葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理

葡萄球菌腸毒素C的純化研究主講人鮑行豪研究人員:鮑行豪夏占強(qiáng)藍(lán)明玉葡萄球菌腸毒素C1培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液三、用DEAE纖維素(系Pharmacia品)柱層析作第一步提取四、用Sephadexg-75分子篩層析柱進(jìn)一步純化五、純化前后SETC的SDS鑒定■六、純化后的SETC分子量測(cè)定■七、對(duì)SETC純化品的N末端氨基酸測(cè)定培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選2前言■為了檢測(cè)“金葡素”制劑中有效成份葡萄球菌腸毒素C(SETC),我們對(duì)提純SETC方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。經(jīng)多次試驗(yàn),認(rèn)為按四部法提取SET-C能獲得較好效果,并對(duì)SETC的某些生物學(xué)特性作了探索?，F(xiàn)總結(jié)如下前言3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選我們比較了豬心胨湯(原生產(chǎn)“金葡素”用培養(yǎng)基)、酶解豬心湯和胰酪胨綜合培養(yǎng)基,接種復(fù)壯后種子液,以靜置與搖瓶(156r/min)種方式作48小時(shí)培養(yǎng),取出以高速離心法除去菌細(xì)胞,再用0.45um微孔濾膜過(guò)濾除去殘存菌,取其無(wú)菌濾液用反相膠乳凝集試驗(yàn)(RPLA)測(cè)SETC含量培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選4結(jié)果證明:胰酪胨綜合培養(yǎng)以搖瓶培養(yǎng)金黃色葡萄球菌,其產(chǎn)生SET-C最高。因此,我們?cè)谧鱏ET-C提純時(shí)就決定采用胰酪胨綜合培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)方式來(lái)制備腸毒素原液。結(jié)果證明:胰酪胨綜合培養(yǎng)以搖5二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液采用中科院上海原子核研究所裝配的POST-FLOTMⅡ型流動(dòng)循環(huán)超濾泵,以10000dalton超濾膜對(duì)腸毒素原液進(jìn)行截留濃縮,除去原液中水份及10000dalton以下的小分子物質(zhì),使原液濃縮達(dá)20倍以上,離心除沉淀,取其上清,經(jīng)透析作為純化SET-C的原液。二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液6用DEAE纖維素(系Pharmacia產(chǎn)品)柱層析作第一步提取般要求DEAE纖維素40~100目,臨用前過(guò)篩,再以蒸餾水漂洗,去除細(xì)微粒子。用1%NaoH和和1%HCL交替處理后直至洗滌液呈中性。再用0.01mo/LPH54PB沖洗平衡,裝柱。柱大小為4.1×42cm。裝柱時(shí)切忌氣泡進(jìn)入,裝好柱后用同一PB緩慢洗滌使整個(gè)柱內(nèi)達(dá)到平衡,然后上樣。用DEAE纖維素(系Pharmacia7將上一步濃縮透析過(guò)的SETC原液緩慢加入使全部入柱后。先用PH5.00.01mo/LPB洗滌,使有色液體流盡。其后作分管收集,每10分鐘收集一管,其量為7.5ml,對(duì)收集液逐管在OD28onm紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)蛋白峰出現(xiàn)管數(shù)。將上一步濃縮透析過(guò)的SETC8其后相繼換用PH66、0.06molLPB和PH68,0.2mo/LPB分步洗脫,洗速為45m/hr,每管仍用OD230m紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)洗脫液蛋白吸收峰。并對(duì)各峰洗脫液合并,再用反相膠乳凝集試驗(yàn)(RPLA)檢測(cè)是否有SET-C存在,合并蛋白峰。收集結(jié)果證明SET-C在第Ⅱ峰,結(jié)果見(jiàn)圖1,并對(duì)Ⅱ峰用PEG濃縮至一定量,提供下一步純其后相繼換用PH66、0.06molLPB90.80.70.60.30.2收集管數(shù)■圖1:用DEAE纖維素層析結(jié)果0.810葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理11葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理12葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理13葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理14葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理15葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理16葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理17葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理18葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理19葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理20葡萄球菌腸毒素C的純化研究主講人鮑行豪研究人員:鮑行豪夏占強(qiáng)藍(lán)明玉葡萄球菌腸毒素C21培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液三、用DEAE纖維素(系Pharmacia品)柱層析作第一步提取四、用Sephadexg-75分子篩層析柱進(jìn)一步純化五、純化前后SETC的SDS鑒定■六、純化后的SETC分子量測(cè)定■七、對(duì)SETC純化品的N末端氨基酸測(cè)定培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選22前言■為了檢測(cè)“金葡素”制劑中有效成份葡萄球菌腸毒素C(SETC),我們對(duì)提純SETC方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。經(jīng)多次試驗(yàn),認(rèn)為按四部法提取SET-C能獲得較好效果,并對(duì)SETC的某些生物學(xué)特性作了探索。現(xiàn)總結(jié)如下前言23培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選我們比較了豬心胨湯(原生產(chǎn)“金葡素”用培養(yǎng)基)、酶解豬心湯和胰酪胨綜合培養(yǎng)基,接種復(fù)壯后種子液,以靜置與搖瓶(156r/min)種方式作48小時(shí)培養(yǎng),取出以高速離心法除去菌細(xì)胞,再用0.45um微孔濾膜過(guò)濾除去殘存菌,取其無(wú)菌濾液用反相膠乳凝集試驗(yàn)(RPLA)測(cè)SETC含量培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)選24結(jié)果證明:胰酪胨綜合培養(yǎng)以搖瓶培養(yǎng)金黃色葡萄球菌,其產(chǎn)生SET-C最高。因此,我們?cè)谧鱏ET-C提純時(shí)就決定采用胰酪胨綜合培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)方式來(lái)制備腸毒素原液。結(jié)果證明:胰酪胨綜合培養(yǎng)以搖25二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液采用中科院上海原子核研究所裝配的POST-FLOTMⅡ型流動(dòng)循環(huán)超濾泵,以10000dalton超濾膜對(duì)腸毒素原液進(jìn)行截留濃縮,除去原液中水份及10000dalton以下的小分子物質(zhì),使原液濃縮達(dá)20倍以上,離心除沉淀,取其上清,經(jīng)透析作為純化SET-C的原液。二、用分子截留方法濃縮腸毒素原液26用DEAE纖維素(系Pharmacia產(chǎn)品)柱層析作第一步提取般要求DEAE纖維素40~100目,臨用前過(guò)篩,再以蒸餾水漂洗,去除細(xì)微粒子。用1%NaoH和和1%HCL交替處理后直至洗滌液呈中性。再用0.01mo/LPH54PB沖洗平衡,裝柱。柱大小為4.1×42cm。裝柱時(shí)切忌氣泡進(jìn)入,裝好柱后用同一PB緩慢洗滌使整個(gè)柱內(nèi)達(dá)到平衡,然后上樣。用DEAE纖維素(系Pharmacia27將上一步濃縮透析過(guò)的SETC原液緩慢加入使全部入柱后。先用PH5.00.01mo/LPB洗滌,使有色液體流盡。其后作分管收集,每10分鐘收集一管,其量為7.5ml,對(duì)收集液逐管在OD28onm紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)蛋白峰出現(xiàn)管數(shù)。將上一步濃縮透析過(guò)的SETC28其后相繼換用PH66、0.06molLPB和PH68,0.2mo/LPB分步洗脫,洗速為45m/hr,每管仍用OD230m紫外分光自動(dòng)檢測(cè)儀測(cè)洗脫液蛋白吸收峰。并對(duì)各峰洗脫液合并,再用反相膠乳凝集試驗(yàn)(RPLA)檢測(cè)是否有SET-C存在,合并蛋白峰。收集結(jié)果證明SET-C在第Ⅱ峰,結(jié)果見(jiàn)圖1,并對(duì)Ⅱ峰用PEG濃縮至一定量,提供下一步純其后相繼換用PH66、0.06molLPB290.80.70.60.30.2收集管數(shù)■圖1:用DEAE纖維素層析結(jié)果0.830葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理31葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課件整理32葡萄球菌腸毒素C純化探究總結(jié)課