毛細(xì)管凝膠電泳課件

第九章高效毛細(xì)管電泳法第九章高效毛細(xì)管電泳法High-performancecapillaryelectrophoresisHPCE

是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分離技術(shù)。第一節(jié)概述High-performancecapillaryele基本構(gòu)造■■■高壓直流電源分離通道－毛細(xì)管檢測器■緩沖液貯存瓶基本構(gòu)造■■■高壓直流電源分離通道－毛細(xì)管檢測器■緩沖液貯存一、基本裝置一、基本裝置電泳

electrophoresis是指溶液中帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的電動(dòng)現(xiàn)象。毛細(xì)管電泳

capillaryelectrophoresis是利用被分析離子在電場作用下移動(dòng)的速率不同而達(dá)到分離的目的，這種技術(shù)主要用來分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。電泳electrophoresis是指溶液中帶電粒子二、基本原理電泳分離的基礎(chǔ)

=

eE

為離子移動(dòng)的速度

e為電泳遷移率E為毛細(xì)管柱進(jìn)樣端至檢測窗口間電場強(qiáng)度。電荷-尺寸

離子的電泳遷移率不同，在電場中移動(dòng)的速度不一樣，利用這個(gè)原理可以把不同的離子彼此分離。電泳遷移率與分析物質(zhì)所帶電荷呈正比，與摩擦阻力系數(shù)呈反比。如果兩種物質(zhì)帶有不同的電荷或者通過緩沖溶液移動(dòng)的摩擦力不同，那么這兩種物質(zhì)可以彼此分離。二、基本原理電泳分離的基礎(chǔ)=eE為離子移動(dòng)的速度1

離子移動(dòng)的速率

=

eE=eU/LU是毛細(xì)管柱兩端施加的壓力L是毛細(xì)管柱總長。2

毛細(xì)管電泳中的板高N=eU/2D在凝膠板形電泳中，一般最高使用的電壓約為500V。在毛細(xì)管電泳中，一般可采用20,000～60,000V的高電壓。1離子移動(dòng)的速率=eE=eU/LU是毛細(xì)3

電滲流當(dāng)高電壓通過含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時(shí)，管內(nèi)的溶質(zhì)向陰極或陽極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。在柱內(nèi)層氧化硅與溶質(zhì)的界面上形成雙電層是電滲流產(chǎn)生的原因。在典型的毛細(xì)管電泳分離中，若有電滲存在，離子的洗脫順序是:首先是最快的陽離子，緊接著是依次減慢的陽離子，然后是全部的中性分子在一個(gè)區(qū)域出現(xiàn)，最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快的陰離子。3電滲流當(dāng)高電壓通過含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時(shí)，管內(nèi)的溶電滲流的正面作用：

1.增加分離速度；

2.使得正、負(fù)電荷物質(zhì)同時(shí)分離。

電滲流的負(fù)面作用：

1、減少分離時(shí)間和分離有效距離；

2、電滲流的波動(dòng)極大的影響遷移時(shí)間的重復(fù)性。

電滲流的正面作用：

1.增加分離速度；

2.使得正、負(fù)電影響電滲流的因素：

PH值：

PH值越高，電滲流越大。離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，電滲流越小。

緩沖溶液添加劑：離子型表面活性劑、有機(jī)溶劑、環(huán)糊精

影響電滲流的因素：PH值：

PH值越高，電滲流越大?？刂齐姖B流的三個(gè)重要手段：

采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響；

改變pH，從而調(diào)整電滲流的大小。pH<3時(shí)電滲流很低；當(dāng)pH>10以后，電滲流基本不增加；

添加劑：有機(jī)溶劑可以降低電滲流的大小，從而增加分離的有效距離；表面活性劑可以徹底改變電滲流的方向和大小，主要是在陰離子分析時(shí)使用。

控制電滲流的三個(gè)重要手段：采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響（4）進(jìn)樣方式

電動(dòng)進(jìn)樣

是將毛細(xì)管柱的一端及其相應(yīng)端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準(zhǔn)確時(shí)間范圍內(nèi)施加壓力，使試樣因離子移動(dòng)和電滲流進(jìn)入毛細(xì)管柱。

壓力進(jìn)樣

是用壓差使試樣溶液進(jìn)入毛細(xì)管。（4）進(jìn)樣方式三、方法特點(diǎn)

瑞典化學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為5個(gè)主要成分，為蛋白質(zhì)化學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。諾貝爾獎(jiǎng)優(yōu)點(diǎn):1.簡單方便；2.高效快速；3.操作模式多4.成本低；5.應(yīng)用范圍廣三、方法特點(diǎn)瑞典化學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳20世紀(jì)30－40年代蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動(dòng)界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術(shù)獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1981年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實(shí)驗(yàn)上和理論上為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。上一世紀(jì)后二十多年分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最迅速的分離分析方法。

20世紀(jì)30－40年代第二節(jié)主要分離模式與應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜MECC毛細(xì)管等速電泳CITP毛細(xì)管等電聚焦CIEF毛細(xì)管凝膠電泳CGE毛細(xì)管電色譜CEC第二節(jié)主要分離模式與應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

基于試樣中各個(gè)組分間荷質(zhì)比的差異進(jìn)行分離的。這種電泳模式的特征是整個(gè)系統(tǒng)都用同一種緩沖溶液充滿。背景電解質(zhì)的濃度一般高于試樣，起運(yùn)載電流的作用，其離子有一定的遷移率。當(dāng)電流通過時(shí)，緩沖溶液中的陰，陽離子分別以一特定的速度分別向正極和負(fù)極移動(dòng)。同時(shí)試樣中的不同離子將按各自的恒定速度移動(dòng)，形成背景電解質(zhì)離子流動(dòng)中伴隨有試樣離子的流動(dòng)。如果試樣中不同離子的遷移率差別很大，就能將不同離子分離。一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳基于試樣中各個(gè)組分間一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（一）基本公式及影響因素根據(jù)組分在電場E中遷移速度不同來分離。

Vep=μepE=μepV/LVep：遷移速度；μep：電泳遷移率V:

毛細(xì)管兩端的外加電壓L：毛細(xì)管的長度電泳載體的電滲流

VOS=μOSE=μOSV/L一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（一）基本公式及影響因素V=Vep+VOS

tR=L/V=L2/(μep+μOS

)Vn=(μep+μOS

)V/2Dn與外加電壓及μep和μOS

有關(guān)n隨分子量增大、擴(kuò)散系數(shù)D變小而提高CZE主要用于能解離的組分的分離，尤其是帶正電荷的陽離子的分離。V=Vep+VOSRs=（n1/2/4）×（Δυ/υ平）Δυ相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差υ平為兩者的平均速度Δυ/υ平表示分離選擇性n為柱效Rs=（n1/2/4）×（Δυ/υ平）添加劑添加劑類型--甲醇、環(huán)糊精、乙腈

添加劑的目的：

a改善分離；

b抑制分析物在毛細(xì)管上的吸附。

添加劑添加劑類型--甲醇、環(huán)糊精、乙腈添加劑的選擇：

甲醇、乙腈（百分之五到百分之五十）：

降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果；

增加非極性物質(zhì)的水溶性。

環(huán)糊精、SDS等表面活性劑：

增加分離選擇性，提高分析效果；

降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果。

非極性高分子聚合物：

掩蔽毛細(xì)管內(nèi)壁電荷，抑制分子吸附；

降低電滲流；

形成一定的分子篩，提高分子大小選擇性。

添加劑的選擇：

甲醇、乙腈（百分之五到百分之五十）：

（二）生物樣本的預(yù)處理去除蛋白，常用乙腈毛細(xì)管預(yù)處理直接進(jìn)樣后處理（二）生物樣本的預(yù)處理去除蛋白，常用乙腈（三）應(yīng)用示例CZE法同時(shí)測定血漿中頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的含量電泳條件石英毛細(xì)管35cm×75μm(i.d);分離電壓20kV;操作溫度25℃;壓力方式進(jìn)樣3.45kPa×10s;正極進(jìn)樣,負(fù)極柱上267nm檢測;緩沖液20mmol/L硼砂(pH7.1)。每次運(yùn)行前用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、二次重蒸水和緩沖液分別沖洗3min、3min和5min。血漿預(yù)處理兔血漿0.5ml加入1倍體積量的蛋白質(zhì)沉淀劑乙腈∶1mol/L鹽酸（95∶5）,渦旋振蕩3min,10000r/min離心10min,取上液進(jìn)行分析。中國抗生素雜志2005年6月第30卷第6期（三）應(yīng)用示例CZE法同時(shí)測定血漿中頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的含分析條件的選擇緩沖溶液濃度對分離的影響

硼砂緩沖體系紫外吸收低,是毛細(xì)管電泳分析中最常用的緩沖體系之一。緩沖溶液的濃度不僅影響毛細(xì)管內(nèi)表面的zeta電勢,還影響溶液的粘度系數(shù)及分析物的擴(kuò)散系數(shù),最終影響分析物的分辨率和遷移時(shí)間。改變硼砂緩沖液(pH7.1)的濃度使其分別為10、20、30、40mmol/L,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度大于30mmol/L時(shí),由于較大電流產(chǎn)生大量焦耳熱和嚴(yán)重的噪聲信號不利于檢測限的提高,明顯引起區(qū)帶展寬;當(dāng)濃度小于20mmol/L時(shí),遷移時(shí)間相對延長,綜合考慮,選擇20mmol/L硼酸鈉溶液為緩沖溶液。分析條件的選擇緩沖溶液濃度對分離的影響硼砂緩沖體系CZE中緩沖溶液的影響和選擇：在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力；

在檢測波長處有低的紫外吸收；

小的淌度（即大體積、低電荷離子）以降低所產(chǎn)生的電流。

CZE中緩沖溶液的影響和選擇：在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能常用的CE緩沖體系：

磷酸鈉體系：寬緩沖范圍

硼酸鈉體系：高pH范圍

Tris-HCl體系：低pH范圍

醋酸-醋酸銨體系：CE/MS常用體系

常用的CE緩沖體系：

磷酸鈉體系：寬緩沖范圍

緩沖溶液pH值對分離的影響改變硼砂緩沖溶液(20mmol/L)的pH值(4.2、7.1、8.0、9.2),當(dāng)pH值大于8時(shí)甲氧芐啶與周圍峰不能完全分開;當(dāng)pH值為4.2時(shí)分離效果更差,所以最佳pH值為7.1。緩沖溶液pH值對分離的影響改變硼砂緩沖溶液(20mmo運(yùn)行電壓對分離的影響考察不同的運(yùn)行電壓(15、20、25kV)對遷移的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)電壓大于20kV時(shí),雖然遷移時(shí)間縮短,但基線噪聲、背景電流增大;當(dāng)運(yùn)行電壓小于20kV時(shí),遷移時(shí)間延長,同時(shí),低運(yùn)行電壓易造成管壁吸附。只有當(dāng)運(yùn)行電壓為20kV時(shí),背景電流適中,信噪比最高,故選用運(yùn)行電壓為20kV。運(yùn)行電壓對分離的影響考察不同的運(yùn)行電壓(15、20、25k毛細(xì)管清洗條件的選擇臨用前采用合適的預(yù)清洗好的毛細(xì)管是保證結(jié)果重現(xiàn)的一個(gè)必要條件,為節(jié)省預(yù)清洗時(shí)間,只在每天開機(jī)后依次用0.1mol/L的NaOH清洗10min,純水沖洗5min,背景緩沖液沖洗5min,每次測定間省去0.1mol/LNaOH清洗之一步驟,僅用緩沖溶液清洗5min,結(jié)果大大提高了遷移時(shí)間的精密度,峰面積的精密度也相應(yīng)增加。毛細(xì)管清洗條件的選擇臨用前采用合適的預(yù)清洗好的毛細(xì)管是保證結(jié)進(jìn)樣方式的選擇電壓進(jìn)樣存在電歧視現(xiàn)象,定量準(zhǔn)確性不高。在上述優(yōu)化條件下,采用壓力進(jìn)樣進(jìn)樣方式的選擇電壓進(jìn)樣存在電歧視現(xiàn)象,定量準(zhǔn)確性不高。在上毛細(xì)管凝膠電泳課件頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的線性范圍分別為0.4～4.0和0.25～4.0μg/ml,檢出限分別為0.1和0.18μg/ml(S/N=3)。該方法測得頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的在低、中、高濃度下的回收率均在95%以上,遷移時(shí)間的RSD分別為0.43%、1.44%;峰面積的RSD分別為3.34%、4.0%,日內(nèi)、日間精密度均符合方法學(xué)要求。頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的線性范圍分別為0.4～4.0和0.二、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜原理：在電場作用下，毛細(xì)管水相可看作流動(dòng)相，膠束相可看作是“準(zhǔn)固定相”，溶質(zhì)由于在膠束相和水相中的分配系數(shù)不同，而在不同的時(shí)間流出。驅(qū)動(dòng)力：電滲流和電泳可分離不帶電的中性有機(jī)物二、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜原理：常用表面活性劑陰離子型：SDS、STS、十二烷基磺酸鈉陽離子型：DTAC、DTAB非離子型：CHAPS手性：膽酸、環(huán)糊精pH影響，低膠束向正極遷移速度大，高電滲流增大常用表面活性劑陰離子型：SDS、STS、十二烷基磺酸鈉pH影常用改性劑及其作用適當(dāng)濃度的有機(jī)改性劑，可增加緩沖液對樣品組分的溶解力。混合溶劑改變?nèi)苜|(zhì)在膠束相和水相間的分配系數(shù)，使弱極性和非極性物質(zhì)的分離成為可能。有機(jī)改性劑可使介電常數(shù)和電滲流系數(shù)下降，保留時(shí)間增加。常用改性劑及其作用適當(dāng)濃度的有機(jī)改性劑，可增加緩沖液對樣品組膠束電動(dòng)色譜的應(yīng)用特點(diǎn):使毛細(xì)管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.比高效液相色譜更為高效.

HPLC分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/mMECC可達(dá)到50000－500000理論板數(shù)/m比高效液相色譜更為高速.MEKC分離時(shí)間通常小于30min，但達(dá)到相仿效率的LC，需要更長的時(shí)間。

膠束電動(dòng)色譜的應(yīng)用特點(diǎn):應(yīng)用示例膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定血中的硫噴妥鈉應(yīng)用示例膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定血中的硫噴妥鈉三、毛細(xì)管凝膠電泳原理CGE

是毛細(xì)管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式

用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子的大小分離

三、毛細(xì)管凝膠電泳原理1987年，Cohen發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳的工作。當(dāng)電泳從凝膠板上移到毛細(xì)管中以后，發(fā)生了奇跡般的變化：分析靈敏度提高到能檢測一個(gè)堿基的變化，分離效率達(dá)百萬理論塔板數(shù)；分析片段能大能小，小到分辨單個(gè)核苷酸的序列，大到分離Mb的DNA；分析時(shí)間由原來的以小時(shí)計(jì)算縮減到以分、秒計(jì)算。1987年，Cohen發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳的工作。當(dāng)電泳從凝毛細(xì)管凝膠電泳是將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用,溶質(zhì)按分子大小逐一分離。凝膠粘度大,能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散,所得峰形尖銳,能達(dá)到CE中最高的柱效。毛細(xì)管凝膠電泳是將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。常用毛細(xì)管凝膠色譜柱聚丙烯酰胺膠聚乙烯基吡咯烷酮聚環(huán)氧乙烷常用毛細(xì)管凝膠色譜柱聚丙烯酰胺膠

四、毛細(xì)管等電聚焦CIEF:

建立在不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點(diǎn)（pI值）差異基礎(chǔ)上的分離方法。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI):

指蛋白質(zhì)分子的表觀電荷數(shù)為零時(shí)的pH值。

四、毛細(xì)管等電聚焦CIEF:方法:

進(jìn)樣－等電聚焦－檢測先將脫鹽的試樣（蛋白質(zhì)）以≥1％的濃度與兩性電解質(zhì)溶液混合，用壓力進(jìn)樣充入毛細(xì)管柱(陽極端)，置于陽極電解質(zhì)溶液如H3PO4中，檢測端為陰極端，置于陰極電解質(zhì)如NaOH中。施加電壓，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。兩性電解質(zhì)離子形成pH的位置梯度，而蛋白質(zhì)在遷移時(shí)會在其等電點(diǎn)的pH區(qū)域內(nèi)停止移動(dòng)。這樣pI不同的蛋白質(zhì)各組分會在毛細(xì)管內(nèi)很窄的不同pH區(qū)域內(nèi)聚焦.在陽、陰極電解液中加入鹽如NaCI或NaOH,破壞pH梯度，使各組分蛋白質(zhì)重新帶電，在電場力作用下發(fā)生遷移、檢測，使不同組分的蛋白質(zhì)得到分離。方法:進(jìn)樣－等電聚焦－檢測特點(diǎn):等電聚焦實(shí)際上也是一個(gè)試樣濃縮過程，這一過程可用于濃縮試樣組分。具有極高的分辯率，可以分離等電點(diǎn)相差0.01pH的兩種蛋白質(zhì).注意:電滲流的存在會破壞聚焦區(qū)帶的穩(wěn)定

特點(diǎn):五、毛細(xì)管電色譜（CEC）

將HPLC的填料填充于毛細(xì)管，以樣品和固定相間的相互作用為分離機(jī)制，以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的分離過程。Packed-columnCECPCCECOpen-tubularCECOTCEC焦?fàn)枱嵝?yīng)、塞子效應(yīng)、氣泡效應(yīng)五、毛細(xì)管電色譜（CEC）將HPLC的填料填充于毛細(xì)管，SophorasubprostataSophorasubprostata毛細(xì)管凝膠電泳課件Tamsulosin坦索洛新Tamsulosin毛細(xì)管凝膠電泳課件毛細(xì)管凝膠電泳課件毛細(xì)管凝膠電泳課件Individualplasmaconcentration–timecurvesofanisodamineenantiomersafterani.g.administrationof140mg/kginfiverabbits.(1)(6R,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.Individualplasmaconce

Individualplasmaconcentration–timecurvesofanisodamineenantiomersafterani.v.administrationof50mg/kginfiverabbits.(1)(6R,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.Individualplasmaconc第九章高效毛細(xì)管電泳法第九章高效毛細(xì)管電泳法High-performancecapillaryelectrophoresisHPCE

是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品中各組分之間的淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分離技術(shù)。第一節(jié)概述High-performancecapillaryele基本構(gòu)造■■■高壓直流電源分離通道－毛細(xì)管檢測器■緩沖液貯存瓶基本構(gòu)造■■■高壓直流電源分離通道－毛細(xì)管檢測器■緩沖液貯存一、基本裝置一、基本裝置電泳

electrophoresis是指溶液中帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的電動(dòng)現(xiàn)象。毛細(xì)管電泳

capillaryelectrophoresis是利用被分析離子在電場作用下移動(dòng)的速率不同而達(dá)到分離的目的，這種技術(shù)主要用來分析在毛細(xì)管緩沖溶液中能離解為離子的物質(zhì)。電泳electrophoresis是指溶液中帶電粒子二、基本原理電泳分離的基礎(chǔ)

=

eE

為離子移動(dòng)的速度

e為電泳遷移率E為毛細(xì)管柱進(jìn)樣端至檢測窗口間電場強(qiáng)度。電荷-尺寸

離子的電泳遷移率不同，在電場中移動(dòng)的速度不一樣，利用這個(gè)原理可以把不同的離子彼此分離。電泳遷移率與分析物質(zhì)所帶電荷呈正比，與摩擦阻力系數(shù)呈反比。如果兩種物質(zhì)帶有不同的電荷或者通過緩沖溶液移動(dòng)的摩擦力不同，那么這兩種物質(zhì)可以彼此分離。二、基本原理電泳分離的基礎(chǔ)=eE為離子移動(dòng)的速度1

離子移動(dòng)的速率

=

eE=eU/LU是毛細(xì)管柱兩端施加的壓力L是毛細(xì)管柱總長。2

毛細(xì)管電泳中的板高N=eU/2D在凝膠板形電泳中，一般最高使用的電壓約為500V。在毛細(xì)管電泳中，一般可采用20,000～60,000V的高電壓。1離子移動(dòng)的速率=eE=eU/LU是毛細(xì)3

電滲流當(dāng)高電壓通過含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時(shí)，管內(nèi)的溶質(zhì)向陰極或陽極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。在柱內(nèi)層氧化硅與溶質(zhì)的界面上形成雙電層是電滲流產(chǎn)生的原因。在典型的毛細(xì)管電泳分離中，若有電滲存在，離子的洗脫順序是:首先是最快的陽離子，緊接著是依次減慢的陽離子，然后是全部的中性分子在一個(gè)區(qū)域出現(xiàn)，最后是最慢的陰離子，緊接著的是依次加快的陰離子。3電滲流當(dāng)高電壓通過含有緩沖溶液的毛細(xì)管柱時(shí)，管內(nèi)的溶電滲流的正面作用：

1.增加分離速度；

2.使得正、負(fù)電荷物質(zhì)同時(shí)分離。

電滲流的負(fù)面作用：

1、減少分離時(shí)間和分離有效距離；

2、電滲流的波動(dòng)極大的影響遷移時(shí)間的重復(fù)性。

電滲流的正面作用：

1.增加分離速度；

2.使得正、負(fù)電影響電滲流的因素：

PH值：

PH值越高，電滲流越大。離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，電滲流越小。

緩沖溶液添加劑：離子型表面活性劑、有機(jī)溶劑、環(huán)糊精

影響電滲流的因素：PH值：

PH值越高，電滲流越大?？刂齐姖B流的三個(gè)重要手段：

采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響；

改變pH，從而調(diào)整電滲流的大小。pH<3時(shí)電滲流很低；當(dāng)pH>10以后，電滲流基本不增加；

添加劑：有機(jī)溶劑可以降低電滲流的大小，從而增加分離的有效距離；表面活性劑可以徹底改變電滲流的方向和大小，主要是在陰離子分析時(shí)使用。

控制電滲流的三個(gè)重要手段：采用涂層毛細(xì)管，消除電滲流的影響（4）進(jìn)樣方式

電動(dòng)進(jìn)樣

是將毛細(xì)管柱的一端及其相應(yīng)端的電極從緩沖池中移出，放入試樣杯中，然后在一準(zhǔn)確時(shí)間范圍內(nèi)施加壓力，使試樣因離子移動(dòng)和電滲流進(jìn)入毛細(xì)管柱。

壓力進(jìn)樣

是用壓差使試樣溶液進(jìn)入毛細(xì)管。（4）進(jìn)樣方式三、方法特點(diǎn)

瑞典化學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳”，成功地將人血清中的蛋白質(zhì)分為5個(gè)主要成分，為蛋白質(zhì)化學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。諾貝爾獎(jiǎng)優(yōu)點(diǎn):1.簡單方便；2.高效快速；3.操作模式多4.成本低；5.應(yīng)用范圍廣三、方法特點(diǎn)瑞典化學(xué)家Tiselius建立了“移界電泳20世紀(jì)30－40年代蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動(dòng)界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術(shù)獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1981年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs實(shí)驗(yàn)上和理論上為毛細(xì)管電泳的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。上一世紀(jì)后二十多年分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最迅速的分離分析方法。

20世紀(jì)30－40年代第二節(jié)主要分離模式與應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜MECC毛細(xì)管等速電泳CITP毛細(xì)管等電聚焦CIEF毛細(xì)管凝膠電泳CGE毛細(xì)管電色譜CEC第二節(jié)主要分離模式與應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

基于試樣中各個(gè)組分間荷質(zhì)比的差異進(jìn)行分離的。這種電泳模式的特征是整個(gè)系統(tǒng)都用同一種緩沖溶液充滿。背景電解質(zhì)的濃度一般高于試樣，起運(yùn)載電流的作用，其離子有一定的遷移率。當(dāng)電流通過時(shí)，緩沖溶液中的陰，陽離子分別以一特定的速度分別向正極和負(fù)極移動(dòng)。同時(shí)試樣中的不同離子將按各自的恒定速度移動(dòng)，形成背景電解質(zhì)離子流動(dòng)中伴隨有試樣離子的流動(dòng)。如果試樣中不同離子的遷移率差別很大，就能將不同離子分離。一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳基于試樣中各個(gè)組分間一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（一）基本公式及影響因素根據(jù)組分在電場E中遷移速度不同來分離。

Vep=μepE=μepV/LVep：遷移速度；μep：電泳遷移率V:

毛細(xì)管兩端的外加電壓L：毛細(xì)管的長度電泳載體的電滲流

VOS=μOSE=μOSV/L一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳（一）基本公式及影響因素V=Vep+VOS

tR=L/V=L2/(μep+μOS

)Vn=(μep+μOS

)V/2Dn與外加電壓及μep和μOS

有關(guān)n隨分子量增大、擴(kuò)散系數(shù)D變小而提高CZE主要用于能解離的組分的分離，尤其是帶正電荷的陽離子的分離。V=Vep+VOSRs=（n1/2/4）×（Δυ/υ平）Δυ相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差υ平為兩者的平均速度Δυ/υ平表示分離選擇性n為柱效Rs=（n1/2/4）×（Δυ/υ平）添加劑添加劑類型--甲醇、環(huán)糊精、乙腈

添加劑的目的：

a改善分離；

b抑制分析物在毛細(xì)管上的吸附。

添加劑添加劑類型--甲醇、環(huán)糊精、乙腈添加劑的選擇：

甲醇、乙腈（百分之五到百分之五十）：

降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果；

增加非極性物質(zhì)的水溶性。

環(huán)糊精、SDS等表面活性劑：

增加分離選擇性，提高分析效果；

降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果。

非極性高分子聚合物：

掩蔽毛細(xì)管內(nèi)壁電荷，抑制分子吸附；

降低電滲流；

形成一定的分子篩，提高分子大小選擇性。

添加劑的選擇：

甲醇、乙腈（百分之五到百分之五十）：

（二）生物樣本的預(yù)處理去除蛋白，常用乙腈毛細(xì)管預(yù)處理直接進(jìn)樣后處理（二）生物樣本的預(yù)處理去除蛋白，常用乙腈（三）應(yīng)用示例CZE法同時(shí)測定血漿中頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的含量電泳條件石英毛細(xì)管35cm×75μm(i.d);分離電壓20kV;操作溫度25℃;壓力方式進(jìn)樣3.45kPa×10s;正極進(jìn)樣,負(fù)極柱上267nm檢測;緩沖液20mmol/L硼砂(pH7.1)。每次運(yùn)行前用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、二次重蒸水和緩沖液分別沖洗3min、3min和5min。血漿預(yù)處理兔血漿0.5ml加入1倍體積量的蛋白質(zhì)沉淀劑乙腈∶1mol/L鹽酸（95∶5）,渦旋振蕩3min,10000r/min離心10min,取上液進(jìn)行分析。中國抗生素雜志2005年6月第30卷第6期（三）應(yīng)用示例CZE法同時(shí)測定血漿中頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的含分析條件的選擇緩沖溶液濃度對分離的影響

硼砂緩沖體系紫外吸收低,是毛細(xì)管電泳分析中最常用的緩沖體系之一。緩沖溶液的濃度不僅影響毛細(xì)管內(nèi)表面的zeta電勢,還影響溶液的粘度系數(shù)及分析物的擴(kuò)散系數(shù),最終影響分析物的分辨率和遷移時(shí)間。改變硼砂緩沖液(pH7.1)的濃度使其分別為10、20、30、40mmol/L,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度大于30mmol/L時(shí),由于較大電流產(chǎn)生大量焦耳熱和嚴(yán)重的噪聲信號不利于檢測限的提高,明顯引起區(qū)帶展寬;當(dāng)濃度小于20mmol/L時(shí),遷移時(shí)間相對延長,綜合考慮,選擇20mmol/L硼酸鈉溶液為緩沖溶液。分析條件的選擇緩沖溶液濃度對分離的影響硼砂緩沖體系CZE中緩沖溶液的影響和選擇：在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力；

在檢測波長處有低的紫外吸收；

小的淌度（即大體積、低電荷離子）以降低所產(chǎn)生的電流。

CZE中緩沖溶液的影響和選擇：在所選的pH范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能常用的CE緩沖體系：

磷酸鈉體系：寬緩沖范圍

硼酸鈉體系：高pH范圍

Tris-HCl體系：低pH范圍

醋酸-醋酸銨體系：CE/MS常用體系

常用的CE緩沖體系：

磷酸鈉體系：寬緩沖范圍

緩沖溶液pH值對分離的影響改變硼砂緩沖溶液(20mmol/L)的pH值(4.2、7.1、8.0、9.2),當(dāng)pH值大于8時(shí)甲氧芐啶與周圍峰不能完全分開;當(dāng)pH值為4.2時(shí)分離效果更差,所以最佳pH值為7.1。緩沖溶液pH值對分離的影響改變硼砂緩沖溶液(20mmo運(yùn)行電壓對分離的影響考察不同的運(yùn)行電壓(15、20、25kV)對遷移的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)電壓大于20kV時(shí),雖然遷移時(shí)間縮短,但基線噪聲、背景電流增大;當(dāng)運(yùn)行電壓小于20kV時(shí),遷移時(shí)間延長,同時(shí),低運(yùn)行電壓易造成管壁吸附。只有當(dāng)運(yùn)行電壓為20kV時(shí),背景電流適中,信噪比最高,故選用運(yùn)行電壓為20kV。運(yùn)行電壓對分離的影響考察不同的運(yùn)行電壓(15、20、25k毛細(xì)管清洗條件的選擇臨用前采用合適的預(yù)清洗好的毛細(xì)管是保證結(jié)果重現(xiàn)的一個(gè)必要條件,為節(jié)省預(yù)清洗時(shí)間,只在每天開機(jī)后依次用0.1mol/L的NaOH清洗10min,純水沖洗5min,背景緩沖液沖洗5min,每次測定間省去0.1mol/LNaOH清洗之一步驟,僅用緩沖溶液清洗5min,結(jié)果大大提高了遷移時(shí)間的精密度,峰面積的精密度也相應(yīng)增加。毛細(xì)管清洗條件的選擇臨用前采用合適的預(yù)清洗好的毛細(xì)管是保證結(jié)進(jìn)樣方式的選擇電壓進(jìn)樣存在電歧視現(xiàn)象,定量準(zhǔn)確性不高。在上述優(yōu)化條件下,采用壓力進(jìn)樣進(jìn)樣方式的選擇電壓進(jìn)樣存在電歧視現(xiàn)象,定量準(zhǔn)確性不高。在上毛細(xì)管凝膠電泳課件頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的線性范圍分別為0.4～4.0和0.25～4.0μg/ml,檢出限分別為0.1和0.18μg/ml(S/N=3)。該方法測得頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的在低、中、高濃度下的回收率均在95%以上,遷移時(shí)間的RSD分別為0.43%、1.44%;峰面積的RSD分別為3.34%、4.0%,日內(nèi)、日間精密度均符合方法學(xué)要求。頭孢羥氨芐和甲氧芐啶的線性范圍分別為0.4～4.0和0.二、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜原理：在電場作用下，毛細(xì)管水相可看作流動(dòng)相，膠束相可看作是“準(zhǔn)固定相”，溶質(zhì)由于在膠束相和水相中的分配系數(shù)不同，而在不同的時(shí)間流出。驅(qū)動(dòng)力：電滲流和電泳可分離不帶電的中性有機(jī)物二、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜原理：常用表面活性劑陰離子型：SDS、STS、十二烷基磺酸鈉陽離子型：DTAC、DTAB非離子型：CHAPS手性：膽酸、環(huán)糊精pH影響，低膠束向正極遷移速度大，高電滲流增大常用表面活性劑陰離子型：SDS、STS、十二烷基磺酸鈉pH影常用改性劑及其作用適當(dāng)濃度的有機(jī)改性劑，可增加緩沖液對樣品組分的溶解力?；旌先軇└淖?nèi)苜|(zhì)在膠束相和水相間的分配系數(shù)，使弱極性和非極性物質(zhì)的分離成為可能。有機(jī)改性劑可使介電常數(shù)和電滲流系數(shù)下降，保留時(shí)間增加。常用改性劑及其作用適當(dāng)濃度的有機(jī)改性劑，可增加緩沖液對樣品組膠束電動(dòng)色譜的應(yīng)用特點(diǎn):使毛細(xì)管電泳不僅能分離離子化合物，而且還能分離中性化合物.比高效液相色譜更為高效.

HPLC分離柱效為5000－25000理論板數(shù)/mMECC可達(dá)到50000－500000理論板數(shù)/m比高效液相色譜更為高速.MEKC分離時(shí)間通常小于30min，但達(dá)到相仿效率的LC，需要更長的時(shí)間。

膠束電動(dòng)色譜的應(yīng)用特點(diǎn):應(yīng)用示例膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定血中的硫噴妥鈉應(yīng)用示例膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測定血中的硫噴妥鈉三、毛細(xì)管凝膠電泳原理CGE

是毛細(xì)管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式

用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子的大小分離

三、毛細(xì)管凝膠電泳原理1987年，Cohen發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳的工作。當(dāng)電泳從凝膠板上移到毛細(xì)管中以后，發(fā)生了奇跡般的變化：分析靈敏度提高到能檢測一個(gè)堿基的變化，分離效率達(dá)百萬理論塔板數(shù)；分析片段能大能小，小到分辨單個(gè)核苷酸的序列，大到分離Mb的DNA；分析時(shí)間由原來