果蔬中還原糖含量的測定

果蔬中還原糖含量的測定果蔬中可溶性糖可分為還原糖（包括各種單糖和麥芽糖）和非還原糖（主要是蔗糖）。還原糖具有醛基和酮基，主要來源于多糖類物質(zhì)和其它一些大分子的降解產(chǎn)物。同時，這些還原糖還能為淀粉、纖維素、果膠質(zhì)等大分子碳水化他合物和核苷酸等多種物質(zhì)的合成提供糖基供體，與果蔬的生理生化代謝密切相關(guān)。在測定果蔬組織中的多種碳水化合物如總糖、淀粉、纖維素，多種酶如淀粉酶、纖維素酶、果膠酶和葡聚糖酶、糖苷酶時，都需要通過測定還原糖含量的方法測定這些物質(zhì)含量或酶的活性。因此，還原糖含量測定方法在研究果蔬生理生化代謝中具有重要意義。常用的測定果蔬中還原糖的化學(xué)方法有3,5-二硝基水楊酸法、斐林氏法、碘量法、高錳酸鉀法、鐵氰化鉀法等。I．3,5-二硝基水楊酸法一、目的要求熟練掌握3,5-二硝基水楊酸法測定果蔬組織中還原糖的原理和方法。二、基本原理3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸化合物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和棕紅色的顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系。因此，可在540nm波長下通過測定棕紅色物質(zhì)的吸光度值計算樣品中還原糖的含量。三、材料、儀器及試劑（一）材料各種果蔬組織。（二）儀器設(shè)備電子天平、分光光度計、刻度試管（25mL）、漏斗、濾紙、研缽、燒杯（1000mL、100mL）、三角瓶、容量瓶（1000mL、100mL）、刻度吸管（或移液器）、水浴鍋。（三）試劑1．1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆谩?．3,5-二硝基水楊酸試劑（DNP）（1）配制500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液；（2）配制262mL的2mol/LNaOH溶液；（3）稱取6.3g的3,5-二硝基水楊酸；（4）稱取5.0g結(jié)晶酚；（5）稱取5.0g亞硫酸鈉；（6）將（2）、（3）、（4）、（5）各成分加入到（1）中，攪拌，使之溶解。待冷卻后，轉(zhuǎn)入到1000mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，貯于棕色瓶中備用。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支具塞刻度試管，編號，按表6所示的量，精確加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑。表6.3,5-二硝基水楊酸法測定還原性糖繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量項(xiàng)目管號0123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/mL00.20.40.60.81.01.2蒸餾水/mL2.01.81.61.41.21.00.83,5-二硝基水楊酸試劑/mL1.51.51.51.51.51.51.5相當(dāng)于葡萄糖量/mg00.20.40.60.81.01.2將各管搖勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25mL刻度處，混勻。在540nm波長下，用0號管做為參比調(diào)零，測定顯色液的吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。（二）還原糖的提取準(zhǔn)確稱取1.0g果實(shí)組織置于研缽中，加入少量蒸餾水，研磨勻漿后轉(zhuǎn)入到刻度試管中，沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入到試管中，補(bǔ)加蒸餾水至25mL刻度處，在80℃恒溫水浴中保溫30min，使還原糖浸出。取出冷卻后，過濾浸提液，用20mL蒸餾水洗滌殘渣，再過濾。將兩次濾液全部收集在100mL的容量瓶中，定容至刻度，混勻，作為還原糖提取液備用。（三）顯色和比色取25mL刻度試管，分別加入2.0mL還原糖提取液和1.5mL3,5-二硝基水楊酸試劑，按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法操作，測定各管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。如果吸光度值讀數(shù)過高，就要對提取液進(jìn)行稀釋后測定。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液總體積V(mL)吸取樣品液體積Vs(mL)稀釋倍數(shù)N540nm吸光度值由標(biāo)曲查得的糖量C(mg)樣品中還原糖含量(%)計算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差1232．計算結(jié)果根據(jù)顯色液吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計算果蔬組織中還原糖含量，以百分含量表示。計算公式：式中：C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖毫克數(shù)，mg；V——樣品提取液總體積，mL；N——樣品提取液稀釋倍數(shù)；Vs——測定時所取樣品提取液體積，mL；W——樣品重量，g。六、注意事項(xiàng)1．配制3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS）溶液時，將含DNS的NaOH溶液加到含酒石酸鉀鈉的熱水溶液中時，一定要慢慢倒入，邊倒邊攪拌，以防被燙傷。2．測定波長問題。在還原糖提取液中，帶還原性基團(tuán)（醛基）的糖多種多樣（如葡萄糖、麥芽糖、半乳糖醛酸等都帶有還原性基團(tuán)），在利用3,5-二硝基水楊酸法測定時形成的呈色化合物最大吸收峰可能會發(fā)生不同程度的變化。一般波長變化范圍為500~540nm。在具體測定時，可在波長500、510、520和540nm等處進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，了解最大吸收峰所在的波長，以便獲得較好實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2．標(biāo)準(zhǔn)曲線問題。一般用葡萄糖作為還原糖進(jìn)行計算各種還原糖的含量，在具體測定某種還原糖時，可以利用該還原糖制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。II．斐林試劑滴定法一、目的要求了解斐林試劑滴定法測定果蔬組織中還原糖含量的原理和方法。二、基本原理還原糖具有醛基和酮基，在堿性溶液中煮沸，能把斐林試劑中的Cu2+還原成Cu+，使藍(lán)色的斐林試劑脫色。將一定量的斐林試劑A、B液等量混合，立即生成天藍(lán)色的氫氧化銅沉淀，這種沉淀很快又與酒石酸鉀鈉反應(yīng)，生成深藍(lán)色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物。在加熱條件下，以次甲基藍(lán)作為指示劑，用樣品提取液滴定，樣品提取液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應(yīng)，生成紅色的氧化亞銅沉淀，待Cu2+全部被還原后，稍過量的還原糖可將次甲基藍(lán)（亞甲基藍(lán)）還原，溶液由藍(lán)色變?yōu)闊o色，即為滴定終點(diǎn)，記錄樣品提取液的消耗量。這樣，根據(jù)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出還原糖含量。三、材料、儀器及試劑（一）材料各種果蔬組織。（二）儀器及用具電子天平、漏斗、濾紙、研缽、燒杯（1000mL、100mL）、三角瓶（250mL）、容量瓶（1000mL、100mL）、滴定管、鐵架臺、刻度吸管（或移液器）、電爐、石棉網(wǎng)、水浴鍋。（三）試劑1．斐林試劑斐林試劑A液：稱取40.0gCuSO4?5H2O，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。放置1天，過濾，貯于棕色瓶中。斐林試劑B液：稱取200.0g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O?5H2O）與150.0gNaOH溶于蒸餾水中，并定容至1000mL，放置1天，用石棉墊抽濾，儲存于帶橡膠塞的玻璃瓶中。A、B兩液分別存貯，使用前等體積混合。2．1%次甲基藍(lán)。3．1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆?。四、?shí)驗(yàn)步驟（一）斐林試劑溶液的標(biāo)定分別準(zhǔn)確吸取5.0mL斐林試劑A液和B液，置于250mL三角瓶中，加10mL蒸餾水，2滴1%次甲基藍(lán)指示劑，3粒玻璃珠。再從滴定管滴加約9mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加熱使其在2min內(nèi)沸騰，并準(zhǔn)確沸騰30s。然后趁熱以每2秒一滴的速度滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的總體積。重復(fù)三次，取平均值，計算每毫升斐林試劑溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量，以mg/mL表示。式中：A——1mL斐林試劑溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量，mg/mL；B——斐林試劑溶液總體積，mL；C——葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/mL；V——標(biāo)定時消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，mL。（二）提取準(zhǔn)確稱取1.0g果實(shí)組織置于研缽中，加入少量蒸餾水，研磨勻漿后轉(zhuǎn)入到刻度試管中，沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入到試管中，補(bǔ)加蒸餾水至25mL刻度處。將試管置于80℃恒溫水浴中保溫30min，其間搖動數(shù)次，使還原糖浸出。取出后冷卻、過濾浸提液，用20mL蒸餾水洗滌殘渣，再過濾。將兩次濾液全部收集在100mL的容量瓶中，定容至刻度，混勻，作為還原糖提取液備用。（三）預(yù)測分別準(zhǔn)確吸取5.0mL斐林試劑A液和B液，置于250mL三角瓶中，加10mL蒸餾水，2滴1%次甲基藍(lán)指示劑，3粒玻璃珠。加熱使其在2min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s，趁沸以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品提取液，須始終保持溶液的沸騰狀態(tài)，待溶液藍(lán)色變淺時，趁熱以每2秒一滴的速度滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗提取液的體積。（四）測定按照預(yù)測的方法，從滴定管加入比預(yù)測時樣品提取溶液消耗總體積少1mL的樣品提取液，使其在2min內(nèi)加熱至沸，準(zhǔn)確沸騰30s，再趁熱以每2秒一滴的速度繼續(xù)滴定，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗樣品提取液的體積。重復(fù)操作3次，取平均值。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液總體積V(mL)樣品液消耗量Vs(mL)斐林試劑溶液體積VF(mL)斐林試劑標(biāo)定濃度A(mg/mL)樣品中還原糖含量(%)計算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差1232．計算結(jié)果根據(jù)樣品液消耗量，按下式計算果蔬組織中還原糖含量，以百分含量表示。計算公式：式中：A——斐林試劑溶液相當(dāng)于葡萄糖的含量，mg/mL；VF——測定時所取斐林試劑溶液的總體積，mL；V——樣品提取液總體積，mL；Vs——滴定時所消耗的樣品提取液的體積，mL；W——樣品重量，g。六、注意事項(xiàng)1．斐林試劑法的應(yīng)用及特點(diǎn)本方法又稱直接滴定法、快速測定法，它是在國際上常用的定量糖的方法藍(lán)-愛農(nóng)（Lane-Eynon）容量法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其特點(diǎn)是試劑用量少，操作和計算都比較簡便、快速，滴定終點(diǎn)明顯。適用于各類食品中還原糖的測定。這些還原糖包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖等，只是結(jié)果用葡萄糖或其他轉(zhuǎn)化糖的方式表示。在測定醬油、深色果汁等樣品時，因色素干擾，滴定終點(diǎn)常常模糊不清，影響準(zhǔn)確性。2．對于含有蛋白質(zhì)較多的樣品，在提取還原糖時，可緩慢加入5mL乙酸鋅溶液和5mL亞鐵氰化鉀溶液混合、靜置30min后過濾即可。乙酸鋅及亞鐵氰化鉀作為蛋白質(zhì)沉淀劑，這兩種試劑混合后形成白色的氰亞鐵酸鋅沉淀，能使溶液中的蛋白質(zhì)共同沉淀下來。乙酸鋅溶液：稱取21.9g乙酸鋅，加3mL冰醋酸，加蒸餾水溶解并稀釋至1000mL。亞鐵氰化鉀溶液：稱取106.0g，加蒸餾水溶解并稀釋至1000mL。注意：本方法是根據(jù)一定量堿性酒石酸銅溶液（Cu2+量一定）消耗的樣品液量來計算樣品液中還原糖含量，反應(yīng)體系中Cu2+的含量是定量的基礎(chǔ)，所以在樣品處理時，不能用銅鹽作為澄清劑，以免往樣品液中引入Cu2+，得到錯誤的結(jié)果。3．斐林試劑法所用的氧化劑堿性酒石酸銅的氧化能力較強(qiáng)，醛糖和酮糖都可被氧化，所以測得的是總還原糖量。利用此方法也可以測定蔗糖和總糖含量。4．滴定必須在沸騰條件下進(jìn)行。一方面可以加快還原糖與堿性銅試劑的反應(yīng)速度；另一方面，由于次甲基藍(lán)變色反應(yīng)是可逆的，在常溫下，無色還原型次甲基藍(lán)受到空氣中氧作用時又會被氧化為氧化型而呈藍(lán)色；此外，氧化亞銅也極不穩(wěn)定，易被空氣中氧所氧化。保持反應(yīng)液沸騰可防止空氣進(jìn)入，避免次甲基藍(lán)和氧化亞銅被氧化而增加耗糖量。滴定時也不能隨意搖動錐形瓶，更不能把錐形瓶從熱源上取下來滴定，以防空氣進(jìn)入反應(yīng)液中。5．次甲基藍(lán)也是一種氧化劑，但在測定條件下氧化能力比Cu2+弱，故還原糖先Cu2+與反應(yīng)，Cu2+完全反應(yīng)后，稍過量的還原糖才與次甲基藍(lán)指示劑反應(yīng)，使之由藍(lán)色變?yōu)闊o色，指示到達(dá)終點(diǎn)。6．為消除氧化亞銅沉淀對滴定終點(diǎn)觀察的干擾，在斐林試劑B液中加入少量亞鐵氰化鉀（4g/L），使之與Cu2O生成可溶性的無色絡(luò)合物，而不再析出紅色沉淀。7．本法對樣品溶液中還原糖濃度有一定要求（0.1%左右），測定時樣品溶液的消耗體積應(yīng)與標(biāo)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液時消耗的體積相近。因此，通過樣品溶液的預(yù)測，可以調(diào)整樣品也的稀釋程度，使預(yù)測時樣品液消耗量在10mL左右。通過預(yù)測還可知道樣品液的大概消耗量，以便在正式測定時，預(yù)先加入比實(shí)際用量少1mL左右的樣品液，只留下1mL左右樣品液在后續(xù)滴定時加入，以保證在1min內(nèi)完成后續(xù)滴定工作，提高測定的準(zhǔn)確度。此外，影響測定結(jié)果的操作因素還有反應(yīng)液堿度、熱源強(qiáng)度、煮沸時間和滴定速度等。8．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1moL葡萄糖只能還原5moL多一點(diǎn)的堿性銅試劑，且隨反應(yīng)條件而變化。分別用葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定等量已標(biāo)定的費(fèi)林氏液，所消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積有所不同。因此，不能根據(jù)反應(yīng)式來直接計算還原糖含量，而需用溶液標(biāo)定的方法進(jìn)行計算。III．斐林試劑比色法一、目的要求了解斐林試劑比色法測定果蔬組織中還原糖含量的原理和方法。二、基本原理還原糖具有醛基和酮基，在堿性溶液中煮沸，能把斐林試劑中的Cu2+還原成Cu+，使藍(lán)色的斐林試劑脫色，脫色的程度與溶液中含糖量成正比，在590nm波長下比色測定吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計算出所測樣品中還原糖的含量。本方法也可用于蔗糖及總糖含量的測定。三、材料、儀器及試劑（一）材料各種果蔬組織。（二）儀器及用具電子天平、分光光度計、離心機(jī)、刻度試管（25mL）、漏斗、濾紙、研缽、燒杯（1000mL、100mL）、三角瓶、容量瓶（1000mL、100mL）、刻度吸管（或移液器）、水浴鍋。（三）試劑1．斐林試劑斐林試劑A液：稱取40gCuSO4?5H2O溶解于蒸餾水中，定容至1000mL。放置1天，過濾，貯于棕色瓶中。斐林試劑B液：稱取200g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O?5H2O）與150gNaOH溶于蒸餾水中，定容至1000mL。放置1天，用石棉墊抽濾。A、B兩液分別存貯，使用前等體積混合。2．0.1mmoL/LNaOH。3．10%醋酸鉛溶液。4．飽和Na2SO4溶液。5．甲基紅指示劑：稱取0.1g甲基紅溶于250mL60%乙醇中。6．1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆?。四、?shí)驗(yàn)步驟（一）制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表7.斐林試劑比色法測定還原性糖繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量項(xiàng)目管號0123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液/mL01.02.03.04.05.06.0蒸餾水/mL6.05.04.03.02.01.00斐林試劑/mL4.04.04.04.04.04.04.0相當(dāng)于葡萄糖量/mg01.02.03.04.05.06.0取7支具塞刻度試管，編號，按表7所示的量，精確加入1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和斐林試劑。將各管搖勻，加塞后在沸水浴中加熱15min，取出后立即用自來水冷卻至室溫，于4000rpm離心10min。取上清液，用0號管溶液調(diào)零，在590nm波長下，分別測定其它試管溶液的吸光度值。以吸光度為縱坐