動物生理學(xué)實驗三 魚類血液涂片制作與血細胞計數(shù)課件

血液：是一種由血漿和血細胞組成的流體組織，由心臟搏動推動在心血管系統(tǒng)中不斷循環(huán)流動，具有運輸、防御和免疫、維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定和參與體液調(diào)節(jié)等多種功能。

血液具有維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用，正常情況下血液中的的各項生理指標(biāo)處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，同時各項指標(biāo)也能夠反映一個生物個體的健康程度，因而血液檢測已成為疾病檢測最基本的技術(shù)。多種多樣的血液檢測儀血液檢測能夠輔助疾病診斷血液涂片技術(shù)在水產(chǎn)動物疾病檢測過程中也有非常重要的作用，比如細菌感染、病毒感染以及血液寄生蟲疾病的檢測。目前該技術(shù)已成為水產(chǎn)技術(shù)從業(yè)人員的必備技能，也是執(zhí)業(yè)資格考試的重點內(nèi)容。

涂片經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色液染色后，相應(yīng)各類細胞呈現(xiàn)不同的著色，從而達到辨別其形態(tài)特征的目的。一般細胞的細胞核嗜堿性，能被堿性燃料染成藍色，而細胞質(zhì)基質(zhì)嗜酸性，能被酸性燃料染成紅色。2、血液的采集將準(zhǔn)備好的2mL注射器，抽動活塞用肝素鈉溶液將注射器內(nèi)濕潤，為血液的采集做好準(zhǔn)備工作。血液的采集按實驗2的采血方法進行，采好的血液保存于1.5mL離心管中待用。3、推片取一塊邊緣光滑的載片做推片。將其一端刮取血滴，迅速使血液均勻分散在推片與載片的接觸處。然后使推片與載片呈30°～40°，向另一端平穩(wěn)地推出，涂片推好后，放置于空氣中使之自然干燥。（1）將采出的血液滴在載片上

（2）另一張邊緣光滑的雙凹片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀。

（3）兩玻片的角度以30-45°為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進，即涂成血液薄膜。（4）血涂片4、血涂片染色先將干燥血片用甲醇固定3-5分鐘，將固定的血片置于被pH6.4-6.8磷酸鹽緩沖液稀釋10-20倍的吉姆薩染液中，浸染5分鐘（標(biāo)本較少可用滴染法），取出用蒸餾水沖洗，再用伊紅復(fù)染1分鐘，用蒸餾水沖洗，待干后鏡檢。沖洗后滴加少量伊紅，染色1分鐘直接流水沖洗1分鐘（切勿先倒掉染液）涂片經(jīng)水洗干燥后鏡檢涂片干燥后加吉姆薩染液染色5分鐘

1、血液稀釋用10微升移液槍取10微升血液于一新的1.5mL離心管中，再用1000微升移液槍吸990微升生理鹽水于離心管中（稀釋100倍），輕輕顛倒混勻。2、計數(shù)板處理用無水乙醇或95%乙醇溶液擦拭計數(shù)板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計數(shù)板上面。3、充液取干凈的計數(shù)板平放于實驗桌上，將蓋玻片置入計數(shù)板正中央。用毛細血管吸取已稀釋混勻后的血細胞懸浮液，并將管尖輕輕斜置于蓋玻片邊緣，讓血細胞懸液緩慢流出，借毛細管現(xiàn)象而自動流入計數(shù)室內(nèi)。

4、靜置血細胞懸液充入計數(shù)室后，靜置2～3分鐘，待細胞不再浮動后，于低倍鏡下觀察計數(shù)室內(nèi)待計數(shù)的血細胞分布是否均勻，分布均勻者，方可計數(shù)。

5、按圖計算計數(shù)板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內(nèi)的細胞數(shù)。計數(shù)時，只計數(shù)完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計下線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。6、計算計完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0.01cm2，高為0.01cm，這樣它的體積為0.0001cm3，即0.1mm3。由于1ml＝1000mm3，所以每一大方格內(nèi)細胞數(shù)×10000＝細胞數(shù)/ml，故可按下式計算：細胞懸液細胞數(shù)/ml＝4個大格細胞總數(shù)/4×10000

如計數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。4．移液槍的使用要按規(guī)定使用，使用時不要過力按壓移液槍，用完后要將量程回到移液槍的最大量程處。5．鏡下計數(shù)時，若方格中細胞分布明顯不均，說明細胞懸液混合不均勻，需重新將細胞懸液進行混合