細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理

親和免疫組化技術(shù)(Affinitycytochemistryhistochemistrytechnique)親和免疫組化技術(shù)1親和的概念物質(zhì)之間具有的高度結(jié)合力,包括抗原與抗體生物素與抗生物素(又稱親和素)、葡萄球菌A蛋白與lgG、植物凝集素與糖類、陽離子與陰離子、激素與受體之間的結(jié)合反應(yīng)等親和的概念2第“節(jié)生物素一親和素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)基本原理(一)生物素(Biotin)與親和素卵白素抗生物素(Avidin/anti-Botn)之間有很強(qiáng)的親和力二)生物素和親和素具有與其它示蹤物質(zhì)如熒光素和過氧化物酶等相結(jié)合的能力第“節(jié)生物素一親和素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)3種經(jīng)典的抗生物素一生物素染色法)ABc(AvidinBiotin-peroxidaseComplex)技術(shù)(二)LAB(LabelledAvidin-Biotin)技術(shù)(=)LSAB(labeledstreptavidinbiotinmethod):SP(streptavidin-peroxidase)技術(shù)SABc(streptavidin-biotincomplex)技術(shù)(四)BRAB(BridgedAvidin-Biotin)技術(shù)(五)cSA(Catalyzedsignalamplification)法(六)Envision技術(shù)種經(jīng)典的抗生物素一生物素染色法4C親和素生物素過氧化物酶(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)技術(shù)1.基本原理標(biāo)生物紫多生物素化二抗一抗ABC法示意圈C親和素生物素過氧化物酶52、操作步驟(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,冰凍切片經(jīng)冷丙酮固定,用PBS洗;(2)用3%H202甲醇液室溫作用20min后,充分水洗(3)PBS洗,加牛血清白蛋白或二抗動物種屬正常血清15min(4)加第一抗體(即用型或濃縮型)4℃過夜或37℃1h;(5)PBs洗,加生物素化第二抗體37℃30min;(6)PBS洗,加ABC復(fù)合物(1:100,使用前30mn將等量的親和素和酶標(biāo)生物素混合,稀釋配制成ABC復(fù)合物),37℃20mn(7)PBS洗,經(jīng)DABH22顯色(8)常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封固。2、操作步驟63、ABC法的優(yōu)點(diǎn)(1)敏感性高:結(jié)合力強(qiáng),分子量小(2)特異性強(qiáng),背景染色淡;(3)方法簡便,節(jié)約時間(4)由于生物素與抗生物素具有與多種標(biāo)記物結(jié)合的能力,可用于雙重或多重免疫染色。3、ABC法的優(yōu)點(diǎn)7標(biāo)泡生物素抗生物素技術(shù)(LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技術(shù))基本原理以生物素標(biāo)記抗體作第一抗體,酶標(biāo)記抗生物素作為第二抗體,同SP技術(shù)Figure11:IntheLABorLSABtchnology,theenzymeLabelledstreptavidinreactswitnthebiounyatedsecondaryandbodyLAB法示意圖標(biāo)泡生物素抗生物素技術(shù)82、操作步驟(1)①④步驟與ABC法相同;(5)PBS洗后加生物素標(biāo)記第一抗體37℃3min(6)PBS洗后加酶標(biāo)親和素(如HRP-Avidin)37℃30min:(7)以下步驟同ABC法。2、操作步驟9三LsAB(labeledstreptavidinbiotin)技術(shù):SP(streptavidin-peroxidase)技術(shù)SABC(streptavidin-biotincomplex)技術(shù)、基本原理AgAgP方法示意圖SABC示意圖三LsAB(labeledstreptavidinbi10細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理11細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理12細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理13細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理14細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理15細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理16細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理17細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理18細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理19細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理20細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理21細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理22細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理23細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理24細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理25細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理26細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理27細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理28細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理29細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理30細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理31細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理32細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理33細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理34細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理35細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理36細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理37細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理38細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理39親和免疫組化技術(shù)(Affinitycytochemistryhistochemistrytechnique)親和免疫組化技術(shù)40親和的概念物質(zhì)之間具有的高度結(jié)合力,包括抗原與抗體生物素與抗生物素(又稱親和素)、葡萄球菌A蛋白與lgG、植物凝集素與糖類、陽離子與陰離子、激素與受體之間的結(jié)合反應(yīng)等親和的概念41第“節(jié)生物素一親和素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)基本原理(一)生物素(Biotin)與親和素卵白素抗生物素(Avidin/anti-Botn)之間有很強(qiáng)的親和力二)生物素和親和素具有與其它示蹤物質(zhì)如熒光素和過氧化物酶等相結(jié)合的能力第“節(jié)生物素一親和素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)42種經(jīng)典的抗生物素一生物素染色法)ABc(AvidinBiotin-peroxidaseComplex)技術(shù)(二)LAB(LabelledAvidin-Biotin)技術(shù)(=)LSAB(labeledstreptavidinbiotinmethod):SP(streptavidin-peroxidase)技術(shù)SABc(streptavidin-biotincomplex)技術(shù)(四)BRAB(BridgedAvidin-Biotin)技術(shù)(五)cSA(Catalyzedsignalamplification)法(六)Envision技術(shù)種經(jīng)典的抗生物素一生物素染色法43C親和素生物素過氧化物酶(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)技術(shù)1.基本原理標(biāo)生物紫多生物素化二抗一抗ABC法示意圈C親和素生物素過氧化物酶442、操作步驟(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,冰凍切片經(jīng)冷丙酮固定,用PBS洗;(2)用3%H202甲醇液室溫作用20min后,充分水洗(3)PBS洗,加牛血清白蛋白或二抗動物種屬正常血清15min(4)加第一抗體(即用型或濃縮型)4℃過夜或37℃1h;(5)PBs洗,加生物素化第二抗體37℃30min;(6)PBS洗,加ABC復(fù)合物(1:100,使用前30mn將等量的親和素和酶標(biāo)生物素混合,稀釋配制成ABC復(fù)合物),37℃20mn(7)PBS洗,經(jīng)DABH22顯色(8)常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封固。2、操作步驟453、ABC法的優(yōu)點(diǎn)(1)敏感性高:結(jié)合力強(qiáng),分子量小(2)特異性強(qiáng),背景染色淡;(3)方法簡便,節(jié)約時間(4)由于生物素與抗生物素具有與多種標(biāo)記物結(jié)合的能力,可用于雙重或多重免疫染色。3、ABC法的優(yōu)點(diǎn)46標(biāo)泡生物素抗生物素技術(shù)(LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技術(shù))基本原理以生物素標(biāo)記抗體作第一抗體,酶標(biāo)記抗生物素作為第二抗體,同SP技術(shù)Figure11:IntheLABorLSABtchnology,theenzymeLabelledstreptavidinreactswitnthebiounyatedsecondaryandbodyLAB法示意圖標(biāo)泡生物素抗生物素技術(shù)472、操作步驟(1)①④步驟與ABC法相同;(5)PBS洗后加生物素標(biāo)記第一抗體37℃3min(6)PBS洗后加酶標(biāo)親和素(如HRP-Avidin)37℃30min:(7)以下步驟同ABC法。2、操作步驟48三LsAB(labeledstreptavidinbiotin)技術(shù):SP(streptavidin-peroxidase)技術(shù)SABC(streptavidin-biotincomplex)技術(shù)、基本原理AgAgP方法示意圖SABC示意圖三LsAB(labeledstreptavidinbi49細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理50細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理51細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理52細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理53細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理54細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理55細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理56細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理57細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理58細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理59細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理60細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理61細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理62細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理63細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理64細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理65細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理66細(xì)胞貼片免疫組化染色步驟課件整理67