SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳)原理課件

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可對(duì)蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，并可精確測(cè)得蛋白質(zhì)的分子量。常用的方法為SDS不連續(xù)系統(tǒng)。

基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和N,N’-亞甲基雙丙稀酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide）經(jīng)共聚合而成。此聚合過程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和過硫酸胺（ammoniumpersulfate，AP）激發(fā)的。被激活的單體和未被激活的單體開始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機(jī)地接上雙丙稀酰胺，使多聚鏈交叉互連成為網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，最終多聚鏈聚合成凝膠狀。

SDS聚丙浠酰胺凝膠電泳原理采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可對(duì)蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，并可精確測(cè)得蛋白質(zhì)的分子量。常用的方法為SDS不連續(xù)系統(tǒng)。

基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和N,N’-亞甲基雙丙稀酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide）經(jīng)共聚合而成。此聚合過程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和過硫酸胺（ammoniumpersulfate，AP）激發(fā)的。被激活的單體和未被激活的單體開始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機(jī)地接上雙丙稀酰胺，使多聚鏈交叉互連成為網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，最終多聚鏈聚合成凝膠狀。

SDS聚丙浠酰胺凝膠電泳原理(acrylamide)

丙烯酰胺是一種白色晶體化學(xué)物質(zhì)，是生產(chǎn)聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯酰胺主要用于水的凈化處理、紙漿的加工及管道的內(nèi)涂層等。淀粉類食品在高溫（120℃）烹調(diào)下容易產(chǎn)生丙烯酰胺。

研究表明，人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸丙烯酰胺，飲水是其中的一條重要接觸途徑。

丙烯酰胺進(jìn)入體內(nèi)又可通過多種途徑被人體吸收，其中經(jīng)消化道吸收最快。進(jìn)入人體內(nèi)的丙烯酰胺約90％被代謝，僅少量以原形經(jīng)尿液排出。丙烯酰胺進(jìn)入體內(nèi)后，會(huì)在體內(nèi)與DNA上的鳥嘌呤結(jié)合形成加合物，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)損傷和基因突變。

對(duì)接觸丙烯酰胺的職業(yè)人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的調(diào)查表明，丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性作用，但目前還沒有充足的證據(jù)表明通過食物攝入丙烯酰胺與人類某種腫瘤的發(fā)生有明顯關(guān)系。

丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide）N.N-亞甲基雙丙烯酰胺，別名MBA，雙叫N.N-甲叉雙丙烯酰胺，次甲基雙丙烯酰胺，N.N-甲撐雙丙烯酰胺。是一種白色晶體粉末，無味，吸濕性極小。遇高溫或強(qiáng)光則自交聯(lián)，微溶于水、乙醇。丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N1N′-亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長(zhǎng)鏈。相鄰的兩個(gè)鏈通過亞甲基橋交聯(lián)起來就形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺又名甲撐雙丙烯酰胺,英文縮寫名MBA,為白色或淺黃色粉末狀結(jié)晶,毒性低,對(duì)皮膚無刺激,無神經(jīng)毒性,溶于水及乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。在它的結(jié)構(gòu)中具有兩個(gè)相同且非?；顫姷姆磻?yīng)性官能團(tuán),可作為交聯(lián)劑,能將線性高分子迅速轉(zhuǎn)變?yōu)轶w型高分子,制備吸水性聚合物,還可與各種離子型單體發(fā)生聚合反應(yīng),使其在石油開采以及醫(yī)藥、水處理等行業(yè)具有廣泛用途。N.N-亞甲基雙丙烯酰胺（甲叉）

TEMED(N,N,N',N'-四甲基二乙胺)產(chǎn)品簡(jiǎn)介：?TEMED即N,N,N‘,N’-Tetramethylethylenediamine，中文名為N,N,N‘,N’-四甲基二乙胺。分子式為(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2，

分子量為116.20。?進(jìn)口分裝，用于配制PAGE膠等。TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。

?加入加速劑TEMED后聚合馬上開始，應(yīng)立即將凝膠混勻，迅速灌膠。

保存條件：

4℃保存。注意事項(xiàng)：?易燃，有腐蝕性，請(qǐng)注意防護(hù)。?為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

過硫酸銨

分子式:

(NH4)2S2O8

分子量:

228.20

性狀：過硫酸銨是一種白色、無味晶體，常作強(qiáng)氧化劑使用，也可用作單體聚合引發(fā)劑。它幾乎不吸潮，由于能達(dá)到很高的純度而具有特別好的穩(wěn)定性，便于儲(chǔ)存。另外，它還具有使用方便、安全等優(yōu)點(diǎn)。儲(chǔ)存及使用注意事項(xiàng)：

過硫酸銨屬于非易燃品，但由于能釋放氧而有助燃作用，因此必須在一定條件下儲(chǔ)存。首先必須存放在干燥、密閉的容器中，其次應(yīng)避免陽光直射、熱源、潮濕等不利因素。另外，一些雜質(zhì)如臟物、鐵銹、少量金屬以及還原劑可能引起過硫酸銨的分解，在存放和使用過程中也必須注意。由于潮濕的過硫酸銨粉末及其水溶液有漂白和輕微的腐蝕作用，因此使用過程中應(yīng)避免眼睛、皮膚和衣物直接與其接觸。

過硫酸銨的應(yīng)用：過硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。須新鮮配制。過硫酸銨是乳膠或丙烯酸單體聚合液、醋酸乙烯、氯乙烯等產(chǎn)品的引發(fā)劑，同時(shí)也是苯乙烯、丙烯腈、丁二烯等膠體發(fā)生共聚作用的引發(fā)劑。過硫酸銨-TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng)：在Acr和Bis的溶液中放入這個(gè)催化系統(tǒng)后，過硫酸銨[（NH4）2S2O8]產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過硫酸銨濃度的平方根成正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進(jìn)行。例如，在pH8.8條件下7％的丙烯酰胺溶液30分鐘就能聚合完畢；在pH4.3時(shí)聚合很慢，要90分鐘才能完成。溫度與聚合的快慢成正比。通常在室溫下就很快聚合，溫度升高聚合更快。如將混合后的凝膠溶液放在近0℃的地方，就能延緩聚合。一般來講，溫度過低，有氧分子或不純物質(zhì)存在時(shí)都能延緩凝膠的聚合。為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合，在聚合前須將溶液分別抽氣，然后再混合。最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornstein(1964)和Davis(1964)設(shè)計(jì)的,樣品和濃縮膠中含Tris-HCl(pH6.8),上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分離膠中含Tris-HCl(pH8.8)。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)。樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動(dòng)界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動(dòng)界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域,它推動(dòng)樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動(dòng)。從移動(dòng)界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動(dòng)穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。甘氨酸電荷效應(yīng)：樣品進(jìn)入分離膠后，慢離子甘氨酸全部解離為負(fù)離子，泳動(dòng)速率加快，很快超過蛋白質(zhì)，高電壓梯度隨即消失。此時(shí)蛋白質(zhì)在均一的外加電場(chǎng)下泳動(dòng)，但由于蛋白質(zhì)分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率不同而形成一條條區(qū)帶。但在SDS電泳中，由于SDS這種陰離子表面活性劑以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，這種負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別，從而降低或消除了蛋白質(zhì)天然電荷的差別；此外，由多亞基組成的蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后都解離成亞單位，這是因?yàn)镾DS破壞了蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵。與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)型也發(fā)生變化，在水溶液中SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都具有相似的形狀，使得SDS電泳的泳動(dòng)率不再受蛋白質(zhì)原有電荷與形狀的影響。因此，各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中不同的泳動(dòng)率只反映了蛋白質(zhì)分子量的不同。電泳槽SDS蛋白電泳上樣緩沖液

蛋白上樣緩沖液(SDS

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buffer)是一種以溴酚藍(lán)為染料，5倍濃縮的SDS凝膠電泳上樣緩沖液,用于常規(guī)的SDS蛋白電泳樣品上樣。

本產(chǎn)品分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個(gè)蛋白條帶，選購和使用時(shí)請(qǐng)務(wù)必注明，仔細(xì)區(qū)分。

注意事項(xiàng)

分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中含一定量的DTT或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，較易區(qū)分；

含巰基的試劑有一定的毒性，為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明

1.按每4微升蛋白樣品加入1微升蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5X)。

2.

100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

3.

冷卻到室溫后離心數(shù)秒鐘，混均后再離30秒鐘，取上清直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。

4.

通常電泳時(shí)染料到達(dá)膠的底端附近（0.5-1cm)即可停止電泳。

增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴(kuò)散出來到電泳緩沖液中。指示劑監(jiān)測(cè)電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿。SDS蛋白電泳上樣緩沖液

單純的固定液一般難以達(dá)到這些要求，因此在實(shí)驗(yàn)中使用兩種混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而稱的卡諾氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需臨時(shí)配制，長(zhǎng)時(shí)間放置影響固定效果，固定時(shí)間15分鐘至24小時(shí)，冰箱、室溫均可。甲醇：有固定、硬化和脫水的作用?？梢怨潭ò椎鞍住⑶虻鞍?、核蛋白，但對(duì)核蛋白固定效果較差(親和力小且易自溶)。甲醇固定的特點(diǎn)是殺死快，滲透力強(qiáng)，對(duì)組織收縮較大(可收縮20左右)，可使材料變硬。冰醋酸：純醋酸在溫度稍變低時(shí)即形成冰晶，所以又稱為冰醋酸。常用0.3-0.5的濃度作為固定液。冰醋酸對(duì)材料有膨脹作用，對(duì)核蛋白固定好，可與水、酒精、氯仿混合。甲醇/冰醋酸固定液考馬斯亮藍(lán)（CoomassieBrilliantBlue）

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍(lán)G―250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer’slaw）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過程，約2min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，在測(cè)定溶液中含蛋白質(zhì)5μL/ml時(shí)就有0.275光吸收值的變化，