微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)及染色操作

微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)及染色操作

河南師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心一、目的要求學(xué)會血球計(jì)數(shù)板的使用方法了解革蘭氏染色的原理學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色的方法二酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)原理

微生物常用的計(jì)數(shù)方法有兩種，即直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。前者利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，能立即得到數(shù)值，但死活細(xì)胞都計(jì)數(shù)在內(nèi)。后者是在乎板上長成菌落后再計(jì)數(shù)，反應(yīng)較真實(shí)，但費(fèi)時(shí)太長。本實(shí)驗(yàn)是利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前需對樣品做適當(dāng)稀釋，按照規(guī)定方法及計(jì)算公式運(yùn)算后，即可得出實(shí)際數(shù)值。

細(xì)菌染色基本原理革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。肽聚糖(peptidoglycan)革蘭陽性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽側(cè)鏈、五肽交聯(lián)橋青霉素作用點(diǎn)溶菌酶作用點(diǎn)N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸革蘭陰性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽側(cè)鏈肽聚糖(peptidoglycan)革蘭陽性菌細(xì)胞壁特殊組分壁磷壁酸膜磷壁酸革蘭陰性菌細(xì)胞壁特殊組分革蘭陽性菌與陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較細(xì)胞壁革蘭陽性菌革蘭陰性菌強(qiáng)度較堅(jiān)韌較疏松厚度20-80nm10-15nm肽聚糖層數(shù)可多達(dá)50層1-2層肽聚糖含量占細(xì)胞壁干重50%-80%占細(xì)胞壁干重5%-20%磷壁酸+—外膜—+脂蛋白—+脂多糖—+革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basicdye）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorisingagent）和復(fù)染液（counterstain）。堿性染料初染液——結(jié)晶紫（crystalviolet）媒染劑——碘（iodine）脫色劑——95％的酒精（ethanol）復(fù)染液——番紅三、、實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)器器材材大腸腸桿桿菌菌，，枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌、、未未知知菌菌；；草酸酸銨銨結(jié)結(jié)晶晶紫紫，，番番水水水水溶溶液液，，碘碘液液，，95%乙乙醇醇，，載載玻玻片片，，顯顯微微鏡鏡等等。。顯微微鏡鏡、、物物鏡鏡測測微微尺尺、、目目鏡鏡測測微微尺尺、、血血球球計(jì)計(jì)數(shù)數(shù)板板、、載載玻玻片片等等。。麥芽芽汁汁培培養(yǎng)養(yǎng)基基、、酵酵母母菌菌。。吸管管、、吸吸水水紙紙等等。。四、、實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)步步驟驟1．．涂涂片片：：將將培培養(yǎng)養(yǎng)24小小時(shí)時(shí)的的大大腸腸桿桿菌菌和和未未知知菌菌，，培培養(yǎng)養(yǎng)12-18小小時(shí)時(shí)的的枯枯草草芽芽孢孢桿桿球球菌菌、、分分別別作作涂涂片片（（注注意意涂涂片片切切不不可可過過于于濃濃厚厚）），，干干燥燥、、固固定定。。固固定定時(shí)時(shí)通通過過火火焰焰1～～2次次即即可可，，不不可可過過熱熱，，以以載載玻玻片片不不燙燙手手為為宜宜。。（一一））染染色色實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)2．．染染色色（1））初初染染：：加加草草酸酸銨銨結(jié)結(jié)晶晶紫紫一一滴滴，，約約一一分分鐘鐘，，水水洗洗。。（2））媒媒染染：：滴滴加加碘碘液液沖沖去去殘殘水水，，并并覆覆蓋蓋約約一一分分鐘鐘，，水水洗洗。。（3））脫脫色色：：將將載載玻玻片片上上面面的的水水甩甩凈凈，，并并襯襯以以白白背背景景，，用用95％％酒酒精精滴滴洗洗至至流流出出酒酒精精剛剛剛剛不不出出現(xiàn)現(xiàn)紫紫色色時(shí)時(shí)為為止止，，約約20～～30秒秒鐘鐘，，立立即即用用水水沖沖凈凈酒酒精精。。（4））復(fù)復(fù)染染：：用用番番紅紅液液染染1～～2分分鐘鐘，，水水洗洗。。（5））干干燥燥和和鏡鏡檢檢：：干干燥燥后后，，置置油油鏡鏡觀觀察察。。革革蘭蘭氏氏陰陰性性菌菌呈呈紅紅色色，，革革蘭蘭氏氏陽陽性性菌菌呈呈紫紫色色。。以以分分散散開開的的細(xì)細(xì)菌菌的的革革蘭蘭氏氏染染色色反反應(yīng)應(yīng)為為準(zhǔn)準(zhǔn)，，過過于于密密集集的的細(xì)細(xì)菌菌，，常常常常呈呈假假陽陽性性。。（6））同同法法在在一一載載玻玻片片上上以以大大腸腸桿桿菌菌與與枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌混混合合制制片片，，作作革革蘭蘭氏氏染染色色對對比比。。革蘭氏氏染色色的關(guān)關(guān)鍵在在于嚴(yán)嚴(yán)格掌掌握酒酒精脫脫色程程度，，如脫脫色過過度，，則陽陽性菌菌可被被誤染染為陰陰性菌菌；而而脫色色不夠夠時(shí)，，陰性性菌可可被誤誤染為為陽性性菌。。此外外，菌菌齡也也影響響染色色結(jié)果果，如如陽性性菌培培養(yǎng)時(shí)時(shí)間過過長，，或已已死亡亡及部部分菌菌自行行溶解解了，，都常常呈陰陰性反反應(yīng)。。大腸桿桿菌革革蘭氏氏染色色炭疽芽胞桿菌(二)酵母母細(xì)胞胞數(shù)的的測定定操作作方法法1.血球計(jì)計(jì)數(shù)板板的構(gòu)構(gòu)造血球計(jì)計(jì)數(shù)板板是由由一塊塊比普普通載載玻片片厚的的特制制玻片片制成成的。。玻片片中有有四條條下凹凹的槽槽，構(gòu)構(gòu)成三三個(gè)平平臺。。中間間的平平臺較較寬，，其中中間又又被一一短橫橫槽隔隔為兩兩半，，每半半邊上上面?zhèn)€個(gè)刻有有一個(gè)個(gè)方格格網(wǎng)。。方格格網(wǎng)上上刻有有9個(gè)大方方格，，其中中只有有中間間的一一個(gè)大大方格格為計(jì)計(jì)數(shù)室室，供供微生生物計(jì)計(jì)數(shù)用用。這這一大大方格格的長長和寬寬各為為1m，深度度為，，其體體積為為0.1mm3。計(jì)數(shù)室室通常常有兩兩種規(guī)規(guī)格。。一種種是大大方格格內(nèi)分分為16中中格，，每一一中格格又分分為25小小格；；另一一種是是大方方格內(nèi)內(nèi)分為為25中格格，每每一中中格又又分為為16小格格。但但是不不管計(jì)計(jì)數(shù)室室是哪哪一種種構(gòu)造造；它它們都都有一一個(gè)共共同的的特點(diǎn)點(diǎn)，即即每一一大方方格都都是由由16×25=25×16=400個(gè)個(gè)小方方格組組成，，見圖圖。2.血血球計(jì)計(jì)數(shù)板板的使使用(1)用血血球計(jì)計(jì)數(shù)板板計(jì)數(shù)數(shù)酵母母菌懸懸液的的酵母母菌個(gè)個(gè)數(shù)。。(2)樣品稀稀釋的的目的的是便便于酵酵母菌菌懸液液的計(jì)計(jì)數(shù)，，以每每小方方格內(nèi)內(nèi)含有有4-5個(gè)酵母母細(xì)胞胞為宜宜，一一般稀稀釋10倍即可可。(3)將血血球計(jì)計(jì)數(shù)板板用擦擦鏡紙紙擦凈凈，在在中央央的計(jì)計(jì)數(shù)室室上加加蓋專專用的的厚玻玻片。。(4)將稀稀釋后后的酵酵母菌菌懸液液，用用吸管管吸取取一滴滴置于于蓋玻玻片的的邊緣緣，使使菌液液緩緩緩滲入入，多多余的的菌液液用吸吸水紙紙吸取取，捎捎待片片刻，，使酵酵母菌菌全部部沉降降到血血球計(jì)計(jì)數(shù)室室內(nèi)。。(5)計(jì)數(shù)時(shí)時(shí)，如如果使使用16格×25格規(guī)格格的計(jì)計(jì)數(shù)室室，要要按對對角線線位，，取左左上、、右上上、左左下、、右下下4個(gè)中格格（即即100個(gè)小格格）的的酵母母菌數(shù)數(shù)。如如果規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)數(shù)板，除了取取其4個(gè)對角方方位外，，還需再數(shù)中央央的一個(gè)個(gè)中格(即80個(gè)小方格格)的酵母菌菌數(shù)。4.血球球計(jì)數(shù)板板的清潔潔血球汁數(shù)數(shù)板使用用后，用用自來水水沖洗，，切勿用用硬物洗洗刷，洗洗后自行行晾干或或用吹風(fēng)風(fēng)機(jī)吹干干，或用用95％的乙醇醇、無水水乙醇、、丙酮等等有機(jī)溶溶劑脫水水使其干干燥。通通過鏡檢檢觀察每每小格內(nèi)內(nèi)是否殘殘留菌體體或其他他沉淀物物。若不不干凈，，則必須須重復(fù)清清洗直到到干凈為為止。1．結(jié)果果列表比較較大腸桿桿菌、枯枯草芽孢孢桿菌和和未知菌菌的染色色反應(yīng)，，并判斷斷它們分分別是G-或G+.2．思考考題（1）作作革蘭氏氏染色涂涂片為什什么不能能過于濃濃厚？其其染色成成敗的關(guān)關(guān)鍵一步步是什