必須的的氨基酸和和其他物質(zhì)質(zhì)，微生物物的生長較較基本培養(yǎng)養(yǎng)基快。培養(yǎng)條件對(duì)對(duì)基因工程菌菌穩(wěn)定性的影影響2.比生長速率率基因重組菌菌的比生長長速率對(duì)質(zhì)質(zhì)粒穩(wěn)定性性有很大影影響。提高高比生長速速率有助于于提高質(zhì)粒粒穩(wěn)定性。?；蛑亟M菌菌的比生長長速率與培培養(yǎng)環(huán)境有有關(guān)，如溫溫度，pH，溶氧，限限制性營養(yǎng)養(yǎng)物質(zhì)濃度度，有害代代謝產(chǎn)物濃濃度等。在在一定的溫溫度和pH下，限制性性基質(zhì)濃度度往往是決決定比生長長速率的主主要因素。。3.限制性基質(zhì)質(zhì)一般培養(yǎng)基基中各成分分并不是完完全平衡的的，經(jīng)過一一段時(shí)間的的培養(yǎng)，微微生物的生生長通常會(huì)會(huì)受到一種種或幾種物物質(zhì)的限制制。限制性性基質(zhì)的種種類對(duì)重組組菌有不同同的影響4.pH和溶解氧pH和溶氧是影響響微生物生生長的重要要參數(shù)，在在發(fā)酵罐培培養(yǎng)基因重重組菌時(shí)，，通常都需需要維持一一定的pH和溶氧水平平。在基因因重組菌的的高密度培培養(yǎng)時(shí)，為為了維持所所需的溶氧氧水平，除除了提高攪攪拌轉(zhuǎn)速和和通氣量，，往往還要要在通入的的空氣中補(bǔ)補(bǔ)充氧氣，，以提高發(fā)發(fā)酵罐的供供氧能力。。5.外源基因的的表達(dá)外源基因的的表達(dá)會(huì)引引起重組質(zhì)質(zhì)粒的不穩(wěn)穩(wěn)定；尤其其當(dāng)外源基基因高效表表達(dá)時(shí)，有有可能因競競爭利用物物質(zhì)、能量量、核糖體體等干擾宿宿主細(xì)胞的的正常代謝謝活動(dòng)，并并造成質(zhì)粒粒不穩(wěn)定。。例如，吲哚哚丙烯酸（（IAA）是trp操縱子阻遏遏物的部分分去阻遏劑劑，在培養(yǎng)養(yǎng)大腸桿菌菌MV12（pVH5）時(shí)，在培培養(yǎng)基中加加入不同量量的IAA，發(fā)現(xiàn)隨IAA量的增加，，pVH5帶有的分支支酸合成酶酶和色氨酸酸合成酶基基因的表達(dá)達(dá)水平有很很大提高，，同時(shí)比生生長速率下下降，培養(yǎng)養(yǎng)液中Trp－的比例上升升。電泳分分析表明60%～70%色氨酸合成成能力喪失失是由于質(zhì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的的變化，其其余是由于于質(zhì)粒丟失失造成。1、改進(jìn)載體受體系系統(tǒng)以增加質(zhì)粒穩(wěn)穩(wěn)定性為目目的的構(gòu)建建方法包括括：1）將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表表達(dá)型載體體中，其表表達(dá)產(chǎn)物可可以選擇性性地殺死由由于分配不不均勻所產(chǎn)產(chǎn)生的無質(zhì)質(zhì)粒細(xì)胞2）正確設(shè)置置載體上的的多克隆位位點(diǎn)，禁止止DNA片段插在穩(wěn)穩(wěn)定區(qū)內(nèi)3）將受體細(xì)細(xì)胞的致死死性基因安安裝在載體體上，同時(shí)時(shí)構(gòu)建條件件致死性的的相應(yīng)受體體系統(tǒng)，如如大腸桿菌菌的ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋蛋白編碼基基因）提高基因工工程菌穩(wěn)定定性的策略略2、施加選擇壓力根據(jù)載體上上的抗藥性性標(biāo)記，向向培養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)中添加相相應(yīng)的抗生生素藥物和食品品生產(chǎn)時(shí)禁禁止使用抗抗生素；加加入大量的的抗生素會(huì)會(huì)使生產(chǎn)成成本增加；；添加一些些容易被水水解失活的的抗生素，，只能維持持一定時(shí)間間；添加抗抗生素選擇擇壓力對(duì)質(zhì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不不穩(wěn)定無能能為力載體上的營營養(yǎng)缺陷型型標(biāo)記，向向培養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)中添加相相應(yīng)的營養(yǎng)養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜雜，成本較較高提高基因工工程菌穩(wěn)定定性的策略略3、分階段控制培培養(yǎng)因外源基因因表達(dá)造成成質(zhì)粒不穩(wěn)穩(wěn)定時(shí)，可可以考慮將將發(fā)酵過程程分階段控控制在生長階段段使外源基基因處于阻阻遏狀態(tài)，，避免因表表達(dá)造成不不穩(wěn)定性問問題的發(fā)生生；在獲得得需要的菌菌體密度后后，再去阻阻遏或誘導(dǎo)導(dǎo)外源基因因表達(dá)。連續(xù)培養(yǎng)時(shí)時(shí)可以考慮慮采用多級(jí)級(jí)培養(yǎng)，如如在第一級(jí)級(jí)進(jìn)行生長長，維持菌菌體的穩(wěn)定定性，在第第二級(jí)進(jìn)行行表達(dá)。提高基因工工程菌穩(wěn)定定性的策略略4、控制目的基因的的過量表達(dá)達(dá)使用可控型型啟動(dòng)子控控制目的基基因的定時(shí)時(shí)表達(dá)及表表達(dá)程度使用可控型型復(fù)制子控控制質(zhì)粒的的定時(shí)增殖殖或降低質(zhì)質(zhì)粒的拷貝貝數(shù)5、優(yōu)化基因工程菌菌的培養(yǎng)工工藝培養(yǎng)基組成成：限制培培養(yǎng)基比豐豐富培養(yǎng)基基更有利于于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低低的培養(yǎng)溫度度有利于重重組質(zhì)粒的的穩(wěn)定提高基因工工程菌穩(wěn)定定性的策略略6、控制培養(yǎng)條件有些含質(zhì)粒的菌菌對(duì)發(fā)酵環(huán)環(huán)境的改變變比不含質(zhì)質(zhì)粒的菌反反應(yīng)慢，因因而采用間間隙改變培培養(yǎng)條件的的方法以改改變這兩種種菌的比生生長速率，，從而改善善質(zhì)粒的穩(wěn)穩(wěn)定性。通通過間隙供供氧的方法法和通過改改變稀釋速速率的方法法都可提高高質(zhì)粒的穩(wěn)穩(wěn)定性。例如研究表達(dá)干擾素的大腸桿菌W3110(pEC901)在不同比生生長速率下下的質(zhì)粒穩(wěn)穩(wěn)定性，隨隨著稀釋率率的增加，，質(zhì)粒穩(wěn)定定性明顯增增加，干擾擾素的比效效價(jià)也明顯顯增大.提高基因工工程菌穩(wěn)定定性的策略略7、固定化培養(yǎng)固定化可以以提高基因因重組大腸腸桿菌的穩(wěn)穩(wěn)定性基因重組大大腸桿菌進(jìn)進(jìn)行固定化化后，質(zhì)粒粒的穩(wěn)定性性及目的產(chǎn)產(chǎn)物的表達(dá)達(dá)率都有了了很大提高高。在游游離重組菌菌系統(tǒng)中常常用抗生素素，氨基酸酸等選擇性性壓力穩(wěn)定定質(zhì)粒的手手段，往往往在大規(guī)模模生產(chǎn)中難難以應(yīng)用。。而采用固固定化方法法后，這種種選擇壓力力則可被省省去。不同同的宿主菌菌及質(zhì)粒在在固定化系系統(tǒng)中均表表現(xiàn)出良好好的穩(wěn)定性性。提高基因工工程菌穩(wěn)定定性的策略略基因工程藥藥物的分離離純化目的產(chǎn)物在初始始物料中的的含量較低低；含目的產(chǎn)物物的初始物物料組成復(fù)復(fù)雜，除目目的產(chǎn)物外外，還有大大量的細(xì)胞胞、代謝物物、殘留培培養(yǎng)基、無無機(jī)鹽等，，特別是產(chǎn)產(chǎn)物類似物物對(duì)目的產(chǎn)產(chǎn)物的分離離純化影響響很大；目的產(chǎn)物的的穩(wěn)定性差差，具有生生物活性的的物質(zhì)對(duì)pH、溫度、金金屬離子、、有機(jī)溶劑劑、剪切力力、表面張張力等十分分敏感，容容易失活、、變性；種類繁多，，包括大、、中、小分分子、結(jié)構(gòu)構(gòu)簡單或復(fù)復(fù)雜的有機(jī)機(jī)化合物，，以及結(jié)構(gòu)構(gòu)和性質(zhì)復(fù)復(fù)雜又各異異的生物活活性物質(zhì)；；應(yīng)用面廣，，對(duì)其質(zhì)量量、純度要要求高，甚甚至要求無無菌、無熱熱原。基因工程藥藥物或生物物技術(shù)產(chǎn)品品特點(diǎn)一、建立分分離純化工工藝需了解解的各種因因素1.含目的產(chǎn)物物的初始物物料的特點(diǎn)點(diǎn)（1）菌種類型及其代代謝特性（2）原材料和和培養(yǎng)基的的來源及質(zhì)質(zhì)量是否穩(wěn)穩(wěn)定（3）生產(chǎn)工藝藝和條件（4）初始物料的物理理、化學(xué)和和生物學(xué)特特性2.物料中雜質(zhì)質(zhì)的種類和和性質(zhì)3.目的產(chǎn)物特特性4.產(chǎn)品質(zhì)量的的要求二、分離純純化的基本本過程基因工程藥藥物的分離離純化主要要分為5個(gè)步驟，包括細(xì)胞破破碎、固液液分離、濃濃縮與初步步純化、高高度純化直至得得到純品，，以及成品品加工。分離純化目目的產(chǎn)物主主要依賴于于色譜分離離技術(shù)。色譜技術(shù)分分為：離子交換色色譜親和色譜凝膠過濾色色譜高效液相色色譜等三、重組蛋白質(zhì)的分分離純化產(chǎn)物的主要要特性及在在分離純化化中的作用用基因工程藥藥物生產(chǎn)中中常用的分分離純化方方法基因工程藥藥物制造實(shí)實(shí)例干擾素是真真核細(xì)胞對(duì)對(duì)各種刺激激作出反應(yīng)應(yīng)而自然形形成的一組組復(fù)雜的蛋蛋白質(zhì)。干干擾素除具具有廣譜抗抗病毒活性性，還具有有抑制細(xì)胞胞分裂，特特別是抑制制腫瘤細(xì)胞胞生長和免免疫調(diào)節(jié)等等功能，作作為一種生生物活性蛋蛋白有著良良好的臨床床應(yīng)用價(jià)值值。干擾素在我我國已經(jīng)批批準(zhǔn)上市的的基因工程程藥物。早期獲得方方法：用病病毒誘導(dǎo)人人白血球(白細(xì)胞)產(chǎn)生，產(chǎn)量量低，價(jià)格格貴。300L人血才提取取1mg（一）干擾擾素2003年抗非典期期間，江南南大學(xué)與麗麗珠集團(tuán)蘇蘇州新寶制制藥廠合作作攻關(guān)，通通過發(fā)酵工工程和生物物制藥工程程研制成功功了重組人人α-2b干擾素口鼻鼻腔噴霧劑劑，解決了了干擾素常常溫保存穩(wěn)穩(wěn)定性問題題。在疫區(qū)區(qū)特殊人群群捐贈(zèng)使用用，效果顯顯著。誘生的白細(xì)細(xì)胞或者成成纖維細(xì)胞胞提取核酸酸↓通過寡dT-纖維素柱提提取mRNApBR322質(zhì)?！?%-23%蔗糖密度梯梯度離心提提取12S-mRNA內(nèi)切酶切割割↓↓由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA切割段位于于β內(nèi)酰胺基酶酶基因內(nèi)↓結(jié)結(jié)果果導(dǎo)致內(nèi)酰酰胺基酶失失活，不抗抗青霉素雙鏈cDNA用末端Pst-I酶切割↓再用DNA轉(zhuǎn)移酶接上上dT或者者dG在pBR322質(zhì)粒粒DNA的切切割割段段加加上上dA或者者dC++++++++++++++++退火火獲獲得得雜雜交交質(zhì)質(zhì)粒?！D(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化大大腸腸桿桿菌菌K-12擴(kuò)增增雜雜交交質(zhì)質(zhì)粒粒↓↓篩選選能能夠夠抗抗四四環(huán)環(huán)素素、、但但是是對(duì)對(duì)氨氨芐芐青青霉霉素素敏敏感感的的細(xì)細(xì)菌菌克克隆隆株株↓采用用雜雜交交翻翻譯譯法法挑挑選選含含有有干干擾擾素素cDNA的克克隆隆↓↓將將干干擾擾素素cDNA克隆隆進(jìn)進(jìn)表表達(dá)達(dá)載載體體↓↓在在大大腸腸桿桿菌菌中中進(jìn)進(jìn)行行高高效效表表達(dá)達(dá)↓（進(jìn)進(jìn)入入下下游游工工藝藝））工程程菌菌構(gòu)構(gòu)建建工程程菌菌的的發(fā)發(fā)酵酵生生產(chǎn)產(chǎn)人干干擾擾素素a-2b的基基因因工工程程菌菌為為SW-IFNa-2b/E.coli——DH5a。質(zhì)質(zhì)粒粒使使用用PL啟動(dòng)動(dòng)子子，，含含有有氨氨芐芐青青霉霉素素抗抗性性基基因因。。種種子子培培養(yǎng)養(yǎng)液液含含1%蛋白白胨胨、、0.5%酵母母提提取取物物、、0.5%NaCl?！蛞蚬すこ坛叹咏臃N種到到4個(gè)1000ml三角角燒燒瓶瓶之之中中，，每每個(gè)個(gè)燒燒瓶瓶內(nèi)內(nèi)裝裝有有250ml種子子培培養(yǎng)養(yǎng)基基，，30℃℃搖床床培培養(yǎng)養(yǎng)10小時(shí)時(shí)，，作作為為發(fā)發(fā)酵酵罐罐的的種種子子。?！糜?5L發(fā)酵酵罐罐進(jìn)進(jìn)行行發(fā)發(fā)酵酵，，裝裝發(fā)發(fā)酵酵培培養(yǎng)養(yǎng)基基10L發(fā)酵酵培培養(yǎng)養(yǎng)基基組組成成如如下下（（1%蛋白白胨胨、、0.5%酵母母提提取取物物、、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄萄糖糖、、50mg/ml氨芐芐青青霉霉素素、、少少量量防防泡泡沫沫劑劑。。pH=6.8。））↓↓攪攪拌拌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速速500r/min、通通氣氣量量為為1：1v/v*min、溶溶氧氧量量為為50%30℃℃發(fā)酵酵8小時(shí)時(shí)（（細(xì)細(xì)菌菌增增殖殖階階段段））42℃℃誘導(dǎo)導(dǎo)2-3小時(shí)時(shí)（（產(chǎn)產(chǎn)物物生生產(chǎn)產(chǎn)階階段段））↓↓[監(jiān)控控手手段段：：每每隔隔不不同同時(shí)時(shí)間間，，取取2毫升升發(fā)發(fā)酵酵液液，，10000r/min離心心除除去去上上清清液液，，稱稱量量菌菌體體濕濕重重。。]發(fā)酵酵物物質(zhì)質(zhì)4000r/min離心心30min，除除去去上上清清液液。。得得濕濕菌菌，，從從其其中中取取100g。懸懸浮浮于于20mmol/L磷酸酸緩緩沖沖液液（（pH=7.0）500ml之中中，，冰冰浴浴條條件件下下進(jìn)進(jìn)行行超超聲聲破破碎碎。?！?000r/min離心心30min，除除去去上上清清液液。。沉沉淀淀部部分分用用100ml抽提提液液在在室室溫溫條條件件下下，，進(jìn)進(jìn)行行攪攪拌拌抽抽提提2小時(shí)時(shí)，，抽抽提提液液組組成成配配方方[8mol/L尿素素、、20mmol/L磷酸酸緩緩沖沖液液（（pH=7.0）、、0.5mmol/LDTT]?！槌?/p>