皮膚儲存新技術(shù)及臨床應(yīng)用課件

皮膚儲存新技術(shù)及臨床應(yīng)用課件1皮膚儲存新技術(shù)及臨床應(yīng)用課件2前言

據(jù)統(tǒng)計，目前世界每年大約有100萬人因各種原因而燒（燙）傷。尤其大面積深度燒傷病人，治療是一個漫長而復雜的過程。通常需要通過異體（種）皮片移植來覆蓋創(chuàng)面，而皮源的缺乏往往成為治療的關(guān)鍵問題之一前言據(jù)統(tǒng)計，目前世界每年大約有1003皮庫的意義

54年前英國人Pickerill寫下了這樣一段話：“毫無爭議，創(chuàng)傷整復手術(shù)成功的關(guān)鍵之一是有可供給的皮源覆蓋因創(chuàng)傷帶來的大面積皮膚缺損。實際上在某種情況下，對皮源需要超越一切。因此這啟示我們應(yīng)該注重皮膚的儲存與臨床應(yīng)用。”皮庫的意義54年前英國人Pickerill寫下了4我院皮庫簡介：自1973年創(chuàng)建皮庫以來，分別運用了4℃、-20℃和-80℃低溫冰箱皮膚保存法以及液氮儲皮方法1987年開始速凍玻璃化儲皮方法儲存的實驗研究和臨床應(yīng)用

我院皮庫簡介：自1973年創(chuàng)建皮庫以來，分別運用了4℃、-25我院皮庫簡介：每年異體尸體皮采集及儲存40余具深低溫速凍異體皮保存方法的改進使保存皮片活力穩(wěn)定保持在70%以上，皮片移植成活率達95%以上成為亞洲最大的皮庫之一，已儲存了3000余具活力良好的尸體皮，供全國30個省市300多家醫(yī)院使用每年創(chuàng)利潤數(shù)百萬元，經(jīng)濟效益顯著我院皮庫簡介：每年異體尸體皮采集及儲存40余具6我院皮庫簡介：科研方面曾獲國家自然科學基金，首都醫(yī)學科技發(fā)展基金，八五、九五、十五、十一五全軍科研基金20余項；出版相關(guān)專著10余部，發(fā)表學術(shù)論著100余篇；培養(yǎng)進修生、研究生數(shù)百人獲國家科技進步二等獎1項，軍隊科技進步二等獎6項我院皮庫簡介：科研方面曾獲國家自然科學基金，首都醫(yī)學科技發(fā)展7皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新鮮異體皮長*與新鮮皮片組相比，P<0.未見異體皮發(fā)黑，變干，脫落而創(chuàng)面愈合原理:利用活組織或細胞中的線粒體琥珀酸四氮新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白1主要分布于顆粒細胞層，－20℃組，4℃組陽性反應(yīng)明顯減弱。0150.移植皮片3-4天轉(zhuǎn)紅，1-2周異體皮色澤近似正常皮膚，此后呈斑點狀或斑片狀發(fā)黑區(qū)即為成活的自體微粒皮。皮膚β1整合素及相關(guān)蛋白冷卻的銅板預冷皮膚后即將其直接浸入液氮4℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360皮膚細胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫損傷的關(guān)鍵位點異種皮以豬皮多見。0190.-196℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×360保存時間(d)3-74512個月理論無限期D/K組呈簇狀不均勻分布，空隙增大，解聚斷裂；目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響（平均積分光密度,X±SD，n=6）目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法第一部分皮膚的低溫儲存皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新鮮異體皮長第一部分皮8

皮膚儲存的基礎(chǔ)知識皮膚的結(jié)構(gòu)皮膚的功能皮膚低溫儲存的重要意義皮膚低溫儲存的理論依據(jù)皮膚的低溫損傷機制皮膚儲存的基礎(chǔ)知識皮膚的結(jié)構(gòu)9皮膚的結(jié)構(gòu)

皮膚從外到內(nèi)，由表皮、真皮和皮下組織三部分組成皮膚附件作為特化的表皮結(jié)構(gòu)也屬于皮膚的重要結(jié)構(gòu)，其中包括汗腺、皮脂腺、毛發(fā)、指甲皮膚的結(jié)構(gòu)皮膚從外到內(nèi)，由表皮、真皮和皮下組織三部分10皮膚的結(jié)構(gòu)

表皮

從上到下又分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層、基底層

真皮

分為乳頭層、網(wǎng)狀層。主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。此外皮膚附件，血管、淋巴管、神經(jīng)末梢皮膚的結(jié)構(gòu)表皮從上到下又分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層11皮膚的主要功能：保護作用感覺作用體溫調(diào)節(jié)作用分泌和排泄作用吸收作用皮膚的主要功能：保護作用12水分電解質(zhì)皮膚缺失熱量蛋白質(zhì)病原體

貧血低蛋白血癥創(chuàng)面膿毒癥MODS死亡水分電解質(zhì)皮膚缺失熱量蛋白質(zhì)病原體貧血低蛋白血癥13大面積燒傷病人創(chuàng)面焦痂的存在引起：

體液的丟失有害介質(zhì)釋放侵襲性感染的滋生地機體超高代謝多器官功能衰竭及并發(fā)癥大面積燒傷病人創(chuàng)面焦痂的存在引起：體液的丟失14皮膚儲存的必要性：當大面積燒傷或皮膚缺損超過體表面積的30%時，自體供皮受限臨床實踐證明：具有活力的異體皮仍是目前最為理想的創(chuàng)面覆蓋物異體皮來源時間受限皮膚儲存的必要性：當大面積燒傷或皮膚缺損超過體表面積的30%15皮片的來源及種類自體皮

燒傷治療中最為常用的皮片，其來源受到供皮區(qū)的限制異種皮以豬皮多見。取材方便，但移植后排斥時間短，有時難以達到覆蓋創(chuàng)面的目的同種異體皮主要來源于成人新鮮尸體，其次為新鮮死嬰皮

皮片的來源及種類自體皮燒傷治療中最為常用的皮片，其16皮膚的低溫儲存

皮膚的低溫儲存17低溫儲存理論依據(jù)

理論上，儲存溫度越低，儲存物活力保持的時間越長，細胞組織代謝越低，污染的細菌也不易繁殖低溫儲存理論依據(jù)理論上，儲存溫度越低，儲存物活力保持的18異體皮來源受到極大的限制；通常需要通過異體（種）皮片移植來覆蓋創(chuàng)面，而皮源的缺乏往往成為治療的關(guān)鍵問題之一0150.環(huán)而顯色2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗滌。方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗滌。皮膚細胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫損傷的關(guān)鍵位點-80℃儲存皮膚FN免疫組化染色×3604℃組橋粒出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模與新鮮組皮膚比較，*P<0.-80℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×360（平均積分光密度,X±SD，n=10）皮膚低溫儲存的理論依據(jù)右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀環(huán);左側(cè)為液氮儲存48h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮?。ㄆ骄e分光密度,X±SD，n=10）新鮮皮膚LN免疫組化染色×360培養(yǎng)進修生、研究生數(shù)百人兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響E-cadherin免疫組化染色結(jié)果保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力表１

皮膚儲存方法比較項目4℃-20℃-80℃-196℃

費用少少較貴貴（補液氮）

保存時間(d)3-74512個月理論無限期最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70異體皮來源受到極大的限制；表１皮膚儲存方法比較項目19低溫損傷機制：

低溫保存關(guān)鍵在于解決低溫損傷對生物組織的影響。經(jīng)典的低溫生物學認為在低溫條件下，細胞主要受到來自兩種因素的損傷即溶質(zhì)性損傷和胞內(nèi)冰損傷，即“兩因素”學說低溫損傷機制：低溫保存關(guān)鍵在于解決低溫損傷對生物組20“兩因素”學說胞內(nèi)冰晶損傷

胞內(nèi)生成冰晶，長大到一定程度，引起細胞壁及細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化，甚至導致細胞死亡，是降溫速率較快時引起損傷的主要原因溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷）

細胞外水分結(jié)冰，導致細胞內(nèi)外溶液濃度的升高并持續(xù)較長的時間。由高滲引起細胞的損傷，是降溫速率較慢時引起損傷的主要原因“兩因素”學說胞內(nèi)冰晶損傷21“兩因素”學說“兩因素”學說22皮膚結(jié)構(gòu)與儲存的關(guān)系

皮膚不是單細胞成分，而是由表皮和真皮構(gòu)成的復合組織，由于皮膚內(nèi)的各種主要細胞成分的結(jié)構(gòu)與功能的復雜性，各種細胞代謝與營養(yǎng)條件不同,對環(huán)境改變的適應(yīng)性亦有所不同。因此皮膚的低溫損傷是一個更為非常復雜的過程皮膚結(jié)構(gòu)與儲存的關(guān)系皮膚不是單細胞成分，而是由表皮和23皮膚低溫損傷的其他因素

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，表皮細胞低溫損傷還與細胞骨架、細胞連接橋粒以及細胞間黏附的關(guān)系密切皮膚低溫損傷的其他因素近年來的研究發(fā)現(xiàn)，表皮細胞低溫24

低溫損傷的干預：玻璃化儲皮方法的發(fā)展抗凍液的使用

低溫損傷的干預：25玻璃化的基礎(chǔ)知識玻璃化的基礎(chǔ)知識26玻璃化的概念

玻璃化是一個物理學的概念，是指當水或溶液在極快降溫到或低于-100～-110℃的溫度范圍時，形成一種具有高黏度的界于液態(tài)和固態(tài)之間、非晶體態(tài)的、雜亂無章的、透明的玻璃狀態(tài)玻璃化的概念27玻璃化儲存的特點：

玻璃化儲存生物組織和細胞，由于降溫速率很快，水分沒有足夠的時間來形成冰晶，即進入均勻的玻璃狀態(tài)。這種玻璃態(tài)的物理性能與晶體態(tài)不同，是一種既可以避免或減輕冷凍過程組織的損傷，又是同時可長期保存組織的良好方法玻璃化儲存的特點：玻璃化儲存生物組織和細胞28皮膚低溫儲存的理論依據(jù)異體皮來源受到極大的限制；大張異體皮+微粒皮制備方法量基本與新鮮組相似4℃儲存皮膚LN免疫組化染色×360最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70皮膚低溫儲存的理論依據(jù)目前較為成熟抗凍液配方玻璃化速凍時冰晶的形態(tài)異體皮發(fā)黑變干脫落創(chuàng)面愈合新鮮皮膚LN免疫組化染色×360玻璃化對皮膚抗原性影響未見異體皮發(fā)黑，變干，脫落而創(chuàng)面愈合7天14天-196℃豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量明顯減少、樹突變短用于暫不適合自體皮的創(chuàng)面覆蓋以改善創(chuàng)基情況-196℃儲存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360新型抗凍劑海藻糖的發(fā)現(xiàn)，可進一步優(yōu)化低溫抗凍液配方近年來的研究發(fā)現(xiàn)，表皮細胞低溫損傷還與細胞骨架、細胞連接橋粒以及細胞間黏附的關(guān)系密切目前較為成熟抗凍液配方H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇），以此作為玻璃化儲存皮膚的抗凍液新鮮皮膚E-cadherin免疫組化染色×360總結(jié)：玻璃化儲存皮膚的步驟項目4℃-20℃-80℃-196℃右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀環(huán);左側(cè)為液氮儲存48h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮小玻璃化儲存生物組織和細胞，由于降溫速率很快，水分沒有足夠的時間來形成冰晶，即進入均勻的玻璃狀態(tài)。7天21天4℃儲存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360（平均積分光密度，X±SD，n=10）新鮮皮膚基底膜完整、密度正常，連續(xù)性好，半橋粒結(jié)構(gòu)清晰可見，分布均勻；2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，與新鮮組皮膚組織比較，﹡P<0.EC(電子偶聯(lián)反應(yīng)體系)結(jié)合,將H結(jié)合到各溫度組皮膚組織α-actinin表達通過488/520nm激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察有效抑制過冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進快速結(jié)晶，促進玻璃化行程組別組別以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。-80℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360皮膚低溫儲存的理論依據(jù)主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。兩種方法的比較慢降溫速率冰晶形態(tài)玻璃化速凍時冰晶的形態(tài)皮膚低溫儲存的理論依據(jù)新鮮皮膚E-cadherin免疫組化染29皮膚的玻璃化儲存

皮膚在－196℃的深低溫環(huán)境中，其組織和細胞內(nèi)各種酶的活力及代謝很低甚至近乎零，即所謂的“生命懸持狀態(tài)”。在此溫度下保存的皮膚理論上可無限期儲存皮膚的玻璃化儲存皮膚在－196℃的深低溫環(huán)境中，30

玻璃化的理想條件

理論上說，體積很小的1微升純水要用106-107℃/s降溫速率才能形成玻璃態(tài)

玻璃化的理想條件

理論上說，體積很小的1微升純水要用31皮膚玻璃化儲存的途徑

以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。目前只能采用各種方法實現(xiàn)部分玻璃化，抑制冰晶形成和長大，避免細胞嚴重損傷皮膚玻璃化儲存的途徑以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻32皮膚玻璃化儲存的途徑冷源問題

目前國內(nèi)各家皮庫主要采用液氮作為冷源，溫度可達-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降溫速率可達2160℃/min皮膚玻璃化儲存的途徑冷源問題33皮膚玻璃化儲存的途徑儲存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來冷源溫度傳導困難和儲存不便，因此可設(shè)計成皮卷形式皮膚玻璃化儲存的途徑儲存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來34皮膚玻璃化儲存的途徑降溫速率冷卻的銅板預冷皮膚后即將其直接浸入液氮預冷銅板示意圖皮膚玻璃化儲存的途徑降溫速率預冷銅板示意圖35抗凍劑的應(yīng)用抗凍劑的應(yīng)用36抗凍液的作用及機制：

深低溫儲存組織離不開抗凍液的保護，否則皮膚將受到嚴重的損傷抗凍劑的作用機制有以下兩點：有效抑制過冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進快速結(jié)晶，促進玻璃化行程緩沖因冰形成而造成的滲透壓升高，減輕溶質(zhì)損害抗凍液的作用及機制：深低溫儲存組織離不開抗凍液的保護，37目前較為成熟抗凍液配方

H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇），以此作為玻璃化儲存皮膚的抗凍液

一般10000cm2面積的皮膚約需抗凍液3000ml目前較為成熟抗凍液配方H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇）3830分鐘6小時內(nèi)皮片新潔爾滅生理鹽水H抗凍液玻璃化儲皮及使用步驟臨床使用液氮復溫40℃15’30’皮卷生理鹽水生理鹽水30分鐘6小時內(nèi)皮片新潔爾滅生理鹽水H抗凍液玻璃化儲皮及使用39總結(jié)：玻璃化儲存皮膚的步驟異體皮的采集消毒皮膚的修整抗凍液的處理包裝快速降溫液氮容器的管理總結(jié)：玻璃化儲存皮膚的步驟異體皮的采集40細胞膜的影響降低細胞的流動性細胞骨架受損表皮細胞黏附率降低基底膜的破壞玻璃化對皮膚結(jié)構(gòu)和功能的影響細胞膜的影響降低細胞的流動性玻璃化對皮膚結(jié)構(gòu)和功能的影響41玻璃化對皮膚抗原性影響皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新鮮異體皮長低溫儲存后皮片抗原性降低，可能與皮膚內(nèi)朗格漢斯細胞（LS）數(shù)量降低有關(guān)保存溫度越低，抗原性越弱，移植后存活時間越長玻璃化對皮膚抗原性影響皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新42低溫對朗格漢斯細胞的影響新鮮豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量較多、呈樹突狀輪廓-196℃豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量明顯減少、樹突變短低溫對朗格漢斯細胞的影響新鮮豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量較43新鮮組束狀廣泛分布于細胞質(zhì)中，T/D組少量斷裂和分叉，束狀密集分布。4℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360E-cadherin免疫組化染色結(jié)果-80℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360E-cadherin免疫組化染色結(jié)果保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、-196℃組中橋粒結(jié)構(gòu)、數(shù)新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、量基本與新鮮組相似每年異體尸體皮采集及儲存40余具與新鮮組皮膚比較，*P<0.防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失皮膚在－196℃的深低溫環(huán)境中，其組織和細胞內(nèi)各種酶的活力及代謝很低甚至近乎零，即所謂的“生命懸持狀態(tài)”。每年異體尸體皮采集及儲存40余具大張異體皮+微粒皮制備方法2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，到供皮區(qū)的限制與新鮮組皮膚組織比較，﹡P<0.保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷）異體皮勻漿免疫擴散電泳圖右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀環(huán);左側(cè)為液氮儲存48h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮小

新鮮組束狀廣泛分布于細胞質(zhì)中，T/D組少量斷裂和分叉，束狀密44異體皮勻漿免疫火箭電泳圖上圖為新鮮皮勻漿電泳結(jié)果下圖為液氮儲存48h后皮片勻漿電泳結(jié)果異體皮勻漿免疫火箭電泳圖上圖為新鮮皮勻漿電泳結(jié)果45皮膚活力的鑒定皮膚活力的鑒定46常用的皮膚活力的鑒定方法皮膚氧耗量測定法琥珀酸鈉脫氫酶測定法四氮唑鹽WST-1法SYTO/EB雙重染色法常用的皮膚活力的鑒定方法皮膚氧耗量測定法47皮膚氧耗量測定法

原理：有活力的組織均有代謝耗氧恒溫營養(yǎng)液內(nèi)微電極（鉑、銀電極）與有活力的皮膚接觸，表面氧分壓下降，通過放大器測下降程度，推算出皮膚的活力，操作可在1h內(nèi)完成皮膚氧耗量測定法原理：有活力的組織均有代謝耗氧48我院自行設(shè)計的測氧儀外觀我院自行設(shè)計的測氧儀外觀49琥珀酸脫氫酶測定法測定原理琥珀酸鈉+紅四氮唑延胡索酸+甲琥珀酸脫氫酶H+月替琥珀酸脫氫酶測定法測定原理琥珀酸脫氫酶H+月替50琥珀酸脫氫酶測定法示意圖

皮片氮氣琥珀酸鈉+紅四氮唑37℃水浴1h乙二醇乙醚皮片OD490um/mg（活力單位）琥珀酸脫氫酶測定法示意圖琥珀酸鈉+紅四氮唑37℃水浴1h乙51四氮唑鹽WST-1法

原理:利用活組織或細胞中的線粒體琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS),作用在亞細胞呼吸鏈反應(yīng)中的還原型輔酶Ⅰ

(NADH)、NAD+(輔酶Ⅰ)脫氫反應(yīng)與細胞組織中的呼吸鏈EC(電子偶聯(lián)反應(yīng)體系)結(jié)合,將H結(jié)合到WST-1的甲氮唑苯環(huán)上,打開其四氮唑苯環(huán)而顯色四氮唑鹽WST-1法原理:利用活組織或細胞中的線粒體琥珀52四氮唑鹽WST-1法琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS)琥珀酸脫氫酶H+呼吸鏈WST-1顯色反應(yīng)四氮唑鹽WST-1法琥珀酸四氮唑琥珀酸脫氫酶H+呼吸鏈WST53SYTO/EB雙重染色法

為一種敏感、快速的皮膚活力檢測法,采用新型穿透性核酸染色劑SYTO和EB方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30’

后PBS洗滌。通過488/520nm激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察SYTO/EB雙重染色法

為一種敏感、快速的皮膚活力檢測法,54玻璃化對皮膚活力的影響

通過對氧耗量及琥珀酸脫氫酶活力的測定發(fā)現(xiàn)玻璃化儲存的皮膚活力較慢凍法提高了將近20%玻璃化對皮膚活力的影響通過對氧耗量及琥珀酸脫氫酶活55速凍玻璃化儲皮的優(yōu)點及效果：該法可以永久保存皮膚，儲存后冷凍皮片的平均活力指標可達到新鮮皮片的70%，較以往的慢速冷凍法提高活力近20%采用該法保存的皮膚臨床具有質(zhì)地柔軟、植皮后轉(zhuǎn)紅快、成活率高（95%左右）、存活期長等優(yōu)點速凍玻璃化儲皮的優(yōu)點及效果：該法可以永久保存皮膚，儲存后冷凍56第二部分

臨床實際應(yīng)用第二部分

臨床實際應(yīng)用57冷凍異體皮的適用范圍開放性創(chuàng)面、深度燒傷創(chuàng)面和切痂創(chuàng)面的暫時性覆蓋用于郵票、網(wǎng)狀或自體微粒皮的覆蓋移植，保證下方自體微粒皮成活用于自體皮源緊張的燒傷后期整形重建手術(shù)，作為自體微粒皮的支架用于暫不適合自體皮的創(chuàng)面覆蓋以改善創(chuàng)基情況冷凍異體皮的適用范圍58異體皮覆蓋創(chuàng)面的意義防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失防止電解質(zhì)、蛋白質(zhì)及血細胞丟失減少創(chuàng)面污染，減輕患者疼痛有利于關(guān)節(jié)部位早日活動保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力低溫儲存后抗原性降低，創(chuàng)面覆蓋時間延長異體皮覆蓋創(chuàng)面的意義防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失59應(yīng)用方法大張異體皮嵌植小塊自體皮大張異體皮自體微粒皮移植目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法應(yīng)用方法大張異體皮嵌植小塊自體皮60大張異體皮+微粒皮制備方法

第一步復溫大張異體皮+微粒皮制備方法61大張異體皮+微粒皮制備方法第二步微粒皮的制備大張異體皮+微粒皮制備方法第二步62大張異體皮+微粒皮制備方法第三步漂皮大張異體皮+微粒皮制備方法63創(chuàng)面處理前

創(chuàng)面處理前64切削痂后創(chuàng)面切削痂后創(chuàng)面65以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。自體皮燒傷治療中最為常用的皮片，其來源受胞外區(qū)與基質(zhì)蛋白相連，胞內(nèi)區(qū)與細胞骨架相連，介導細胞內(nèi)外雙向信息傳遞0150.海藻糖對低溫保存皮膚后β-肌動蛋白的實驗研究新鮮皮膚β-catenin免疫組化染色×360海藻糖對低溫保存皮膚β1整合素的實驗研究皮膚低溫儲存的重要意義緩沖因冰形成而造成的滲透壓升高，減輕溶質(zhì)損害隨著皮膚低溫儲存研究的不斷發(fā)展，從而更為有效的提高異體皮活力，同時通過對皮膚替代物研究的加強，相信大面積燒傷患者皮源匱乏的問題將得到進一步解決大張異體皮+微粒皮制備方法異體皮來源受到極大的限制；該法可以永久保存皮膚，儲存后冷凍皮片的平均活力指標可達到新鮮皮片的70%，較以往的慢速冷凍法提高活力近20%-196℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×360β1整合素位于皮膚基底細胞表面，維系表皮、真皮之間的連接，對維持細胞膜完整性及功能起著重要的作用（平均積分光密度,X±SD，n=10）抗凍劑的作用機制有以下兩點：1987年開始速凍玻璃化儲皮方法儲存的實驗研究和臨床應(yīng)用緩沖因冰形成而造成的滲透壓升高，減輕溶質(zhì)損害-80℃儲存E-cadherin免疫組化染色×36001，T/D、D/P組間比較，△P<0.大張異體皮覆蓋創(chuàng)面

以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。66微粒皮植皮注意事項植皮面積與微粒皮比例自體微粒皮與異體皮的比例為1:10～1:15較好.自體皮源極度缺乏時甚至可達1:20微粒皮正反面問題微粒皮均勻分散微粒皮植皮注意事項植皮面積與微粒皮比例67臨床變化異體皮發(fā)黑變干脫落創(chuàng)面愈合

移植皮片3-4天轉(zhuǎn)紅，1-2周異體皮色澤近似正常皮膚，此后呈斑點狀或斑片狀發(fā)黑區(qū)即為成活的自體微粒皮。4-6周異體皮壞死成干痂，但仍附著牢固，此時微粒皮融合成片，以后異體皮完全變干脫落，創(chuàng)面修復完成。未見異體皮發(fā)黑，變干，脫落而創(chuàng)面愈合臨床變化異體皮發(fā)黑變干脫落創(chuàng)面愈合68臨床病例Ⅲ°創(chuàng)面臨床病例Ⅲ°創(chuàng)面69臨床病例術(shù)中削痂后覆蓋異體皮臨床病例術(shù)中削痂后覆蓋異體皮70臨床病例術(shù)后4w異體皮排斥術(shù)后45d創(chuàng)面基本愈合臨床病例術(shù)后4w異體皮排斥術(shù)后45d創(chuàng)面基本愈合71皮膚低溫儲存的基礎(chǔ)研究進展皮膚細胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫損傷的關(guān)鍵位點新型抗凍劑海藻糖的發(fā)現(xiàn)，可進一步優(yōu)化低溫抗凍液配方皮膚低溫儲存的基礎(chǔ)研究進展皮膚細胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白72細胞微環(huán)境略圖細胞微環(huán)境略圖73黏附連接縫隙連接緊密連接橋粒各種細胞連接示意圖黏附連接縫隙連接緊密連接橋粒各種細胞連接示意圖74海藻糖分子結(jié)構(gòu)示意圖海藻糖分子結(jié)構(gòu)示意圖75FN免疫組化染色結(jié)果

FN免疫組化染色結(jié)果76新鮮皮膚FN免疫組化染色×360-196℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360-80℃儲存皮膚FN免疫組化染色×3604℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360新鮮皮膚FN免疫組化染色×360-196℃儲存皮膚FN免疫77LN免疫組化染色結(jié)果

LN免疫組化染色結(jié)果78新鮮皮膚LN免疫組化染色×360-196℃儲存皮膚LN免疫組化染色×3604℃儲存皮膚LN免疫組化染色×360-80℃儲存皮膚LN免疫組化染色×360新鮮皮膚LN免疫組化染色×360-196℃儲存皮膚LN免79表2低溫儲存對皮膚表皮FN和LN含量的影響（平均積分光密度，X±SD，n=10）標本組別FNLN新鮮皮膚144.1±43.6156.5±40.7-196℃組121.3±38.4127.8±37.3-80℃組68.9±17.9*85.9±16.4*

-20℃組31.4±8.7*54.8±9.3*

4℃組22.8±4.6*22.4±7.6**與新鮮皮片組相比，P<0.01表2低溫儲存對皮膚表皮FN和LN含量的影響標本組別FNLN80E-cadherin免疫組化染色結(jié)果

E-cadherin免疫組化染色結(jié)果81新鮮皮膚E-cadherin免疫組化染色×3604℃儲存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360-80℃儲存E-cadherin免疫組化染色×360-196℃儲存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360新鮮皮膚E-cadherin免疫組化染色×3604℃儲存82β-catenin免疫組化染色結(jié)果β-catenin免疫組化染色結(jié)果83新鮮皮膚β-catenin免疫組化染色×360-196℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×360

-80℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×3604℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×360新鮮皮膚β-catenin免疫組化染色×360-196℃84表3低溫儲存對皮膚表皮E-cadherin和β-catenin含量的影響

（平均積分光密度,X±SD，n=10）*

與新鮮皮片組相比，P<0.01標本組別E-cadherinβ-catenin新鮮皮膚76.6±18.5100.2±23.9-196℃組61.8±23.487.8±17.3-80℃組23.9±11.4*65.9±18.4*-20℃組24.4±8.7*34.8±9.3*4℃組18.8±5.6*22.4±7.6*表3低溫儲存對皮膚表皮E-cadherin和β-caten85新鮮皮膚表皮層細胞結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，胞核圓形或橢圓形，－196℃皮膚結(jié)構(gòu)基本正常，有少量胞質(zhì)水腫，淡染，胞核縮小。(HE×400)

低溫冷凍對皮膚組織β-肌動蛋白表達的影響新鮮組－196℃組新鮮皮膚表皮層細胞結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，胞核圓形或橢圓形86新鮮皮膚組織β-actin主要分布于細胞質(zhì)，顏色均勻分布,陽性反應(yīng)強，－196℃組陽性反應(yīng)減弱，但結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)染色基本呈紅色。(SP×200)

新鮮組－196℃組低溫冷凍對皮膚組織β-肌動蛋白表達的影響新鮮皮膚組織β-actin主要分布于細胞質(zhì)，顏色均勻分87透射電鏡下觀察低溫冷凍對皮膚組織微絲的影響

新鮮組較粗,束狀廣泛均勻分布。-80℃組大片束狀結(jié)構(gòu)解聚，空隙增大，見斷裂和分叉；4℃組分布不均，細絲樣物質(zhì)明顯減少，結(jié)構(gòu)松散，粗細不等。-196℃組分布較廣泛，呈束狀(×20K，電鏡）

新鮮組

-80℃

4℃

-196℃透射電鏡下觀察低溫冷凍對皮膚組織微絲的影響新鮮組較粗,88新鮮皮膚顏色均勻，陽性反應(yīng)強，T/D組近似，但有少量細胞質(zhì)水腫，胞核縮小。D/P組呈淡黃色，DMEM組呈陰性反應(yīng)。（SP×200，光鏡）

T/DD/PDMEM新鮮組海藻糖對低溫保存皮膚后β-肌動蛋白的實驗研究新鮮皮膚顏色均勻，陽性反應(yīng)強，T/D組近似，但有少量89透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚后微絲的影響

新鮮組束狀廣泛分布于細胞質(zhì)中，T/D組少量斷裂和分叉，束狀密集分布。D/K組呈簇狀不均勻分布，空隙增大，解聚斷裂；DMEM組大部分已解聚斷裂，無明顯束狀結(jié)構(gòu)。

（×25K，電鏡）

新鮮T/DD/KDMEM透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚后微絲的影響新鮮組90皮膚β1整合素及相關(guān)蛋白免疫組化染色結(jié)果

皮膚β1整合素及相關(guān)蛋白91基質(zhì)蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白關(guān)系模型laminin基質(zhì)蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白關(guān)系模型laminin92整合素是一類位于細胞表面黏附分子，屬跨膜糖蛋白胞外區(qū)與基質(zhì)蛋白相連，胞內(nèi)區(qū)與細胞骨架相連，介導細胞內(nèi)外雙向信息傳遞β1整合素位于皮膚基底細胞表面，維系表皮、真皮之間的連接，對維持細胞膜完整性及功能起著重要的作用整合素（Integrin）示意圖整合素是一類位于細胞表面黏附分子，屬跨膜糖蛋白整合素（Int93新鮮組－196℃組-20℃組4℃組低溫冷凍對皮膚組織β1整合素表達的影響新鮮正常皮膚組織β1integrin分布基底細胞細胞膜或胞漿新鮮組－196℃組-20℃組4℃組低溫冷凍對皮膚組織β1整合94低溫冷凍對皮膚層粘連蛋白laminin表達的影響新鮮正常皮膚組織laminin表達在真皮和表皮連接處新鮮組－196℃組－20℃組4℃組低溫冷凍對皮膚層粘連蛋白laminin表達的影響新鮮正常皮膚95低溫冷凍對皮膚層踝蛋白talin表達的影響新鮮正常皮膚組織talin分布于基底細胞新鮮組－196℃組－20℃組4℃組低溫冷凍對皮膚層踝蛋白talin表達的影響新鮮正常皮膚組織t96低溫冷凍對皮膚α-輔肌動蛋白表達的影響各溫度組皮膚組織α-actinin表達新鮮組－196℃組4℃組－80℃組低溫冷凍對皮膚α-輔肌動蛋白表達的影響各溫度組皮膚組織α-a97低溫儲存對皮膚表皮β1integrin、

laminin、talin含量的影響

（平均積分光密度,X±SD，n=10）與新鮮組皮膚組織比較，﹡P<0.05,**P<0.01標本組別β1integrinlaminin

talin新鮮皮膚0.256±0.016

0.265±0.016

0.216±0.012

-196℃組0.245±0.0210.247±0.025

0.194±0.013*

-80℃組0.232±0.012﹡0.238±0.020﹡

0.179±0.009**

-20℃組0.165±0.015**

0.176±0.013**

0.163±0.010**4℃組0.135±0.011**

0.147±0.015**

0.152±0.017**

低溫儲存對皮膚表皮β1integrin、laminin、98低溫儲存對皮膚組織基底膜影響新鮮組－196℃組4℃組新鮮皮膚基底膜完整、密度正常，連續(xù)性好，半橋粒結(jié)構(gòu)清晰可見，分布均勻；-196℃組中基底膜結(jié)構(gòu)基本與新鮮組相似；4℃組基底膜變薄，出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模糊不清，半橋粒明顯減少低溫儲存對皮膚組織基底膜影響新鮮組－196℃組4℃組新鮮皮膚99海藻糖對低溫保存皮膚β1整合素的實驗研究T/D-7d組D/P-7d組T/D-14d組D/P-14d組14天時兩組染色程度均降低，D/P組染色強度降低較明顯海藻糖對低溫保存皮膚β1整合素的實驗研究T/D-7d組D/P100兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響

（平均積分光密度,X±SD，n=6）與新鮮組皮膚比較，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P組間比較，△P<0.05,△△P<0.01組別

7天14天新鮮組T/D組D/P組0.296±0.019

0.296±0.0190.287±0.0150.279±0.0100.284±0.0140.249±0.018**兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響與101橋粒透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚基底膜的影響T/D-7d組D/P-7d組T/D-14d組D/P-14d組2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，橋粒透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚基底膜的影響T/D-7102橋粒芯糖蛋白1、2免疫組化染色結(jié)果橋粒芯糖蛋白1、2103錨著在橋粒斑上的細胞骨架細絲胞質(zhì)橋粒斑蛋白細胞間空隙橋粒芯蛋白相鄰細胞膜橋粒結(jié)構(gòu)示意圖錨著在橋粒斑上的細胞骨架細絲胞質(zhì)橋粒斑蛋白細胞間空隙橋粒芯蛋104新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白1主要分布于顆粒細胞層，－20℃組，4℃組陽性反應(yīng)明顯減弱。(SP×400)

低溫冷凍對皮膚組織橋粒芯糖蛋白1表達的影響-20℃新鮮組-196℃4℃新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白1主要分布于顆粒細胞層，－20105新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白2主要分布于基底細胞層，－20℃組，4℃組陽性反應(yīng)明顯減弱。(SP×400)

低溫冷凍對皮膚組織橋粒芯糖蛋白2表達的影響新鮮組-196℃4℃-20℃新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白2主要分布于基底細胞層，－20106表3低溫儲存對皮膚表皮Dsg1和Dsg2含量的影響

（平均積分光密度,X±SD，n=10）*

與新鮮皮片組相比，P<0.05標本組別Dsg1Dsg2新鮮皮膚0.287±0.0080.254±0.007-196℃組0.283±0.0050.247±0.006-80℃組0.272±0.007*0.239±0.007*-20℃組0.235±0.018*0.164±0.008*4℃組0.203±0.012*0.115±0.021*表3低溫儲存對皮膚表皮Dsg1和Dsg2含量的影響*與新107新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、完整、數(shù)量較多-196℃組中橋粒結(jié)構(gòu)、數(shù)量基本與新鮮組相似

4℃組橋粒出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模糊不清，數(shù)量明顯減少新鮮組-196℃4℃橋粒橋粒橋粒透射電鏡下觀察低溫冷凍對皮膚組織橋粒的影響新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、新鮮組-196℃4℃橋粒橋粒橋108海藻糖對低溫保存皮膚橋粒芯糖蛋白1的實驗研究D/P-21d組T/D-21d組T/D-7d組D/P-7d組海藻糖對低溫保存皮膚橋粒芯糖蛋白1的實驗研究D/P-21d109表3兩種低溫保護劑對皮膚組織Dsg1表達變化影響

（平均積分光密度,X±SD，n=6）與新鮮組皮膚比較，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P組間比較，△P<0.05,△△P<0.01組別

7天21天新鮮組T/D組D/P組0.287±0.008

0.287±0.008

0.285±0.0060.284±0.0040.282±0.0040.275±0.005**△表3兩種低溫保護劑對皮膚組織Dsg1表達變化影響與新鮮組皮110T/D-7d組D/P-7d組橋粒橋粒透射電鏡下觀察CPA對低溫保存皮膚橋粒的影響橋粒D/P-21d組T/D-21d組橋粒T/D-7d組D/P-7d組橋粒橋粒透射電鏡下觀察CPA對111皮膚替代物的研究表皮替代物表皮細胞膜片的培養(yǎng)真皮替代物脫細胞異體真皮、人工聚合材料復合皮自體表皮+真皮替代物皮膚替代物的研究112結(jié)語

深低溫皮膚儲存的技術(shù)為臨床救治大面積燒傷病人創(chuàng)面覆蓋工作的順利開展提供了有力的支持。但目前仍有一些不可忽視的問題存在，如降溫速率并不十分滿意，抗凍劑的進一步篩選；異體皮傳播肝炎病毒、HIV的可能性；異體皮來源受到極大的限制；排斥問題的存在，排異組織溶痂及加重病情等結(jié)語深低溫皮膚儲存的技術(shù)為臨床救治113結(jié)語

隨著皮膚低溫儲存研究的不斷發(fā)展，從而更為有效的提高異體皮活力，同時通過對皮膚替代物研究的加強，相信大面積燒傷患者皮源匱乏的問題將得到進一步解決結(jié)語隨著皮膚低溫儲存研究的不斷發(fā)114謝謝！謝謝！115皮膚玻璃化儲存的途徑冷源問題

目前國內(nèi)各家皮庫主要采用液氮作為冷源，溫度可達-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降溫速率可達2160℃/min皮膚玻璃化儲存的途徑冷源問題116皮膚玻璃化儲存的途徑儲存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來冷源溫度傳導困難和儲存不便，因此可設(shè)計成皮卷形式皮膚玻璃化儲存的途徑儲存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來117抗凍液的作用及機制：

深低溫儲存組織離不開抗凍液的保護，否則皮膚將受到嚴重的損傷抗凍劑的作用機制有以下兩點：有效抑制過冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進快速結(jié)晶，促進玻璃化行程緩沖因冰形成而造成的滲透壓升高，減輕溶質(zhì)損害抗凍液的作用及機制：深低溫儲存組織離不開抗凍液的保護，118大張異體皮覆蓋創(chuàng)面

大張異體皮覆蓋創(chuàng)面119臨床病例Ⅲ°創(chuàng)面臨床病例Ⅲ°創(chuàng)面120基質(zhì)蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白關(guān)系模型laminin基質(zhì)蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白關(guān)系模型laminin121低溫儲存對皮膚表皮β1integrin、

laminin、talin含量的影響

（平均積分光密度,X±SD，n=10）與新鮮組皮膚組織比較，﹡P<0.05,**P<0.01標本組別β1integrinlaminin

talin新鮮皮膚0.256±0.016

0.265±0.016

0.216±0.012

-196℃組0.245±0.0210.247±0.025

0.194±0.013*

-80℃組0.232±0.012﹡0.238±0.020﹡

0.179±0.009**

-20℃組0.165±0.015**

0.176±0.013**

0.163±0.010**4℃組0.135±0.011**

0.147±0.015**

0.152±0.017**

低溫儲存對皮膚表皮β1integrin、laminin、122兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響

（平均積分光密度,X±SD，n=6）與新鮮組皮膚比較，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P組間比較，△P<0.05,△△P<0.01組別

7天14天新鮮組T/D組D/P組0.296±0.019

0.296±0.0190.287±0.0150.279±0.0100.284±0.0140.249±0.018**兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響與123皮膚儲存新技術(shù)及臨床應(yīng)用課件124皮膚儲存新技術(shù)及臨床應(yīng)用課件125前言

據(jù)統(tǒng)計，目前世界每年大約有100萬人因各種原因而燒（燙）傷。尤其大面積深度燒傷病人，治療是一個漫長而復雜的過程。通常需要通過異體（種）皮片移植來覆蓋創(chuàng)面，而皮源的缺乏往往成為治療的關(guān)鍵問題之一前言據(jù)統(tǒng)計，目前世界每年大約有100126皮庫的意義

54年前英國人Pickerill寫下了這樣一段話：“毫無爭議，創(chuàng)傷整復手術(shù)成功的關(guān)鍵之一是有可供給的皮源覆蓋因創(chuàng)傷帶來的大面積皮膚缺損。實際上在某種情況下，對皮源需要超越一切。因此這啟示我們應(yīng)該注重皮膚的儲存與臨床應(yīng)用?！逼斓囊饬x54年前英國人Pickerill寫下了127我院皮庫簡介：自1973年創(chuàng)建皮庫以來，分別運用了4℃、-20℃和-80℃低溫冰箱皮膚保存法以及液氮儲皮方法1987年開始速凍玻璃化儲皮方法儲存的實驗研究和臨床應(yīng)用

我院皮庫簡介：自1973年創(chuàng)建皮庫以來，分別運用了4℃、-2128我院皮庫簡介：每年異體尸體皮采集及儲存40余具深低溫速凍異體皮保存方法的改進使保存皮片活力穩(wěn)定保持在70%以上，皮片移植成活率達95%以上成為亞洲最大的皮庫之一，已儲存了3000余具活力良好的尸體皮，供全國30個省市300多家醫(yī)院使用每年創(chuàng)利潤數(shù)百萬元，經(jīng)濟效益顯著我院皮庫簡介：每年異體尸體皮采集及儲存40余具129我院皮庫簡介：科研方面曾獲國家自然科學基金，首都醫(yī)學科技發(fā)展基金，八五、九五、十五、十一五全軍科研基金20余項；出版相關(guān)專著10余部，發(fā)表學術(shù)論著100余篇；培養(yǎng)進修生、研究生數(shù)百人獲國家科技進步二等獎1項，軍隊科技進步二等獎6項我院皮庫簡介：科研方面曾獲國家自然科學基金，首都醫(yī)學科技發(fā)展130皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新鮮異體皮長*與新鮮皮片組相比，P<0.未見異體皮發(fā)黑，變干，脫落而創(chuàng)面愈合原理:利用活組織或細胞中的線粒體琥珀酸四氮新鮮皮膚組織橋粒芯糖蛋白1主要分布于顆粒細胞層，－20℃組，4℃組陽性反應(yīng)明顯減弱。0150.移植皮片3-4天轉(zhuǎn)紅，1-2周異體皮色澤近似正常皮膚，此后呈斑點狀或斑片狀發(fā)黑區(qū)即為成活的自體微粒皮。皮膚β1整合素及相關(guān)蛋白冷卻的銅板預冷皮膚后即將其直接浸入液氮4℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360皮膚細胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫損傷的關(guān)鍵位點異種皮以豬皮多見。0190.-196℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×360保存時間(d)3-74512個月理論無限期D/K組呈簇狀不均勻分布，空隙增大，解聚斷裂；目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響（平均積分光密度,X±SD，n=6）目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法第一部分皮膚的低溫儲存皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新鮮異體皮長第一部分皮131

皮膚儲存的基礎(chǔ)知識皮膚的結(jié)構(gòu)皮膚的功能皮膚低溫儲存的重要意義皮膚低溫儲存的理論依據(jù)皮膚的低溫損傷機制皮膚儲存的基礎(chǔ)知識皮膚的結(jié)構(gòu)132皮膚的結(jié)構(gòu)

皮膚從外到內(nèi)，由表皮、真皮和皮下組織三部分組成皮膚附件作為特化的表皮結(jié)構(gòu)也屬于皮膚的重要結(jié)構(gòu)，其中包括汗腺、皮脂腺、毛發(fā)、指甲皮膚的結(jié)構(gòu)皮膚從外到內(nèi)，由表皮、真皮和皮下組織三部分133皮膚的結(jié)構(gòu)

表皮

從上到下又分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層、基底層

真皮

分為乳頭層、網(wǎng)狀層。主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。此外皮膚附件，血管、淋巴管、神經(jīng)末梢皮膚的結(jié)構(gòu)表皮從上到下又分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層134皮膚的主要功能：保護作用感覺作用體溫調(diào)節(jié)作用分泌和排泄作用吸收作用皮膚的主要功能：保護作用135水分電解質(zhì)皮膚缺失熱量蛋白質(zhì)病原體

貧血低蛋白血癥創(chuàng)面膿毒癥MODS死亡水分電解質(zhì)皮膚缺失熱量蛋白質(zhì)病原體貧血低蛋白血癥136大面積燒傷病人創(chuàng)面焦痂的存在引起：

體液的丟失有害介質(zhì)釋放侵襲性感染的滋生地機體超高代謝多器官功能衰竭及并發(fā)癥大面積燒傷病人創(chuàng)面焦痂的存在引起：體液的丟失137皮膚儲存的必要性：當大面積燒傷或皮膚缺損超過體表面積的30%時，自體供皮受限臨床實踐證明：具有活力的異體皮仍是目前最為理想的創(chuàng)面覆蓋物異體皮來源時間受限皮膚儲存的必要性：當大面積燒傷或皮膚缺損超過體表面積的30%138皮片的來源及種類自體皮

燒傷治療中最為常用的皮片，其來源受到供皮區(qū)的限制異種皮以豬皮多見。取材方便，但移植后排斥時間短，有時難以達到覆蓋創(chuàng)面的目的同種異體皮主要來源于成人新鮮尸體，其次為新鮮死嬰皮

皮片的來源及種類自體皮燒傷治療中最為常用的皮片，其139皮膚的低溫儲存

皮膚的低溫儲存140低溫儲存理論依據(jù)

理論上，儲存溫度越低，儲存物活力保持的時間越長，細胞組織代謝越低，污染的細菌也不易繁殖低溫儲存理論依據(jù)理論上，儲存溫度越低，儲存物活力保持的141異體皮來源受到極大的限制；通常需要通過異體（種）皮片移植來覆蓋創(chuàng)面，而皮源的缺乏往往成為治療的關(guān)鍵問題之一0150.環(huán)而顯色2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗滌。方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗滌。皮膚細胞外基質(zhì)（纖維連接蛋白、層粘連蛋白等）、骨架蛋白（微絲、微管、中間絲）以及細胞間連接橋粒結(jié)構(gòu)可能是低溫損傷的關(guān)鍵位點-80℃儲存皮膚FN免疫組化染色×3604℃組橋粒出現(xiàn)斷裂，結(jié)構(gòu)模與新鮮組皮膚比較，*P<0.-80℃儲存皮膚β-catenin免疫組化染色×360（平均積分光密度,X±SD，n=10）皮膚低溫儲存的理論依據(jù)右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀環(huán);左側(cè)為液氮儲存48h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮?。ㄆ骄e分光密度,X±SD，n=10）新鮮皮膚LN免疫組化染色×360培養(yǎng)進修生、研究生數(shù)百人兩種低溫保護劑對皮膚組織β1integrin表達變化影響E-cadherin免疫組化染色結(jié)果保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力表１

皮膚儲存方法比較項目4℃-20℃-80℃-196℃

費用少少較貴貴（補液氮）

保存時間(d)3-74512個月理論無限期最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70異體皮來源受到極大的限制；表１皮膚儲存方法比較項目142低溫損傷機制：

低溫保存關(guān)鍵在于解決低溫損傷對生物組織的影響。經(jīng)典的低溫生物學認為在低溫條件下，細胞主要受到來自兩種因素的損傷即溶質(zhì)性損傷和胞內(nèi)冰損傷，即“兩因素”學說低溫損傷機制：低溫保存關(guān)鍵在于解決低溫損傷對生物組143“兩因素”學說胞內(nèi)冰晶損傷

胞內(nèi)生成冰晶，長大到一定程度，引起細胞壁及細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化，甚至導致細胞死亡，是降溫速率較快時引起損傷的主要原因溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷）

細胞外水分結(jié)冰，導致細胞內(nèi)外溶液濃度的升高并持續(xù)較長的時間。由高滲引起細胞的損傷，是降溫速率較慢時引起損傷的主要原因“兩因素”學說胞內(nèi)冰晶損傷144“兩因素”學說“兩因素”學說145皮膚結(jié)構(gòu)與儲存的關(guān)系

皮膚不是單細胞成分，而是由表皮和真皮構(gòu)成的復合組織，由于皮膚內(nèi)的各種主要細胞成分的結(jié)構(gòu)與功能的復雜性，各種細胞代謝與營養(yǎng)條件不同,對環(huán)境改變的適應(yīng)性亦有所不同。因此皮膚的低溫損傷是一個更為非常復雜的過程皮膚結(jié)構(gòu)與儲存的關(guān)系皮膚不是單細胞成分，而是由表皮和146皮膚低溫損傷的其他因素

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，表皮細胞低溫損傷還與細胞骨架、細胞連接橋粒以及細胞間黏附的關(guān)系密切皮膚低溫損傷的其他因素近年來的研究發(fā)現(xiàn)，表皮細胞低溫147

低溫損傷的干預：玻璃化儲皮方法的發(fā)展抗凍液的使用

低溫損傷的干預：148玻璃化的基礎(chǔ)知識玻璃化的基礎(chǔ)知識149玻璃化的概念

玻璃化是一個物理學的概念，是指當水或溶液在極快降溫到或低于-100～-110℃的溫度范圍時，形成一種具有高黏度的界于液態(tài)和固態(tài)之間、非晶體態(tài)的、雜亂無章的、透明的玻璃狀態(tài)玻璃化的概念150玻璃化儲存的特點：

玻璃化儲存生物組織和細胞，由于降溫速率很快，水分沒有足夠的時間來形成冰晶，即進入均勻的玻璃狀態(tài)。這種玻璃態(tài)的物理性能與晶體態(tài)不同，是一種既可以避免或減輕冷凍過程組織的損傷，又是同時可長期保存組織的良好方法玻璃化儲存的特點：玻璃化儲存生物組織和細胞151皮膚低溫儲存的理論依據(jù)異體皮來源受到極大的限制；大張異體皮+微粒皮制備方法量基本與新鮮組相似4℃儲存皮膚LN免疫組化染色×360最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70皮膚低溫儲存的理論依據(jù)目前較為成熟抗凍液配方玻璃化速凍時冰晶的形態(tài)異體皮發(fā)黑變干脫落創(chuàng)面愈合新鮮皮膚LN免疫組化染色×360玻璃化對皮膚抗原性影響未見異體皮發(fā)黑，變干，脫落而創(chuàng)面愈合7天14天-196℃豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量明顯減少、樹突變短用于暫不適合自體皮的創(chuàng)面覆蓋以改善創(chuàng)基情況-196℃儲存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360新型抗凍劑海藻糖的發(fā)現(xiàn)，可進一步優(yōu)化低溫抗凍液配方近年來的研究發(fā)現(xiàn)，表皮細胞低溫損傷還與細胞骨架、細胞連接橋粒以及細胞間黏附的關(guān)系密切目前較為成熟抗凍液配方H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇），以此作為玻璃化儲存皮膚的抗凍液新鮮皮膚E-cadherin免疫組化染色×360總結(jié)：玻璃化儲存皮膚的步驟項目4℃-20℃-80℃-196℃右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀環(huán);左側(cè)為液氮儲存48h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮小玻璃化儲存生物組織和細胞，由于降溫速率很快，水分沒有足夠的時間來形成冰晶，即進入均勻的玻璃狀態(tài)。7天21天4℃儲存皮膚E-cadherin免疫組化染色×360（平均積分光密度，X±SD，n=10）新鮮皮膚基底膜完整、密度正常，連續(xù)性好，半橋粒結(jié)構(gòu)清晰可見，分布均勻；2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，與新鮮組皮膚組織比較，﹡P<0.EC(電子偶聯(lián)反應(yīng)體系)結(jié)合,將H結(jié)合到各溫度組皮膚組織α-actinin表達通過488/520nm激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察有效抑制過冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進快速結(jié)晶，促進玻璃化行程組別組別以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。-80℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360皮膚低溫儲存的理論依據(jù)主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。兩種方法的比較慢降溫速率冰晶形態(tài)玻璃化速凍時冰晶的形態(tài)皮膚低溫儲存的理論依據(jù)新鮮皮膚E-cadherin免疫組化染152皮膚的玻璃化儲存

皮膚在－196℃的深低溫環(huán)境中，其組織和細胞內(nèi)各種酶的活力及代謝很低甚至近乎零，即所謂的“生命懸持狀態(tài)”。在此溫度下保存的皮膚理論上可無限期儲存皮膚的玻璃化儲存皮膚在－196℃的深低溫環(huán)境中，153

玻璃化的理想條件

理論上說，體積很小的1微升純水要用106-107℃/s降溫速率才能形成玻璃態(tài)

玻璃化的理想條件

理論上說，體積很小的1微升純水要用154皮膚玻璃化儲存的途徑

以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻璃化需要極高的降溫速率。目前只能采用各種方法實現(xiàn)部分玻璃化，抑制冰晶形成和長大，避免細胞嚴重損傷皮膚玻璃化儲存的途徑以水為主要成分的生物組織,實現(xiàn)完全玻155皮膚玻璃化儲存的途徑冷源問題

目前國內(nèi)各家皮庫主要采用液氮作為冷源，溫度可達-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降溫速率可達2160℃/min皮膚玻璃化儲存的途徑冷源問題156皮膚玻璃化儲存的途徑儲存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來冷源溫度傳導困難和儲存不便，因此可設(shè)計成皮卷形式皮膚玻璃化儲存的途徑儲存的皮膚往往因具有一定的厚度和面積帶來157皮膚玻璃化儲存的途徑降溫速率冷卻的銅板預冷皮膚后即將其直接浸入液氮預冷銅板示意圖皮膚玻璃化儲存的途徑降溫速率預冷銅板示意圖158抗凍劑的應(yīng)用抗凍劑的應(yīng)用159抗凍液的作用及機制：

深低溫儲存組織離不開抗凍液的保護，否則皮膚將受到嚴重的損傷抗凍劑的作用機制有以下兩點：有效抑制過冷水的不規(guī)則形態(tài)及促進快速結(jié)晶，促進玻璃化行程緩沖因冰形成而造成的滲透壓升高，減輕溶質(zhì)損害抗凍液的作用及機制：深低溫儲存組織離不開抗凍液的保護，160目前較為成熟抗凍液配方

H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇），以此作為玻璃化儲存皮膚的抗凍液

一般10000cm2面積的皮膚約需抗凍液3000ml目前較為成熟抗凍液配方H液（20%二甲基亞砜、6%丙二醇）16130分鐘6小時內(nèi)皮片新潔爾滅生理鹽水H抗凍液玻璃化儲皮及使用步驟臨床使用液氮復溫40℃15’30’皮卷生理鹽水生理鹽水30分鐘6小時內(nèi)皮片新潔爾滅生理鹽水H抗凍液玻璃化儲皮及使用162總結(jié)：玻璃化儲存皮膚的步驟異體皮的采集消毒皮膚的修整抗凍液的處理包裝快速降溫液氮容器的管理總結(jié)：玻璃化儲存皮膚的步驟異體皮的采集163細胞膜的影響降低細胞的流動性細胞骨架受損表皮細胞黏附率降低基底膜的破壞玻璃化對皮膚結(jié)構(gòu)和功能的影響細胞膜的影響降低細胞的流動性玻璃化對皮膚結(jié)構(gòu)和功能的影響164玻璃化對皮膚抗原性影響皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新鮮異體皮長低溫儲存后皮片抗原性降低，可能與皮膚內(nèi)朗格漢斯細胞（LS）數(shù)量降低有關(guān)保存溫度越低，抗原性越弱，移植后存活時間越長玻璃化對皮膚抗原性影響皮膚經(jīng)低溫儲存后，異體皮的存活時間較新165低溫對朗格漢斯細胞的影響新鮮豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量較多、呈樹突狀輪廓-196℃豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量明顯減少、樹突變短低溫對朗格漢斯細胞的影響新鮮豚鼠皮朗格漢斯細胞數(shù)量較166新鮮組束狀廣泛分布于細胞質(zhì)中，T/D組少量斷裂和分叉，束狀密集分布。4℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360E-cadherin免疫組化染色結(jié)果-80℃儲存皮膚FN免疫組化染色×360E-cadherin免疫組化染色結(jié)果保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力主要有結(jié)締組織構(gòu)成，包括膠原纖維、彈力纖維、網(wǎng)狀纖維。新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、-196℃組中橋粒結(jié)構(gòu)、數(shù)新鮮皮膚橋粒結(jié)構(gòu)清晰、量基本與新鮮組相似每年異體尸體皮采集及儲存40余具與新鮮組皮膚比較，*P<0.防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失皮膚在－196℃的深低溫環(huán)境中，其組織和細胞內(nèi)各種酶的活力及代謝很低甚至近乎零，即所謂的“生命懸持狀態(tài)”。每年異體尸體皮采集及儲存40余具大張異體皮+微粒皮制備方法2周時間，D/P組基底膜部分區(qū)域結(jié)構(gòu)稍有松散，模糊不清，半橋粒數(shù)量有所下降，T/D組基底膜較完整，厚度大致均勻，半橋粒未見明顯漸少，到供皮區(qū)的限制與新鮮組皮膚組織比較，﹡P<0.保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力溶質(zhì)性損傷（高滲性損傷）異體皮勻漿免疫擴散電泳圖右側(cè)為新鮮皮勻漿與抗體形成的沉淀環(huán);左側(cè)為液氮儲存48h后與抗體形成的沉淀環(huán)，面積明顯縮小

新鮮組束狀廣泛分布于細胞質(zhì)中，T/D組少量斷裂和分叉，束狀密167異體皮勻漿免疫火箭電泳圖上圖為新鮮皮勻漿電泳結(jié)果下圖為液氮儲存48h后皮片勻漿電泳結(jié)果異體皮勻漿免疫火箭電泳圖上圖為新鮮皮勻漿電泳結(jié)果168皮膚活力的鑒定皮膚活力的鑒定169常用的皮膚活力的鑒定方法皮膚氧耗量測定法琥珀酸鈉脫氫酶測定法四氮唑鹽WST-1法SYTO/EB雙重染色法常用的皮膚活力的鑒定方法皮膚氧耗量測定法170皮膚氧耗量測定法

原理：有活力的組織均有代謝耗氧恒溫營養(yǎng)液內(nèi)微電極（鉑、銀電極）與有活力的皮膚接觸，表面氧分壓下降，通過放大器測下降程度，推算出皮膚的活力，操作可在1h內(nèi)完成皮膚氧耗量測定法原理：有活力的組織均有代謝耗氧171我院自行設(shè)計的測氧儀外觀我院自行設(shè)計的測氧儀外觀172琥珀酸脫氫酶測定法測定原理琥珀酸鈉+紅四氮唑延胡索酸+甲琥珀酸脫氫酶H+月替琥珀酸脫氫酶測定法測定原理琥珀酸脫氫酶H+月替173琥珀酸脫氫酶測定法示意圖

皮片氮氣琥珀酸鈉+紅四氮唑37℃水浴1h乙二醇乙醚皮片OD490um/mg（活力單位）琥珀酸脫氫酶測定法示意圖琥珀酸鈉+紅四氮唑37℃水浴1h乙174四氮唑鹽WST-1法

原理:利用活組織或細胞中的線粒體琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS),作用在亞細胞呼吸鏈反應(yīng)中的還原型輔酶Ⅰ

(NADH)、NAD+(輔酶Ⅰ)脫氫反應(yīng)與細胞組織中的呼吸鏈EC(電子偶聯(lián)反應(yīng)體系)結(jié)合,將H結(jié)合到WST-1的甲氮唑苯環(huán)上,打開其四氮唑苯環(huán)而顯色四氮唑鹽WST-1法原理:利用活組織或細胞中的線粒體琥珀175四氮唑鹽WST-1法琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系(RS)琥珀酸脫氫酶H+呼吸鏈WST-1顯色反應(yīng)四氮唑鹽WST-1法琥珀酸四氮唑琥珀酸脫氫酶H+呼吸鏈WST176SYTO/EB雙重染色法

為一種敏感、快速的皮膚活力檢測法,采用新型穿透性核酸染色劑SYTO和EB方法：皮片經(jīng)PBS洗滌后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗滌加入50ulEB,水浴避光孵育30’

后PBS洗滌。通過488/520nm激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察SYTO/EB雙重染色法

為一種敏感、快速的皮膚活力檢測法,177玻璃化對皮膚活力的影響

通過對氧耗量及琥珀酸脫氫酶活力的測定發(fā)現(xiàn)玻璃化儲存的皮膚活力較慢凍法提高了將近20%玻璃化對皮膚活力的影響通過對氧耗量及琥珀酸脫氫酶活178速凍玻璃化儲皮的優(yōu)點及效果：該法可以永久保存皮膚，儲存后冷凍皮片的平均活力指標可達到新鮮皮片的70%，較以往的慢速冷凍法提高活力近20%采用該法保存的皮膚臨床具有質(zhì)地柔軟、植皮后轉(zhuǎn)紅快、成活率高（95%左右）、存活期長等優(yōu)點速凍玻璃化儲皮的優(yōu)點及效果：該法可以永久保存皮膚，儲存后冷凍179第二部分

臨床實際應(yīng)用第二部分

臨床實際應(yīng)用180冷凍異體皮的適用范圍開放性創(chuàng)面、深度燒傷創(chuàng)面和切痂創(chuàng)面的暫時性覆蓋用于郵票、網(wǎng)狀或自體微粒皮的覆蓋移植，保證下方自體微粒皮成活用于自體皮源緊張的燒傷后期整形重建手術(shù)，作為自體微粒皮的支架用于暫不適合自體皮的創(chuàng)面覆蓋以改善創(chuàng)基情況冷凍異體皮的適用范圍181異體皮覆蓋創(chuàng)面的意義防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失防止電解質(zhì)、蛋白質(zhì)及血細胞丟失減少創(chuàng)面污染，減輕患者疼痛有利于關(guān)節(jié)部位早日活動保護暴露的組織，促進肉芽成熟、創(chuàng)面愈合，具有抗感染能力低溫儲存后抗原性降低，創(chuàng)面覆蓋時間延長異體皮覆蓋創(chuàng)面的意義防止創(chuàng)面干燥，減少水分及熱量喪失182應(yīng)用方法大張異體皮嵌植小塊自體皮大張異體皮自體微粒皮移植目前臨床應(yīng)用較多的是第二種方法應(yīng)用方法大張異體皮嵌植小塊自體皮183大張異體皮+微粒皮制備方法

第一步復溫大張異體皮+微粒皮制備方法184大張異體皮+微粒皮制備方法第二步微粒皮的制備大張異體皮+微粒皮制備方法