基因工程在生物肥料上的開(kāi)發(fā)利用

基因論文題目：基因工程在生物肥料上的開(kāi)發(fā)利用學(xué)生姓名：學(xué)號(hào)：專業(yè)年級(jí)：生物技術(shù)2010級(jí)所在學(xué)院：基因工程在生物肥料上的開(kāi)發(fā)應(yīng)用xxx（xxx學(xué)院，xx，xxxx）摘要在當(dāng)今世界世界人口的不斷增長(zhǎng),自然資源的耗減和環(huán)境污染等問(wèn)題的頻頻出現(xiàn)促使人們把追求人與自然和諧相處推上當(dāng)今社會(huì)發(fā)展主要的位置，現(xiàn)今，低碳環(huán)保型生活是廣大群眾所競(jìng)相追逐的的潮流，而且生態(tài)文明建設(shè)也已經(jīng)成為全球性的時(shí)代的潮流?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中出現(xiàn)的一些生態(tài)問(wèn)題對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展已構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。對(duì)于建立綠色環(huán)保型生態(tài)農(nóng)業(yè)也日趨重要。綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式既適應(yīng)了社會(huì)發(fā)展和人類(lèi)文明進(jìn)步的要求，同時(shí)也為微生物肥料提供了廣闊的發(fā)展空間，實(shí)踐也證明生物肥料在土壤肥力的提高與保持、營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化、提高化肥利用率、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、拮抗土傳病害，環(huán)境凈化與生態(tài)系統(tǒng)的平衡等方面起著重要的作用。而且,生物肥料在環(huán)境保護(hù)及產(chǎn)量方面,并不低于化肥。因此生物肥料在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、資源節(jié)約和環(huán)境友好型社會(huì)建設(shè)中將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，市場(chǎng)潛力巨大，研究和開(kāi)發(fā)微生物肥料具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益。目前，我國(guó)微生物肥料生產(chǎn)的發(fā)展機(jī)遇是前所未有的。生物肥料也會(huì)在未來(lái)的中國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中起到不可替代的作用。關(guān)鍵詞:微生物肥料;生態(tài)文明;可持續(xù)發(fā)展1生物肥料的簡(jiǎn)介生物肥料是指一類(lèi)含有活微生物的特定制劑，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料效應(yīng)。由于生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農(nóng)作物對(duì)硝態(tài)氮、重金屬、農(nóng)藥的吸收，凈化和修復(fù)土壤，降低農(nóng)作物病害發(fā)生，促進(jìn)農(nóng)作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用，保護(hù)環(huán)境以及提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全等方面表現(xiàn)出不可替代的作用，發(fā)展前景良好。目前，生物肥料可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是狹義的生物肥料，是指含有特定微生物活體的制品，一般應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，通過(guò)其中所含微生物的生命活動(dòng)，增加植物養(yǎng)分的供應(yīng)量或促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，改變農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境；另一類(lèi)則是廣義的生物肥料，是指通過(guò)其中的微生物的生命活動(dòng)，不但能提高植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)量，還能產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，減輕農(nóng)作物病蟲(chóng)害而促進(jìn)作物產(chǎn)量的增加。生物肥料的種類(lèi)很多，現(xiàn)在推廣應(yīng)用的主要有根瘤菌類(lèi)肥料、固氮菌類(lèi)肥料、解磷解鉀菌類(lèi)肥料、抗生菌類(lèi)肥料和真菌類(lèi)肥料等等[2]。2與生物肥料相關(guān)微生物目前，自然界中可進(jìn)行生物固氮的微生物種屬范圍分布較廣，按其固氮方式主要可分成自生固氮、共生固氮和聯(lián)合固氮微生物3種：⑴自生固氮微生物，能獨(dú)立固氮，主要分布于細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌的不同科、屬及生理群中，如紅螺菌、紅硫細(xì)菌、綠硫細(xì)菌和梭狀芽胞桿菌等都是自生固氮菌，利用光能或化能固定氮素；⑵共生固氮微生物，主要通過(guò)與宿主植物形成共生固氮體系，進(jìn)行生物固氮，根據(jù)固氮微生物的寄主植物類(lèi)型又分為與豆科植物共生和非豆科植物共生2種；⑶聯(lián)合固氮微生物，主要是聚集在根表或通過(guò)植物根部傷口定植到根內(nèi)，不形成根瘤狀特異化結(jié)構(gòu)的一種特殊共生固氮體系，其中聯(lián)合固氮微生物以根際分泌物為碳源和能源，而植物則得到固氮菌固定的氮及分泌的生物活性物質(zhì)[3]。3生物肥料的主要作用目前社會(huì)上對(duì)生物肥料的看法存在一定的誤解或偏見(jiàn)。有看法認(rèn)為,生物肥料的肥效很高，把它當(dāng)成萬(wàn)能肥料，甚至認(rèn)為可以取代化肥,有看法則認(rèn)為菌肥根本無(wú)效，或者與復(fù)合化肥中營(yíng)養(yǎng)元素相比，認(rèn)為其養(yǎng)分不足。合理使用生物肥料既可以補(bǔ)充化肥的不足，又可以減少環(huán)境污染和保護(hù)生態(tài)環(huán)境。生物肥料的作用是多方面的。它可以作為綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的肥料、土壤凈化劑、土壤改良劑,不僅能提高土壤肥力,還可促進(jìn)土壤的良性循環(huán);此外,生物肥料的施用可以提高化肥利用率,對(duì)減少經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)和保護(hù)環(huán)境起到一定的作用。生物肥料的重要作用如下：⑴生物固氮微肥中的根瘤菌、固氮菌等微生物能將空氣中的氮固定并轉(zhuǎn)化供農(nóng)作物吸收利用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，固氮菌每667m2能固定45kg氮，全世界每年生物固氮總量約為13t，因此，開(kāi)發(fā)利用生物固氮是低成本制造氮肥的重要途徑。⑵降低環(huán)境污染、提高產(chǎn)品品質(zhì)微生物肥料中含多種解磷、鉀微生物，如芽抱桿菌、假單胞菌，它們可以將土壤中的難溶的有機(jī)或無(wú)機(jī)磷或鉀分解為植物可以吸收利用的可溶性磷、鉀，從而提高了土壤的肥力和肥料的利用率，使農(nóng)作物的安全性提高，環(huán)境得到保護(hù)。⑶促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)一些微生物細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可產(chǎn)生大量的各類(lèi)植物生長(zhǎng)激素，能夠調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)，部分激素還能打破種子休眠，促進(jìn)生根、發(fā)芽，使作物提前成熟，這些特點(diǎn)都是化肥所不具備的。⑷抗病、抗旱，增產(chǎn)增收施用微生物肥料后，在植物根基區(qū)，有益細(xì)菌形成優(yōu)勢(shì)群體，抑制病原微生物的人侵，提高植株的抗病能力;同時(shí)，合理施用微生物肥料會(huì)改善土壤結(jié)構(gòu)，減少板結(jié)，增強(qiáng)土壤肥力，增產(chǎn)增收[4]。⑸提高化肥利用率微生物肥料與化肥混合施用,既可增產(chǎn)又減少化肥用量,降低成本,亦可改善土壤及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì),減少污染,發(fā)展綠色食品。中國(guó)綠色食品發(fā)展中心已將微生物肥料列入生產(chǎn)綠色食品允許使用的肥料。⑹改良土壤生物肥料中有益微生物能產(chǎn)生糖類(lèi)物質(zhì)與植物粘液、礦物膠體和有機(jī)膠體結(jié)合在一起,可以改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu),提高土壤肥力,增強(qiáng)土壤物理性能和減少土壤顆粒損失,在一定條件下還能參與腐殖質(zhì)形成,增進(jìn)腐殖酸含量,改善土壤腐殖酸的品質(zhì),減少環(huán)境污染[5]。4生物肥料的應(yīng)用前景生物肥料可以節(jié)約能源，降低生產(chǎn)成本，且其不僅用量少，而且本身具有無(wú)毒無(wú)害，沒(méi)有環(huán)境污染的特點(diǎn)，而且生物肥料在作物增產(chǎn)和品質(zhì)改善等方面具有重要的積極作用，故其擁有廣闊的前景，具體如下：⑴適用品種多，市場(chǎng)需量大適宜施用微生物肥料的作物種類(lèi)繁多，各種豆科作物、糧食作物、蔬菜瓜果等都可以應(yīng)用微生物肥料提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)。據(jù)不完全，我國(guó)目前微生物肥料年產(chǎn)量在10萬(wàn)~40萬(wàn)t，與同期化肥相比，微不足道，微生物肥料市場(chǎng)容量是相當(dāng)大的。⑵生產(chǎn)成本低，應(yīng)用效果好化肥生產(chǎn)成本的提高，價(jià)格上漲幅度過(guò)快，令廣大農(nóng)民難以接受，且效果差，污染環(huán)境。微生物肥料以生物固氮為例，它可以持續(xù)不斷供應(yīng)氮素營(yíng)養(yǎng)，并且能夠減少環(huán)境污染和溫室效應(yīng)，污染少，成本低。⑶生產(chǎn)無(wú)公害綠色食品，減少環(huán)境污染的需要隨著綠色農(nóng)業(yè)(生態(tài)農(nóng)業(yè))的發(fā)展，生產(chǎn)安全、無(wú)公害的綠色食品已成為一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。并且由于大量使用化肥，土壤性質(zhì)惡化，土壤質(zhì)量下降，地下水污染等問(wèn)題日益突出；消納城市廢棄物的壓力愈來(lái)愈大，因此，無(wú)污染的微生物肥料的綜合利用和開(kāi)發(fā)顯示出它的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和良好發(fā)展前景。⑷通過(guò)篩選優(yōu)良菌種、改進(jìn)生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)設(shè)備為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的微生物肥料創(chuàng)造了條件，而且基因工程新菌株的出現(xiàn)使微生物肥料的廣泛應(yīng)用成為可能。近年來(lái)興起的植物根際促生細(xì)菌(PGPR)的研究和開(kāi)發(fā)，更為微生物肥料的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊前景[6-8]。5基因工程對(duì)生物肥料菌株的改造5.1材料和方法5.1.1供試菌株快生型大豆根瘤菌15067、土著大豆根瘤菌、大腸桿菌(E.coli)DH5α5.1.2質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pTR102、質(zhì)粒載體pUC19(含有l(wèi)ac啟動(dòng)子)、質(zhì)粒載體pET-28a、輔助質(zhì)粒pRK2073。5.1.3nifA基因的克隆以快生型大豆根瘤菌15067的基因組DNA為模板,采用同源序列克隆法,設(shè)計(jì)nifA基因全長(zhǎng)的特異性引物(P1,P2),采用PCR方法,擴(kuò)增目的基因nifA基因全長(zhǎng)。對(duì)回收的DNA片段進(jìn)行純化,并進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,采用PCR方法進(jìn)行簽定,將陽(yáng)性克隆測(cè)序。5.1.4表達(dá)載體pTR-Plac-nifA的構(gòu)建將nifA基因全長(zhǎng)連入質(zhì)粒載體pUC19中l(wèi)ac啟動(dòng)子下游,構(gòu)建重組載體pUC19-nifA;設(shè)計(jì)引物(P3,P4),PCR擴(kuò)增帶有l(wèi)ac啟動(dòng)子的nifA基因(Plac-nifA)片段。將其連入pET-28a多克隆位點(diǎn)處,構(gòu)建重組載體pET-28a-Plac-nifA;設(shè)計(jì)引物(P5,P6),PCR擴(kuò)增帶有l(wèi)ac啟動(dòng)子的nifA基因以及T7終止子(Plac-nifA-T7)片段,并將該片段連到luxAB基因標(biāo)記的質(zhì)粒載體pTR102,構(gòu)建表達(dá)載體pTR-Plac-nifA。5.1.5大豆根瘤菌基因工程菌株的構(gòu)建采用三親本雜交的方法,將表達(dá)載體pTR102-Plac-nifA轉(zhuǎn)化土著大豆根瘤菌。由于重組載體pTR-Plac-nifA上含有發(fā)光酶基因luxAB,利用癸醛對(duì)培養(yǎng)的平板中的大豆根瘤菌轉(zhuǎn)移接合子進(jìn)行發(fā)光性檢測(cè),并用X光片進(jìn)行結(jié)果記錄[9]。5.2討論目前在根瘤菌中已發(fā)現(xiàn)三類(lèi)固氮基因:結(jié)瘤基因(nod)、固氮基因(nif)和共生固氮基因(fix)。對(duì)根瘤菌中的這三個(gè)基因加以改造可以提高固氮能力。也可以通過(guò)加入某些促進(jìn)因子是固氮基因能夠高效率表達(dá)，增加固氮效率。土著根瘤菌的固氮能力較低,根瘤菌的固氮過(guò)程主要由nif基因簇控制,其中nifA基因是最重要的正調(diào)節(jié)基因,對(duì)根瘤菌的固氮和結(jié)瘤生理過(guò)程起著決定性的作用。利用基因工程方法構(gòu)建重組根瘤菌菌株主要路線有兩條:一是提高根瘤菌的固氮效率;二是增強(qiáng)根瘤菌的強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力。上述研究采用分子生物學(xué)及基因工程手段增加nifA基因的額外拷貝數(shù),構(gòu)建高效固氮根瘤菌工程菌株,該菌與豆科植物共生,在根部形成根瘤,可以為植物提供生長(zhǎng)所需要的部分氮素,提高大豆植株的固氮結(jié)瘤能力,同時(shí)nifA基因誘導(dǎo)宿主防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)[10-12]。同時(shí)在構(gòu)建載體中引入luxAB標(biāo)記基因,該基因具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、直觀的特點(diǎn),可顯著提高重組子篩選的效率及根瘤檢測(cè)的準(zhǔn)確性。為了生產(chǎn)無(wú)污染的綠色農(nóng)產(chǎn)品,構(gòu)建既能利用大氣中的有效資源,又能抗病的基因工程菌株,既降低了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本,又減輕了環(huán)境污染,也促進(jìn)了生態(tài)平衡,有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,這將成為今后生物固氮研究領(lǐng)域中的發(fā)展方向和追求目標(biāo)。氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的決定性作用眾所周知,在我國(guó)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮素限制普遍存在,但同時(shí)氮肥浪費(fèi)造成的污染卻在不斷加劇,因此共生固氮在提供氮素、減少污染及受損生態(tài)系統(tǒng)功能恢復(fù)中的作用將會(huì)更加引人注目,今后的理論研究應(yīng)集中在以下方面:①共生固氮植物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中植被格局、地上和地下生態(tài)過(guò)程的作用,影響共生固氮速率的因素極其生態(tài)學(xué)機(jī)制;②對(duì)豆科植物及其根瘤菌的遺傳結(jié)構(gòu)改造,提高豆科植物共生固氮體系的抗逆能力,選育和培育高效、抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)的共生體系③豆科植物細(xì)胞中特異的結(jié)瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路嫁接到其他非豆科植物根瘤菌生長(zhǎng)信號(hào)通路上,在非豆科植物特別是主要農(nóng)作物中構(gòu)建共生固氮體系,打破根瘤菌的宿主專一性,以實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[13]。而且目前也存在著基因工程安全性問(wèn)題，要在建立嚴(yán)格的篩選體系，篩選出目標(biāo)效能穩(wěn)定抗逆性好的菌株。而且通過(guò)基因工程的技術(shù)手段構(gòu)建的基因工程菌株一定要符合安全性要求，以免造成生態(tài)入侵等嚴(yán)重的生態(tài)危機(jī)。在基因工程后期生產(chǎn)中要提高生產(chǎn)工藝，確保產(chǎn)品質(zhì)量。生物肥料的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有待于進(jìn)一步完善。參考文獻(xiàn)[1]孟瑤,徐鳳花,孟慶有,顧萬(wàn)榮.中國(guó)微生物肥料研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].土壤肥料科學(xué),2008,24（6）:276-283.[2]張彥，孫磊，盧麗娜.微生物肥料在綠色農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用.第三屆微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì)會(huì)議論文摘要.[3]何元?jiǎng)?胡曉峰,岳寧,周佳,陳俊秋,弓新國(guó).微生物肥料的作用機(jī)理及其應(yīng)用前景[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,13-16.[4]張強(qiáng),秦濤,張紅艷,阮祥穩(wěn).微生物肥料的研究應(yīng)用進(jìn)展[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,42（增）:159-160.[5]葉光祎,劉友林,尹增松.微生物肥料發(fā)展?fàn)顩r及前景[J].云南農(nóng)業(yè),1999,7;22.[6]趙娟娟.微生物肥料的作用及應(yīng)用前景[J].土肥水利,46.[7]袁田,熊格生,劉志,賀利熊.微生物肥料的研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,（7）:44-47[8]盛玉婷.微生物肥料的發(fā)展現(xiàn)狀及前景[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,14(11):80-81.[9]李海英,張喜波,劉金玲,于海鵬,楊樂(lè),蒙明明,賈珊珊.導(dǎo)入額外拷貝nifA基因的大豆根瘤菌工程菌株的構(gòu)建[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2010,27