拉米夫啶耐藥及實驗室檢測

慢性乙肝診斷與治療中的分子指標(biāo)楊志軍乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中國有1.2億人感染，其中每年約有1-2%會出現(xiàn)肝硬化或肝癌而死亡HBV病毒顆粒感染肝細胞及DNA復(fù)制過程慢性乙肝的診斷HBsAg持續(xù)陽性6個月以上HBV-DNA高于105拷貝/毫升ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高慢性乙肝的分類HBeAg陽性乙肝：HBsAg、HBeAg陽性；HBV-DNA高于105拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高HBeAg陰性乙肝：HBsAg、anti-HBe陽性；HBV-DNA高于104拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高診斷慢性乙肝的指標(biāo)生化指標(biāo)：ALT免疫學(xué)指標(biāo)：HBsAg（攜帶指標(biāo)）、HBeAg（活動指標(biāo)）病毒學(xué)指標(biāo)：HBV-DNAHBeAg陰性乙肝缺乏病毒活動的免疫學(xué)指標(biāo)，前S1可以彌補這一缺憾，提供HBeAg陰性乙肝患者病毒活動的免疫學(xué)指標(biāo)HBV-DNA檢測的基本要求雖然國內(nèi)HBV-DNA檢測都用實時熒光PCR法，但不同廠家的產(chǎn)品定量標(biāo)準(zhǔn)的賦值有差異，從而導(dǎo)致定量結(jié)果的差異，而準(zhǔn)確的定量結(jié)果直接影響到對病人的診斷以及治療方案的選擇復(fù)星HBV-DNA試劑是國內(nèi)唯一一個經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品溯源的產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)品直接用國家標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)，從而保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，能夠為慢性乙肝患者的診斷和治療提供更為客觀的依據(jù)慢性乙肝治療的長期目標(biāo)防止發(fā)展成為肝硬化或肝細胞癌在臨床上，往往以比較現(xiàn)實的短期目標(biāo)來代替長期目標(biāo)慢性乙肝治療的短期目標(biāo)病毒抑制：表現(xiàn)為HBeAg血清轉(zhuǎn)換和HBV-DNA陰轉(zhuǎn)肝損傷程度降低：表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常完全清除病毒：表現(xiàn)為HBsAg消失，HBsAb出現(xiàn)，血清和肝細胞中檢測不到HBV-DNA從目前水平來看，不可能完全清除病毒治療慢性乙肝的藥物免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、PEG干擾素、胸腺肽核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等拉米夫定治治療與轉(zhuǎn)氨氨酶濃度拉米夫定治治療一年后后的HBeAg陰轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)率和HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率率：ALT濃度度低于2倍倍正常值高高限：5%ALT濃度度介于2-5倍正常常值高限：：26%ALT濃度度高于5倍倍正常值高高限：64%HBV-DNA定量量檢測的臨臨床應(yīng)用慢性乙肝診診斷治療監(jiān)測和和療效評價價跟蹤隨訪預(yù)后判斷HBV-DNA定量量—慢慢性乙肝的的診斷HBsAg陽性六個個月以上ALT持續(xù)續(xù)升高或反反復(fù)升高HBV-DNA大于于105拷貝/毫升升（HBeAg陽性性）或104拷貝/毫升升（HBeAg陰性性）HBV-DNA定量量—抗抗病毒治療療的條件ALT高于于2×ULN（正常常值上限））HBV-DNA大于于105拷貝/毫升升（HBeAg陽性性）或104拷貝/毫升升（HBeAg陰性性）ATL持續(xù)續(xù)正常的患患者可暫不不進行治療療，每隔3-6個月月隨訪肝功功能、血清清病毒學(xué)標(biāo)標(biāo)志物和進進行肝細胞胞肝癌監(jiān)測測ALT水平平在1-2倍ULN之間，需需根據(jù)具體體情況(如如肝活檢結(jié)結(jié)果等)，，在告知知患者治療療的利與弊弊、了解患患者配合程程度的前提提下，決定定是否實施施治療。無無論治療與與否均應(yīng)密密切隨訪，，為治療提提供更為科科學(xué)的根據(jù)據(jù)HBV-DNA定量量—慢慢性乙肝的的治療監(jiān)測測治療前檢測測患者的基基線水平（（ALT、、HBV-DNA））治療開始后后前三個月月每月一次次、以后每每三個月一一次檢測ALT、HBV-DNA，對對于HBeAg陽性性患者，還還需檢測HBeAg如果治療期期間HBV-DNA水平降低低兩個數(shù)量量級，可以以認為治療療有效HBV-DNA定量量—療療效評價（（1）生化學(xué)應(yīng)答答：完全應(yīng)應(yīng)答：2次次監(jiān)測ALT均復(fù)常常(間隔1個月)；；無應(yīng)答：：ALT未未恢復(fù)正常常。值得注注意的是評評價生化學(xué)學(xué)應(yīng)答時應(yīng)應(yīng)排除其他他藥物或疾疾病對ALT升高或或下降的影影響HBV-DNA定量量—療療效評價（（2）病毒學(xué)應(yīng)答答：完全應(yīng)應(yīng)答按所采采用的HBVDNA檢測方方法說明書書上提供的的實驗敏感感性和檢測測范圍確定定，臨床上上一般認為為采用國際際公認的檢檢測方法或或敏感性相相當(dāng)?shù)臋z測測方法檢測測HBVDNA定定量<105拷貝/毫升升或斑點雜雜交法陰性性為完全應(yīng)應(yīng)答；部分分應(yīng)答為未未達完全應(yīng)應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)但但HBVDNA載載量下降大大于2個對對數(shù)級；無無應(yīng)答為未未達上述標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)HBV-DNA定量量—療療效評價（（3）血清免疫學(xué)學(xué)應(yīng)答：完完全應(yīng)答為為HBeAg/抗HBe血清清轉(zhuǎn)換；部部分應(yīng)答為為HBeAg陰轉(zhuǎn)但但未出現(xiàn)抗抗HBe；；無應(yīng)答為為未達上述述標(biāo)準(zhǔn)。HBV-DNA定量量—綜綜合療效評評價（1））完全應(yīng)答為為療程結(jié)束束時，生化化學(xué)、病毒毒學(xué)和血清清免疫學(xué)所所有指標(biāo)均均達到完全全應(yīng)答HBV-DNA定量量—綜綜合療效評評價（2））部分應(yīng)答為為療程結(jié)束束時，生化化學(xué)、病毒毒學(xué)和血清清免疫學(xué)指指標(biāo)介于完完全應(yīng)答和和無應(yīng)答之之間HBV-DNA定量量—綜綜合療效評評價（3））無應(yīng)答為療療程結(jié)束時時，生化學(xué)學(xué)、病毒學(xué)學(xué)和血清免免疫學(xué)指標(biāo)標(biāo)均為無應(yīng)應(yīng)答HBeAg陰性伴HBVDNA活躍躍復(fù)制的慢慢性乙型肝肝炎患者不不進行血清清免疫學(xué)應(yīng)應(yīng)答評價，，但應(yīng)進行行生化學(xué)和和病毒學(xué)指指標(biāo)的療效效評價HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（1））治療前HBeAg陽陽性的患者者，治療1年時綜合合療效達到到完全應(yīng)答答者建議至至少繼續(xù)用用藥6個月月，期間每每3個月1次復(fù)查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)續(xù)完全應(yīng)答答者可停藥藥觀察HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（2））治療前HBeAg陽陽性的患者者，治療1年時綜合合療效達到到部分應(yīng)答答者建議繼繼續(xù)用藥直直至達到完完全應(yīng)答后后，再繼續(xù)續(xù)用藥至少少6個月，，期間每3個月1次次復(fù)查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)續(xù)完全應(yīng)答答者可停藥藥觀察HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（3））治療前HBeAg陽陽性患者治治療1年時時綜合療效效仍無應(yīng)答答可停藥觀觀察，或改改用其他有有效的抗病病毒藥治療療。對于有有肝臟組織織學(xué)檢查等等其它臨床床指征顯示示病情進展展合并肝功功能失代償償或肝硬化化的病人，，不宜輕易易停藥，并并應(yīng)加強對對癥保肝治治療HBV-DNA定量量—何何時可以停停藥（4））HBeAg陰性伴HBVDNA活躍躍復(fù)制的慢慢性乙型肝肝炎患者，，綜合療效效完全應(yīng)答答者療程至至少2年；；對于完成成1年治療療仍無應(yīng)答答者可改用用或加用其其他有效治治療方案案HBV-DNA定量量—治治療后的隨隨訪無論有否治治療應(yīng)答，，都應(yīng)對患患者定期隨隨訪。建議議停藥后的的前3個月月每月1次次、以后每每3～6個個月1次檢檢測ALT、AST、HBV血清標(biāo)志志物和HBVDNA，以及及臨床表現(xiàn)現(xiàn)和不良反反應(yīng)。隨訪訪至少6-12個月月。如病情情有變化，，可隨時隨隨訪。HBV拉米米夫定耐藥藥雖然拉米夫夫定治療慢慢性乙肝療療效顯著，，但長期使使用拉米夫夫定會出現(xiàn)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象象使用一年、、二年、三三年、四年年的耐藥比比率為：15-32%、38%、56%、67%一旦出現(xiàn)拉拉米夫定耐耐藥突變（（YMDD變異），，大多數(shù)患患者會在2-4個月月之內(nèi)出現(xiàn)現(xiàn)HBV-DNA和和ALT反反彈YMDD變變異檢測采用實時熒熒光定量PCR方法法，不僅能能夠檢測出出現(xiàn)的突變變類型（YVDD或或YIDD），而且且能夠確定定突變株所所占比例，，對及時調(diào)調(diào)整治療方方案具有非非常重要的的意義能夠準(zhǔn)確穩(wěn)穩(wěn)定的檢測測到1%的的突變株，，能夠更早早發(fā)現(xiàn)耐藥藥突變，盡盡早調(diào)整治治療方案HBV拉拉米夫定耐藥藥突變檢測測試劑原理理PrimerFPrimer

FPrimer

FProbeProbeProbePrimer

HBVPrimer

YIDDPrimer

YVDDHBV檢測測I突變檢測測V突變檢測測YMDD的的定量檢測測采用選擇性性引物，基基于TaqMan實實時PCR技術(shù)，在在三個平行行反應(yīng)中分分別擴增總總HBV(C管）、、YIDD（I管））、YVDD（V管管），根據(jù)據(jù)管間Ct值差異計計算突變毒毒株在病毒毒群體中的的比例YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測YMDD的的定量檢測測與其它方法法的比較Comparisonofresultsobtainedbysequencing,pyrosequencingandreal-timePCRTypes Sequencingpyrosequencingreal-timePCRrtM204 25(36%)24(35%)23(33%)rtM204I26(38%)24(35%) 21(30%)rtM204V18(26%)19(27%) 20(29%)rtM204I+rtM204V 02(3%)5(8%)YMDD變變異定性判判斷的臨界界值定性判斷：：ΔCt<3.5，此時病毒毒群體中突突變株比例例大于10%與測序法比比較，15例標(biāo)本結(jié)結(jié)果完全符符合YMDD變變異定性判判斷的臨界界值Wangetal,WJG,12:1308-1311什么時候開開始檢測YMDD變變異拉米夫定治治療過程中中YMDD變異情況況治療時間HBVDNA大于104copies/ml例數(shù)YMDD變異例數(shù)數(shù)*<6個月月 61（（17%））6~12個個月2614（54%）12~24個月3826（（68%））24~36個月3838（（100%）*各組之之間兩兩比比較均有顯顯著差異（（P<0.05）。。YMDD變變異株的動動態(tài)變化YMDD變變異株的動動態(tài)變化YMDD檢檢測試劑——應(yīng)用方法法對接受拉米米夫定治療療的慢性乙乙肝患者進進行耐藥監(jiān)監(jiān)測治療前檢測測一次（約約有10-20%的的人在治療療前就有YMDD變變異）治療療開開始始后后第第七七個個月月開開始始，，每每三三個個月月檢檢測測一一次次慢性性乙乙肝肝的的基基因因分分型型乙肝肝病病毒毒分分八八個個基基因因型型：：根根據(jù)據(jù)基基因因組組序序列列的的差差異異可可以以分分為為A～～H八八種種亞亞型型，，我我國國以以B型型（（41%））和和C型型（（53%））為為主主不同同基基因因型型病病毒毒感感染染的的病病程程和和后后果果不不同同：：C型型對對肝肝的的損損傷傷比比B型型嚴(yán)嚴(yán)重重，，基基因因型型C比比基基因因型型B更更容容易易發(fā)發(fā)展展成成為為肝肝硬硬化化不同同的的基基因因型型對對藥藥物物的的應(yīng)應(yīng)答答也也不不一一樣樣：：基基因因型型B比比基基因因型型C對對干干擾擾素素治治療療的的應(yīng)應(yīng)答答率率高高HBV基基因因分分型型PCR檢檢測測試試劑劑運用用多多重重、、多多色色實實時時PCR技術(shù)術(shù)，，分分別別對對乙乙肝肝病病毒毒（（HBV））各各種種基基因因型型序序列列進進行行分分析析根據(jù)據(jù)國國內(nèi)內(nèi)HBV基因因型型的的特特點點，，設(shè)設(shè)計計能能檢檢測測HBVA~D四種種基基因因型型特特異異性性引引物物及及探探針針研制制開開發(fā)發(fā)具具有有自自主主知知識識產(chǎn)產(chǎn)權(quán)權(quán)的的乙乙肝肝病病毒毒（（HBV））基基因因分分型型多多重重、、多多色色實實時時PCR檢檢測測試試劑劑盒盒HBV基基因因分分型型——結(jié)結(jié)果果判判斷斷方方法法B管（Ct<36）B管（Ct≥36）C管（Ct<36）B型、C型HBV復(fù)合感染2C型HBVC管（Ct≥36）B型HBV非B非C型，或HBV（-）HBV基基因因分分型型——分分型型識識別別率率分型型識識別別率率＝＝（（12+22））/35＝＝97％％樣本數(shù)百分比B型1234%C型2263%未檢出13%總計35100%HBV基基因因分分型型——分分型型靈靈敏敏度度（（1））HBVB型型血血清清樣樣本本靈敏敏度度約約在在2××103IU/mlHBV基基因因分分型型——分分型型靈靈敏敏度度（（2））HBVC型型血血清清樣樣本本靈敏敏度度約約在在1××103IU/ml共價價閉閉合合環(huán)環(huán)狀狀DNA(cccDNA)檢檢測測HBVcccDNA是乙乙肝肝病病毒毒前前基基因因組組RNA復(fù)制制的的原原始始模模板板只有有徹徹底底清清除除了了cccDNA，，乙乙肝肝的的治治療療才才能能算算真真正正有有效效HBVcccDNA可可作作為為評評價價抗抗病病毒毒治治療療效效果果新新的的有有效效指指標(biāo)標(biāo)HBVcccDNAPCR檢檢測測試試劑劑運用用實實時時PCR技技術(shù)術(shù)，，根根據(jù)據(jù)乙乙肝肝病病毒毒共共價價閉閉合合環(huán)環(huán)狀狀DNA（（cccDNA））和和雙雙鏈鏈松松弛弛環(huán)環(huán)狀狀DNA（（rcDNA））分分子子結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)上上的的差差異異，，即即rcDNA負負鏈鏈上上的的缺缺口口和和正正鏈鏈的的不不完完整整性性，，設(shè)設(shè)計計一一對對特特異異性性cccDNA的的引引物物，，分分別別雜雜交交于于1500和和2100鄰鄰近近區(qū)區(qū)域域(以以EcoRI切切點點為為物物理理起起始始原原點點)，，同同時時設(shè)設(shè)計計一一條條雜雜交交于于負負鏈鏈3’’端端近近缺缺口口處處檢檢測測探探針針，，研研制制開開發(fā)發(fā)具具有有自自主主知知識識產(chǎn)產(chǎn)權(quán)權(quán)的的HBVcccDNA實實時時PCR檢檢測測試試劑劑盒盒。。HBVcccDNA檢檢測測試試劑劑原原理理rcDNA不能能被被擴擴增增無熒熒光光信信號號cccDNA能能被被擴擴增增檢測到到熒光光信號號P118201590+3200（1）EcoRIP2－EcoRI5‘+P23200(1)5‘3‘15903‘1820－P1阿德福福韋治治療乙乙型肝肝炎阿德福福韋為為5’-單磷磷酸脫脫氧阿阿糖腺腺苷類類似物物，可可明顯顯抑制制HBVDNA復(fù)復(fù)制HBeAg陽性性慢性性乙型型肝炎炎患者者，1、2、3年時時的耐耐藥發(fā)發(fā)生率率分別別為0%、、1.6%、3.1%HBeAg陰性性者1、2、3年的的耐藥藥發(fā)生生率分分別為為0%、3.0%、、5.9%~11%阿德福福韋耐耐藥突突變位位點rtN236T、rtA181V恩替卡卡韋治治療乙乙型肝肝炎拉米夫夫定耐耐藥的的病毒毒株對對恩替替卡韋韋敏感感性降降低8至30倍倍；發(fā)生YMDD變變異患患者治治療1年年時對對恩替替卡韋韋耐藥藥發(fā)生生率為為5.8%，并并出現(xiàn)現(xiàn)相關(guān)關(guān)的位位點變變異。。恩替卡卡韋耐耐