酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件

61、輟學(xué)如磨刀之石，不見其損，日有所虧。62、奇文共欣贊，疑義相與析。63、曖曖遠(yuǎn)人村，依依墟里煙，狗吠深巷中，雞鳴桑樹顛。64、一生復(fù)能幾，倏如流電驚。65、少無適俗韻，性本愛丘山。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)61、輟學(xué)如磨刀之石，不見其損，日有所虧。62、奇文共欣贊，疑義相與析。63、曖曖遠(yuǎn)人村，依依墟里煙，狗吠深巷中，雞鳴桑樹顛。64、一生復(fù)能幾，倏如流電驚。65、少無適俗韻，性本愛丘山。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)3/30/20212一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)二、ELISA試驗(yàn)的原理三、ELISA試驗(yàn)的特點(diǎn)四、操作要領(lǐng)概要3/30/2021361、輟學(xué)如磨刀之石，不見其損，日有所虧。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)（一）抗原（二）抗體（三）抗原抗體反應(yīng)

12/15/20226一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)（一）抗原12/14/20226（一）抗原(AntigenAg)抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？纱碳C(jī)體產(chǎn)生體液免疫（抗體）和引起細(xì)胞免疫（細(xì)胞因子）。能在機(jī)體中產(chǎn)生抗體的抗原多為分子量大于5000D的蛋白質(zhì)，例如禽流感、新城疫、豬瘟、口蹄疫等病毒。

12/15/20227（一）抗原(AntigenAg)12/14/20227（二）抗體（AntibodyAb）

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。抗體的產(chǎn)生機(jī)體受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,含有抗體的血清稱為抗血清（antiserum）。

12/15/20228（二）抗體（AntibodyAb）12/14/2022（三）抗原抗體反應(yīng)1、特異性結(jié)合并可逆抗原與抗體結(jié)構(gòu)可以形成特異性的抗原抗體復(fù)合物，此過程是可逆的。2、最適比例：前帶和后帶現(xiàn)象3、敏感性12/15/20229（三）抗原抗體反應(yīng)12/14/20229二、ELISA試驗(yàn)的原理

（一）ELISA的基本原理（二）ELISA的類型12/15/202210二、ELISA試驗(yàn)的原理（一）ELISA的基本原理12/ESP樣品稀釋包被（抗原或抗體）酶標(biāo)復(fù)合物底物現(xiàn)色ELISA(間接)的操作步驟12/15/202211ESP樣品稀釋包被（抗原或抗體）酶標(biāo)復(fù)合物底物現(xiàn)色ELISA1、間接法測抗體2、雙抗原夾心法測抗體3、雙抗體夾心法測抗原4、競爭法測抗體5、競爭法測抗原6、捕獲包被法測IgM抗體

7、液相阻斷ELISA法（FMD）12/15/2022121、間接法測抗體12/14/202212三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特點(diǎn)

（一）靈敏度高（二）特異性強(qiáng)（三）簡便、快速（四）重復(fù)性好（五）自動(dòng)化程度高，適合大批量標(biāo)準(zhǔn)化檢測（六）安全

12/15/202213三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特點(diǎn)（一）靈敏度高12/14/20四、ELISA的操作要領(lǐng)

（一）標(biāo)本的采集和保存（二）試劑的準(zhǔn)備（三）加樣（四）保溫孵育（五）洗滌（六）顯色和比色

12/15/202214四、ELISA的操作要領(lǐng)（一）標(biāo)本的采集和保存12/14其他1、酶標(biāo)比色儀2、洗板機(jī)12/15/202215其他1、酶標(biāo)比色儀12/14/202215嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

嚴(yán)禁吸煙、吃東西和嬉戲打鬧！

移液器是精密儀器，請小心使用。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)12/15/202216嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

嚴(yán)禁吸煙、吃東西試劑盒組成1.已包被抗原的ELISA板兩塊（每個(gè)組用一塊板）2.洗滌液（25×）30mL3.陰性對照血清0.05mL4.陽性對照血清0.05mL5.血清稀釋液30mL6.酶標(biāo)記IgG(100×)0.1mL7.底物溶液A1mL8.底物溶液B 膠囊（2） 9.終止液 12mL12/15/202217試劑盒組成1.已包被抗原的ELISA板兩塊（每個(gè)組用一塊板）1：20倍血清樣品稀釋方法：先取樣品稀釋液47.5ul加到酶標(biāo)孔中。然后取2.5ul待檢血清，加入樣品孔中混勻。12/15/2022181：20倍血清樣品稀釋方法：先取樣品稀釋液47.5ul加到酶操作步驟：（1）加入血清樣品：用血清稀釋液對陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清做1：20稀釋，每孔加入50μL，陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清各做兩孔；同時(shí)設(shè)兩孔不加任何血清樣品的空白對照孔。密封，37℃結(jié)合45分鐘。（注意：此時(shí)的槍頭不應(yīng)重復(fù)使用，否則將造成交叉污染）。（2）洗板：棄去孔內(nèi)液體，然后將25×洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1×工作液，每孔加入220-300μL洗板，重復(fù)4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。（3）加入酶標(biāo)二抗：濃縮酶標(biāo)記抗體用血清稀釋液做1：100稀釋，每孔加入50μL，密封，37℃結(jié)合45分鐘。（注意：從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間）。（4）重復(fù)步驟（2）洗板。（5）加入底物：將底物A和B做1：50體積混勻，每孔加入50μL，輕輕震蕩混勻，密封，37℃或避光作用15分鐘。加樣的順序應(yīng)同步驟（3）保持一致，從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間。（6）終止反應(yīng)：每孔加入50μL終止液，輕搖混勻，測定吸光度OD450nm。12/15/202219操作步驟：（1）加入血清樣品：用血清稀釋液對陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血結(jié)果判定陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清各測兩孔，需計(jì)算平均吸光度值。實(shí)驗(yàn)成立的條件：陽性標(biāo)準(zhǔn)血清OD值/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD值>2.1時(shí)試驗(yàn)成立。計(jì)算公式：比值=（血清樣品OD450值/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD450）+0.068比值≥2.1血清樣品為陽性；比值＜2.1血清樣品為陰性。比值≥3.0免疫合格。（注：免疫合格—指血清中總的抗豬瘟病毒抗體水平達(dá)到免疫的要求，包括感染抗體和免疫抗體）12/15/202220結(jié)果判定陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清各測兩孔，需計(jì)算平均吸光度值。12注意事項(xiàng)！??！

除洗滌緩沖液，其他試劑盒酶標(biāo)板應(yīng)取出在4℃條件下，使用前平衡至室溫。特別提醒?。?！底物溶液A在低溫下呈固態(tài)，所以實(shí)驗(yàn)一開始可將其放置在室溫。凍存的血清樣品，最好先在4℃環(huán)境中使其融化，如果需要測量不同的指標(biāo)，應(yīng)該避免反復(fù)凍融樣品，待測樣品出現(xiàn)溶血的情況時(shí)，可高速離心后再進(jìn)行試驗(yàn)，不影響結(jié)果。實(shí)驗(yàn)操作過程中，不要吸煙吃東西和交談。洗滌緩沖液和酶標(biāo)抗體現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，否則工作濃度的緩沖液4℃只能保存一周，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能受到影響。底物B膠囊,使用前每個(gè)加入100ml雙蒸水中溶解即可使用，放于4℃保存，存期較短，盡快使用！12/15/202221注意事項(xiàng)?。?！除洗滌緩沖液，其他試劑盒酶標(biāo)板應(yīng)取出在4℃條12/15/20222212/14/202222Thankyou!12/15/202223Thankyou!12/14/20222351、天下之事常成于困約，而敗于奢靡?！懹?/p>

52、生命不等于是呼吸，生命是活動(dòng)。——盧梭

53、偉大的事業(yè)，需要決心，能力，組織和責(zé)任感?！撞飞?/p>

54、唯書籍不朽。——喬特

55、為中華之崛起而讀書。——周恩來謝謝！51、天下之事常成于困約，而敗于奢靡?！懹?/p>

52、61、輟學(xué)如磨刀之石，不見其損，日有所虧。62、奇文共欣贊，疑義相與析。63、曖曖遠(yuǎn)人村，依依墟里煙，狗吠深巷中，雞鳴桑樹顛。64、一生復(fù)能幾，倏如流電驚。65、少無適俗韻，性本愛丘山。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)61、輟學(xué)如磨刀之石，不見其損，日有所虧。62、奇文共欣贊，疑義相與析。63、曖曖遠(yuǎn)人村，依依墟里煙，狗吠深巷中，雞鳴桑樹顛。64、一生復(fù)能幾，倏如流電驚。65、少無適俗韻，性本愛丘山。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)3/30/20212一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)二、ELISA試驗(yàn)的原理三、ELISA試驗(yàn)的特點(diǎn)四、操作要領(lǐng)概要3/30/2021361、輟學(xué)如磨刀之石，不見其損，日有所虧。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)（一）抗原（二）抗體（三）抗原抗體反應(yīng)

12/15/202230一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)（一）抗原12/14/20226（一）抗原(AntigenAg)抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？纱碳C(jī)體產(chǎn)生體液免疫（抗體）和引起細(xì)胞免疫（細(xì)胞因子）。能在機(jī)體中產(chǎn)生抗體的抗原多為分子量大于5000D的蛋白質(zhì)，例如禽流感、新城疫、豬瘟、口蹄疫等病毒。

12/15/202231（一）抗原(AntigenAg)12/14/20227（二）抗體（AntibodyAb）

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM?？贵w的產(chǎn)生機(jī)體受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,含有抗體的血清稱為抗血清（antiserum）。

12/15/202232（二）抗體（AntibodyAb）12/14/2022（三）抗原抗體反應(yīng)1、特異性結(jié)合并可逆抗原與抗體結(jié)構(gòu)可以形成特異性的抗原抗體復(fù)合物，此過程是可逆的。2、最適比例：前帶和后帶現(xiàn)象3、敏感性12/15/202233（三）抗原抗體反應(yīng)12/14/20229二、ELISA試驗(yàn)的原理

（一）ELISA的基本原理（二）ELISA的類型12/15/202234二、ELISA試驗(yàn)的原理（一）ELISA的基本原理12/ESP樣品稀釋包被（抗原或抗體）酶標(biāo)復(fù)合物底物現(xiàn)色ELISA(間接)的操作步驟12/15/202235ESP樣品稀釋包被（抗原或抗體）酶標(biāo)復(fù)合物底物現(xiàn)色ELISA1、間接法測抗體2、雙抗原夾心法測抗體3、雙抗體夾心法測抗原4、競爭法測抗體5、競爭法測抗原6、捕獲包被法測IgM抗體

7、液相阻斷ELISA法（FMD）12/15/2022361、間接法測抗體12/14/202212三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特點(diǎn)

（一）靈敏度高（二）特異性強(qiáng)（三）簡便、快速（四）重復(fù)性好（五）自動(dòng)化程度高，適合大批量標(biāo)準(zhǔn)化檢測（六）安全

12/15/202237三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特點(diǎn)（一）靈敏度高12/14/20四、ELISA的操作要領(lǐng)

（一）標(biāo)本的采集和保存（二）試劑的準(zhǔn)備（三）加樣（四）保溫孵育（五）洗滌（六）顯色和比色

12/15/202238四、ELISA的操作要領(lǐng)（一）標(biāo)本的采集和保存12/14其他1、酶標(biāo)比色儀2、洗板機(jī)12/15/202239其他1、酶標(biāo)比色儀12/14/202215嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

嚴(yán)禁吸煙、吃東西和嬉戲打鬧！

移液器是精密儀器，請小心使用。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)12/15/202240嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

嚴(yán)禁吸煙、吃東西試劑盒組成1.已包被抗原的ELISA板兩塊（每個(gè)組用一塊板）2.洗滌液（25×）30mL3.陰性對照血清0.05mL4.陽性對照血清0.05mL5.血清稀釋液30mL6.酶標(biāo)記IgG(100×)0.1mL7.底物溶液A1mL8.底物溶液B 膠囊（2） 9.終止液 12mL12/15/202241試劑盒組成1.已包被抗原的ELISA板兩塊（每個(gè)組用一塊板）1：20倍血清樣品稀釋方法：先取樣品稀釋液47.5ul加到酶標(biāo)孔中。然后取2.5ul待檢血清，加入樣品孔中混勻。12/15/2022421：20倍血清樣品稀釋方法：先取樣品稀釋液47.5ul加到酶操作步驟：（1）加入血清樣品：用血清稀釋液對陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清做1：20稀釋，每孔加入50μL，陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清各做兩孔；同時(shí)設(shè)兩孔不加任何血清樣品的空白對照孔。密封，37℃結(jié)合45分鐘。（注意：此時(shí)的槍頭不應(yīng)重復(fù)使用，否則將造成交叉污染）。（2）洗板：棄去孔內(nèi)液體，然后將25×洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1×工作液，每孔加入220-300μL洗板，重復(fù)4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。（3）加入酶標(biāo)二抗：濃縮酶標(biāo)記抗體用血清稀釋液做1：100稀釋，每孔加入50μL，密封，37℃結(jié)合45分鐘。（注意：從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間）。（4）重復(fù)步驟（2）洗板。（5）加入底物：將底物A和B做1：50體積混勻，每孔加入50μL，輕輕震蕩混勻，密封，37℃或避光作用15分鐘。加樣的順序應(yīng)同步驟（3）保持一致，從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間。（6）終止反應(yīng)：每孔加入50μL終止液，輕搖混勻，測定吸光度OD450nm。12/15/202243操作步驟：（1）加入血清樣品：用血清稀釋液對陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血結(jié)果判定陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清各測兩孔，需計(jì)算平均吸光度值。實(shí)驗(yàn)成立的條件：陽性標(biāo)準(zhǔn)血清OD值/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD值>2.1時(shí)試驗(yàn)成立。計(jì)算公式：比值=（血清樣品OD450值/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清OD450）+0.068比值≥2.1血清樣品為陽性；比值＜2.1血清樣品為陰性。比值