生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移

生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移資料僅供參考文件編號(hào)：2022年4月生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移版本號(hào)：A修改號(hào)：1頁(yè)次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：BRET生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)簡(jiǎn)介：生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）技術(shù)是近10年來(lái)出現(xiàn)的一種新的檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù).它的最大優(yōu)勢(shì)是能在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，因此能夠進(jìn)行相互作用動(dòng)力學(xué)的研究。在應(yīng)用這個(gè)系統(tǒng)研究感興趣的蛋白前，首先需要將Rluc或者EYFP融合到每個(gè)蛋白或者他們的輔蛋白上。在細(xì)胞中，融合蛋白共表達(dá)，然后和熒光素酶和其底物腔腸素反應(yīng)，當(dāng)能量供體Rluc，能量受體EYFP之間距離比較近的時(shí)候(10-100?)，那么光將從Rluc(峰值480nm發(fā)射)傳遞到EYFP，形成它的激發(fā)，并且發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)在530nm的發(fā)射光，BRET量化的程度以發(fā)射光530nm和480nm的比率表示。實(shí)驗(yàn)流程1、用于BRET的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；2、融合蛋白表達(dá)檢測(cè)；3、BRET實(shí)驗(yàn)；4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告客戶(hù)提供1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克?。?、用于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞（如果我公司細(xì)胞庫(kù)有可不需提供）公司提供詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟、使用儀器、及結(jié)果分析等詳細(xì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。服務(wù)周期和價(jià)格具體咨詢(xún)本公司熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移-FRET（FluorescentResonanceEnergyTransfer）

指兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。

（1）FRET發(fā)生條件：

能量匹配：供體分子的發(fā)射光譜可以被受體分子吸收并產(chǎn)生熒光信號(hào)。供體分子的發(fā)射光譜應(yīng)與受體分子的激發(fā)光譜必須有顯著重疊（>30%）；

作用距離：供體分子與受體分子的作用距離為1-10nm；

FRET效率公式：用于計(jì)算分子/基團(tuán)間作用距離R

偶極-偶極作用：供體分子與受體分子作用時(shí)的向量必須滿(mǎn)足一定條件。

（2）FRET的應(yīng)用：

通過(guò)FRET技術(shù)可以獲得有關(guān)兩個(gè)蛋白分子之間相互作用的空間信息（作用距離、作用方向、能量傳遞效率）。常用于解決如下問(wèn)題：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合體；轉(zhuǎn)錄機(jī)制；轉(zhuǎn)化途徑；分子運(yùn)動(dòng)；蛋白折疊等生物學(xué)問(wèn)題。

（3）FRET常見(jiàn)的供體-受體熒光分子對(duì)：熒光蛋白類(lèi)：

染料類(lèi)：

FRET檢測(cè)HIV附屬蛋白與細(xì)胞膜CD分子相互作用

摘自：AFlowCytometry-BasedFRETAssaytoIdentifyandAnalyseProtein-ProteinInteractionsinLivingCells

CarinaBanning,Jo¨rgVotteler,etal.

圖釋?zhuān)毫魇郊?xì)胞儀FACSAria檢測(cè)FRET信號(hào)。（a）活的293T細(xì)胞分別單獨(dú)轉(zhuǎn)入CFP、YFP、CFP/YFP、CFP/YFP融合蛋白作為對(duì)照，確定最好的圈門(mén)方式為CFP/FRET。（b）293T細(xì)胞經(jīng)過(guò)2%PFA處理后，YFP熒光強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降。

篩選有相互作用的未知蛋白質(zhì)的流程

圖釋?zhuān)毫魇郊?xì)胞儀FACSAria進(jìn)行FACS-FRET高通量篩選感興趣蛋白相互作用的未知蛋白。（a）FACS-FRET篩選流程。（b）在活的293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入Vpu-YFP作為誘餌，與等量的CFP融合蛋白（蛋白的cDNA庫(kù)）相互作用36小時(shí)后，分選FERT+細(xì)胞。

FRET研究蛋白酶功能

摘自：DetectionofInfectivePoliovirusbyaSimple,Rapid,andSensitiveFlowCytometryMethodBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransferTechnology

JasonL.Cantera

etal.Appliedandenvironmental

microbiology,Jan.2010,p.584-588

圖釋?zhuān)毫魇郊?xì)胞儀FACSAria檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV1）10倍感染BGM-PV細(xì)胞，8小時(shí)后上機(jī)檢測(cè)。A~C病毒濃度分別為0.4~0.004，D為陰性對(duì)照。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)BiFC（BimolecularFluorescenceComplementation）

是將熒光報(bào)告蛋白按照規(guī)則分成沒(méi)有熒光的兩段，分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合，只有在誘餌蛋白和捕獲蛋白發(fā)生相互作用的情況下，兩段不完整的熒光報(bào)告蛋白才會(huì)形成完整的報(bào)告蛋白，發(fā)出熒光?；罴?xì)胞收集后，在流式細(xì)胞儀中的檢測(cè)是實(shí)時(shí)進(jìn)行的，只要細(xì)胞中有熒光產(chǎn)生就會(huì)被捕捉到信號(hào)，因此，不論是親和力較弱的結(jié)合還是暫時(shí)性的結(jié)合都不會(huì)被遺漏。

雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)原理示意圖(a)誘餌和捕獲蛋白分別攜帶CYFP和NYFP兩段YFP熒光蛋白片段(b)誘餌和捕獲蛋白結(jié)合同時(shí)CYFP與NYFP形成YFP(c)形成的YFP發(fā)出熒光

（1）BiFC檢測(cè)的特點(diǎn)：

活細(xì)胞分析；

可以用于研究2種或2種以上的啟動(dòng)子調(diào)控之下的蛋白質(zhì)相互作用；

具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以檢測(cè)到（>7nm）。

（2）可用于BiFC的熒光蛋白：

GFP、BFP、CFP、YFP，生理?xiàng)l件可用的黃色的Venus和citrine，青色的cerulean；

紅色系統(tǒng)：mRFP2Q66T、mCherry；

Venus（EYFP的變體）是目前用于BiFC分析最多的熒光蛋白，因?yàn)槠錈晒鈴?qiáng)且背景敏感度降低，是BiFC分析理想的熒光蛋白。

常見(jiàn)的用于雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)的熒光蛋白

BiFC研究復(fù)合體中亞基間的相互作用

摘自：DetectionandCharacterizationofInfluenzaAVirusPA-PB2InteractionthroughaBimolecularFluorescenceComplementationAssay

JosephN.Hemerka,DanWang,etal.JOURNALOFVIROLOGY,Apr.2009,p.3944-3955

圖釋?zhuān)毫魇郊?xì)胞儀FACSCalibur檢測(cè)流感病毒復(fù)合體中亞基PA-PB2間的相互作用。（B）流式檢測(cè)同時(shí)轉(zhuǎn)入PA/PB2的COS-1細(xì)胞及單轉(zhuǎn)入PA-VC的細(xì)胞的Venus熒光信號(hào)，顯示轉(zhuǎn)入24小時(shí)后的熒光強(qiáng)度。（C）螢火蟲(chóng)熒光蛋白酶顯示，轉(zhuǎn)入單或雙質(zhì)粒的細(xì)胞，螢火蟲(chóng)熒光蛋白酶活性一致。

BiFC研究信號(hào)傳導(dǎo)通路中蛋白質(zhì)間的相互作用

摘自：Characterizationofthelatentmembraneprotein1signalingcomplexofEpstein-Barrvirusinthemembraneofmammaliancellswithbimolecularfluorescencecomplementation

PoojaTalaty,AmandaEmery,etal.VirologyJournal2011,8:414

圖釋?zhuān)毫魇郊?xì)胞儀FACSLSRII檢測(cè)BiFC信號(hào)。LMP1-NYFP和LMP1-NYFP突變體分別與CYFP-TRAF2、CYFP-TRAF3轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)其相互作用。曲線(xiàn)藍(lán)色部分為出現(xiàn)YFP的熒光陽(yáng)性表達(dá)，表明LMP1與CYFP、CYFP均存在相互作用。科普一下SCI

《科學(xué)引文索引》（ScienceCitationIndex,簡(jiǎn)稱(chēng)SCI）于1957年由美國(guó)科學(xué)信息研究所（InstituteforScientificInformation,簡(jiǎn)稱(chēng)ISI）在美國(guó)費(fèi)城創(chuàng)辦，是由美國(guó)科學(xué)信息研究所(ISI)1961年創(chuàng)辦出版的引文數(shù)據(jù)庫(kù)。SCI(科學(xué)引文索引)、EI(工程索引)、ISTP(科技會(huì)議錄索引)是世界著名的三大科技文獻(xiàn)檢索系統(tǒng)，是國(guó)際公認(rèn)的進(jìn)行科學(xué)統(tǒng)計(jì)與科學(xué)評(píng)價(jià)的主要檢索工具。

1976年，ISI在SCI基礎(chǔ)上引出期刊引用報(bào)告（journalcitationreport,JCR），提供了一套統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，展示科學(xué)期刊被引用情況、發(fā)表論文數(shù)量以及論文的平均被引用情況。在JCR中可以計(jì)算出每種期刊的影響因子（ImpactFactor,IF）。影響因子的高低，在一定程度上可以反應(yīng)一個(gè)期刊的影響力。

（百度百科）

期刊的影響因子(Impactfactor；IF)計(jì)算方式：

IF2014=(該雜志2012-2013年發(fā)表文章在2014年被引用的次數(shù)/

(該雜志2012-2013年發(fā)表文章的總數(shù))

附件是最近兩年的SCI期刊列表，2014年植物學(xué)類(lèi)我紅色標(biāo)注了部分，不過(guò)期刊名都是縮寫(xiě)，2013年的是全稱(chēng)期刊名。影響因子從高到低排列，大體代表了期刊的水平檔次。

三大國(guó)際頂尖期刊CNS，指CELL，NATURE，SCIENCE。

國(guó)際植物學(xué)專(zhuān)業(yè)期刊中，最好的研究論文期刊是PlantCell（IF2004=9.338），當(dāng)然今年新創(chuàng)刊的NATUREPLANTS估計(jì)不久的