線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書-微量法UPLC-MS-4592

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途！-上海液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有限公司第第頁(yè)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ貨號(hào)：UPLC-MS-4592規(guī)格：100T/48S

微量法產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體50mL×1瓶4℃保存試劑一液體50mL×1瓶4℃保存試劑二粉劑×1支-20℃保存試劑三液體6mL×1瓶4℃保存試劑四粉劑×1瓶4℃保存試劑五粉劑×1瓶4℃保存試劑六粉劑×1瓶4℃保存試劑七液體8mL×1瓶常溫保存標(biāo)準(zhǔn)品液體1mL×1支4℃保存溶液配制：1.11mL雙蒸水，充分溶解備用，分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；3mL雙蒸水，充分混勻；8mL雙蒸水，充分混勻；8mL雙蒸水，充分混勻；標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL400.25μmol/mL磷標(biāo)準(zhǔn)液。H2O：試劑五：試劑六：試劑七=2:1:1:1若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。注意：配試劑最好用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。產(chǎn)品說(shuō)明：線粒體復(fù)合體ⅤF1F0-ATPF1F0ATPATPⅤ存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體ⅤATP的關(guān)鍵酶。復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。需自備的儀器和用品：臺(tái)式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）0.1g5001.0mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4600g10min。將上清液移至另一離心管中，411000g15min。上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果。600μL（20%51012次活性測(cè)定，并且用于蛋白含量測(cè)定。二、測(cè)定步驟可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。樣本測(cè)定：酶促反應(yīng)試劑名稱（μL）對(duì)照管測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管試劑二1010--試劑三4040--樣本-50--混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴30min試劑四2020--樣本50--混勻，8000rpm，室溫離心10min，取上清液定磷上清液4040--標(biāo)準(zhǔn)溶液--40-蒸餾水40定磷試劑200200200200混勻，40℃10min660nmA對(duì)照管、A測(cè)定管、A標(biāo)準(zhǔn)管、AΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。三、復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算mg1nmol復(fù)合體Ⅴ活性（U/mgprot）=ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V酶促×1000÷（Cpr×V樣本）÷T=20×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷CprCmg/mL，需自行測(cè)定；V樣本：樣本體積，0.05mL；V酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.12mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。注意事項(xiàng)：1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過高（1，可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。（1g/mL(單獨(dú)測(cè)定)。測(cè)定胞漿時(shí)，定磷后反應(yīng)液可能會(huì)有絮凝產(chǎn)生，測(cè)定前混合均勻即可，并不影響測(cè)定結(jié)果。推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。100管反應(yīng)。附:使用樣本重量計(jì)算公式：（100T/24S）A、上清中復(fù)合體Ⅴ活力的計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。復(fù)合體Ⅴ活性（U/g質(zhì)量）=ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V酶促×1000÷(W÷V提取×V樣本)）÷T=20×ΔA1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W1μmol=1000nmol；V30minB、沉淀中復(fù)合體Ⅴ活力的計(jì)算：g1nmol無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。復(fù)合體Ⅴ活性（U/g質(zhì)量）=ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V酶促×1000÷(W÷V提取×V樣本=12×ΔA2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W1μmol=1000nmol；V0.05mL；V30min