離子化方法課件

第三章、離子化方法思考題：樣品分子為什么首先要離子化才能進(jìn)行質(zhì)譜分析？樣品分子電離是質(zhì)譜測(cè)定的必要條件。只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。第三章、離子化方法思考題：1第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即M+eM+。+2e式中M為待測(cè)分子，M+。為分子離子或母體離子。第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法，是使用高能2Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectronPrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrye–Atomormoleculeishitbyhig3Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron

electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig4Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron

electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig5Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryThisenergy-richspecieseject6Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry

formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularione–+

?Thisenergy-richspecieseject7formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularionFengZhou,WenqingShui,YuLu,PengyuanYang*,andYinlongGuo*Somemoleculesundergoverylittlefragmentation只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。2mg/mL，(B)0.細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜（單張圖譜）Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scan第四節(jié)、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）MALDIAccessory-benchmarkdataelectronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculeUbiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute若m1>m2,則v1<v2間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖為什么APCI比較適合和LC、CE聯(lián)用？Delay(Pulsed)Extraction一、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）YuLu,FengZhou,WenqingShui,LipingBian,YinlongGuoandPengyuanYang*X-Ypositioningstage+cameraIR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等TargetplateThemoleculariondissociatestoacation

andaradical.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry+

?formingapositivelycharged,8 20 40 60 80 100 120m/zm/z=78100806040200Relative

intensitySomemoleculesundergoverylittlefragmentation

Benzeneisanexample.Themajorpeakcorrespondstothemolecularion. 20 40 60 80 100 120m/zm/z=9離子化方法課件10思考題：1.EI的應(yīng)用范圍2.EI的特點(diǎn)使用最廣泛，譜庫(kù)最完整；電離效率高；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便；分子離子峰強(qiáng)度較弱或不出現(xiàn)(因電離能量最高)。3.EI中通常的能量為多少？轟擊電子能量改變對(duì)質(zhì)譜的影響有哪些？4.為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會(huì)出現(xiàn)MH+，而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。5.EI適用于何種質(zhì)量分析器？思考題：11離子化方法課件12離子化方法課件13離子化方法課件14第二節(jié)、化學(xué)電離離子化

一、化學(xué)電離離子

二、自身化學(xué)電離離子化第二節(jié)、化學(xué)電離離子化

一、化學(xué)電離離子

15一、化學(xué)電離離子化（ChemicalIonization,CI）

化學(xué)電離源一般在1.3102～1.3103Pa。通過(guò)離子

-分子反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。試劑氣通常為甲烷CH4。首先用高能電子，使CH4電離產(chǎn)生CH5+和C2H5+，即：CH4+eCH4+·+2eCH4+·CH3++H·CH4+·和CH3+很快與大量存在的CH4分子起反應(yīng)，即：CH4+·+CH4CH5++CH3·

CH3++CH4C2H5++H2小量樣品（試樣與甲烷之比為11000）導(dǎo)入離子源，試樣分子（SH）發(fā)生下列反應(yīng)：CH5++SHSH2++CH4

C2H5++SHS++C2H6SH2+和S+然后可能碎裂，產(chǎn)生質(zhì)譜。一、化學(xué)電離離子化（ChemicalIonization,16PCI甲烷反應(yīng)機(jī)理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH3+MMM-H+CH5+CH3?CH4M+H+230eVPCI甲烷反應(yīng)機(jī)理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH317離子化方法課件18三、大氣壓激光解吸離子化CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrytransferoptics含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute[DHB+2Na-H]+形成單電荷離子對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響？表面原子數(shù)量多，表面活性高，碳納米管可以很好的分散樣品分子，來(lái)防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemolecule二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即Solventchargetransferredtoanalytes使用最廣泛，譜庫(kù)最完整；MALDI-TOF,DHBEI適用于何種質(zhì)量分析器？三、大氣壓激光解吸離子化（AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI）可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用，所以脂肪鏈越長(zhǎng)，信號(hào)越好，比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。2,5-二羥基苯甲酸（DHB)MultipoleionguidePCI三、大氣壓激光解吸離子化PCI19NCISpectraNCISpectra20思考題：1.什么情況下需要采用CI？2.CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？3.CI的用途4.比較CI和EI的靈敏度5.CI實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定是否容易？6.CI的局限性思考題：21二、自身化學(xué)電離離子化（Self-chemicalionization,SCI)FTMS和離子阱的內(nèi)離子源中出現(xiàn)的特殊方法。樣品分子本身在電子轟擊時(shí)產(chǎn)生CH5+、C2H5+、C3H7+等可提供質(zhì)子的碎片離子，通過(guò)增加離子在阱中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高它們和分子的碰撞幾率，提高M(jìn)H+的強(qiáng)度，以實(shí)現(xiàn)CI。二、自身化學(xué)電離離子化（Self-chemicalioni22紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖23離子化方法課件24離子化方法課件25乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫(kù)檢索結(jié)果

乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫(kù)檢索結(jié)果26烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖

烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖27離子化方法課件28第二節(jié)、化學(xué)電離離子化離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？2,5-二羥基苯甲酸（DHB)MALDI-TOFMS工作原理保護(hù)樣品，基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品，避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解；IR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？CH3++CH4C2H5++H2屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particleinducedionization),采用高能中型粒子（Ar）轟擊樣品典型的間歇電噴霧的總離子流圖添加金屬離子（如：NaCl、KCl、AgNO3)的目的？含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即[M+CH3CO]+/[CH3CO+]典型的間歇電噴霧的總離子流圖PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。1Million!Somemoleculesundergoverylittlefragmentation－－低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾典型的間歇電噴霧的總離子流圖第二節(jié)、化學(xué)電離離子化(b)連續(xù)電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖，信噪比的平均值為14.MALDI-TOF,DHB[Leu+2Na-H]+間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖保護(hù)樣品，基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品，避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解；二甲苯三個(gè)異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對(duì)強(qiáng)度只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scanIR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等Conditions:離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會(huì)出現(xiàn)MH+，而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。SCOUT100MALDIAccessory荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生Specification:PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryMALDIAccessory-benchmarkdata－－低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾（一）nanospray思考題：1.FTMS中SCI的特點(diǎn)？和CI相比有哪些優(yōu)勢(shì)？2.離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？3.MH+的強(qiáng)度和哪些因素有關(guān)？4.應(yīng)用范圍第二節(jié)、化學(xué)電離離子化典型的間歇電噴霧的總離子流圖思考題：29間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖

間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜30

二甲苯三個(gè)異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對(duì)強(qiáng)度

[M+H]+/CH3COH+CH3[M+CH3CO]+/[CH3CO+]間二甲苯11.361.54對(duì)二甲苯1.930.425鄰二甲苯0.348二甲苯三個(gè)異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相31第三節(jié)、快原子轟擊離子化（Fastatombombardment,FAB）屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particleinducedionization),采用高能中型粒子（Ar）轟擊樣品常用底物：G甘油NBA間硝基芐醇

第三節(jié)、快原子轟擊離子化（Fastatombombard32離子化方法課件33離子化方法課件34思考題：1.FAB和CI相比有何特點(diǎn)？2.添加金屬離子（如：NaCl、KCl、AgNO3)的目的？3.與活潑氫可以可以發(fā)生反應(yīng)的樣品是否可以進(jìn)行FAB測(cè)定？4.為什么在送FAB測(cè)試樣品時(shí)需要溶解性的信息？5.FAB適用于什么類型樣品？思考題：35第四節(jié)、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）一、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）三、大氣壓激光解吸離子化（AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI）第四節(jié)、激光解吸離子化（LaserDesorptioni36一、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particleinducedionization),采用光子轟擊樣品常用激光：IR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等UV(N2激光器、Nd-YAG）：適用于多肽等一、激光解吸離子化（LaserDesorptionion37MALDI-TOFMS

工作原理qV=1/2(m1v12)=1/2(m2v22)若m1

>

m2,則

v1

<

v2t(m/z)分辯率

~400飛行管激光樣品靶15-25kV檢測(cè)器無(wú)基質(zhì)為L(zhǎng)D不能分析大分子(碎裂)MALDI-TOFMS工作原理qV=1/2(m1v1238延遲(脈沖)引出技術(shù)Delay(Pulsed)Extraction++++++20kVVe20kV

10kV0V20kV10kV1517.512.5++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++調(diào)諧延遲時(shí)間和引出電壓,達(dá)到最佳分辨率線性分辨率優(yōu)于4000

(insulinBchain)DE+Reflectron,分辨率優(yōu)于20000++++++延遲(脈沖)引出技術(shù)++++++20kVVe0V20kV1039NewSCOUT100MALDIsource(fromREFLEX)MALDISourceNewSCOUT100MALDIsourceMAL40SCOUT100MALDISourcewithMultipoleIonGuideMultipoleionguideTargetplateLaserbeamIonplumeExtractionplateFTMSiontransferopticsToICRcellSCOUT100MALDISourcewithMu41SCOUT100MALDIAccessoryFeatures:Switch-ablesourceto/fromESIX-Ypositioningstage+cameraUpto100samples/plateFastloadlockforeasytargetchangeoverElevatedPressureAdvantagesSCOUT100MALDIAccessoryFeatu42思考題：1.LD適用于哪些質(zhì)量分析器？2.為什么有時(shí)加入金屬離子？3.應(yīng)用范圍離子化方法課件43MALDIAccessory-benchmarkdata離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約使用最廣泛，譜庫(kù)最完整；transferoptics是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即Conditions:CH3++CH4C2H5++H2X-Ypositioningstage+camera典型的間歇電噴霧的總離子流圖樣品分子在穿過(guò)等離子體時(shí)，通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移被電離形成MH+或（M-H)-。CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？（LaserDesorptionionization,LD）PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryCI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.Somemoleculesundergoverylittlefragmentation稀釋樣品，使簇合的大分子解離；含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minuteMALDIAccessory-benchmarkdata二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）常用基質(zhì)：2,5-二羥基苯甲酸（DHB)丁二酸（SA)基質(zhì)的作用：1.稀釋樣品，使簇合的大分子解離；2.保護(hù)樣品，基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品，避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解；3.通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移等使樣品分子離子化。MALDIAccessory-benchmarkda44離子化方法課件45離子化方法課件46寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+47HighMOWSEScoreof159!Masserrorsbelow4mDa!MALDIspectrumofonly1fmoleBSAtrypticdigestusingAnchorChipTM

targets.Withanassumedmax.deviationof5ppm,MASCOTgaveascoreof159forBSA.BSAMALDIanalysisoftrypticdigestsHighMOWSEMasserrorsMALDIs48MALDIAccessory-benchmarkdata34863491349635013506m/zMALDIofInsulinBChainRP=1.1Million!MALDIAccessory-benchmarkda49思考題：1.基質(zhì)的作用2.溶解溶劑的選擇思考題：503以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約

－－低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾3以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析51基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+2Na-H]+DHBdimer亮氨酸亮氨酸[Leu+2Na-H]+基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+252含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通53可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用，所以脂肪鏈越長(zhǎng)，信號(hào)越好，比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。頡氨酸可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相54七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜55碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積表面原子數(shù)量多，表面活性高，碳納米管可以很好的分散樣品分子，來(lái)防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。強(qiáng)的紫外吸收電子只要很小的能量就能被激發(fā)，而且可以快速釋放能量弛豫到費(fèi)米能級(jí)，所以碳納米管很容易吸收和傳遞能量使樣品分子從表面解析。碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積56

三、大氣壓激光解吸離子化（AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI）

三、大氣壓激光解吸離子化（Atmosphericpres57第五節(jié)、大氣壓離子化

（AtmosphericPressureIonization,API)一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI）

二、大氣壓化學(xué)電離（atmosphericpressurechemicalionization，APCI）三、大氣壓光化學(xué)電離第五節(jié)、大氣壓離子化

（Atmos58一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI）

離子化過(guò)程：1.荷電液滴的產(chǎn)生當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管的瞬間，在加熱溫度、霧化氣和強(qiáng)電場(chǎng)（3-5Kv)的作用下，溶液迅速霧化并產(chǎn)生高電荷液滴。

2.荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生帶電液滴隨著溶劑蒸發(fā)不斷縮小，液滴表面電荷密度不斷增大，發(fā)生崩散，形成更小的液滴，小的繼續(xù)蒸發(fā)，以類似的方式崩散，產(chǎn)生單電荷和多電荷離子。一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI）離子化59ESI(electrosprayionization)SolventsprayedacrosspotentialfieldandionizedDropletsevaporatesSolventchargetransferredtoanalytesPolarcompounds

ESIESI(electrosprayionization)60離子化方法課件61牛膝多糖ESI質(zhì)譜圖和（加入適量Cs+）ESI質(zhì)譜圖

牛膝多糖ESI質(zhì)譜圖和（加入適量Cs+）ESI質(zhì)譜圖

62ESIIonSource:ResolutionConditions:Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute49%water,49%methanol,2%aceticacidBroadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scan

Specification:

Resolution>100,000FWHMatm/z779Resolution=198,000+11IsotopeCluster6fmolConsumedESIIonSource:ResolutionCond63細(xì)胞色素b5和突變體細(xì)胞色素b5和突變體64思考題：1.為什么ESI需要溶解性信息？2.離子源類型，和哪些質(zhì)量分析器匹配？3.應(yīng)用范圍4.為什么ESI比較適合和LC、CE聯(lián)用？5.為什么ESI可以測(cè)定非共價(jià)復(fù)合物？6.形成多電荷離子對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響？思考題：6501mg/mL，(C)0.Themajorpeakcorrespondstothemolecularion.MALDIofInsulinBChaintransferoptics只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？（一）nanospray三、大氣壓激光解吸離子化（AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI）[DHB+2Na-H]+Fastloadlockforeasytargetchangeover－－低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾Specification:CH5++SHSH2++CH4CH4+·和CH3+很快與大量存在的CH4分子起反應(yīng)，即：CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？不能分析大分子(碎裂)只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。Somemoleculesundergoverylittlefragmentation二甲苯三個(gè)異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對(duì)強(qiáng)度甲基紅霉素的質(zhì)譜靈敏度的比較是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即Schematicofthenanoelectrospraysourceapparatus1#-skimmer1,2#-heater,3#-nozzle,4#-shutter,5#-interface,6#-nanoelectrospraytip,7#-steelesstube,8#-screw,9#-highvoltageconnector,10#-X,Zmodulator

余翀?zhí)?、郭寅?化學(xué)學(xué)報(bào)2002;60(11):2029

（一）nanospray01mg/mL，(C)0.Schematicofthe66細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜（單張圖譜）從上至下的濃度分別為（A）0.2mg/mL，(B)0.01mg/mL，(C)0.0005mg/mL細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜（單張圖譜）67（二）脈沖噴霧和間歇噴霧1.YuLu,FengZhou,WenqingShui,LipingBian,YinlongGuoandPengyuanYang*AnalChem2001;73(19):4748-47532.劉晗青、郭寅龍*、余翀?zhí)?、楊芃原化學(xué)學(xué)報(bào)2002;60(1):171（二）脈沖噴霧和間歇噴霧1.YuLu,FengZhou68典型的間歇電噴霧的總離子流圖

典型的間歇電噴霧的總離子流圖69甲基紅霉素的質(zhì)譜靈敏度的比較（a）間歇電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖，信噪比的平均值為25.53(b)連續(xù)電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖，信噪比的平均值為14.72甲基紅霉素的質(zhì)譜靈敏度的比較70（三）雙噴霧FengZhou,WenqingShui,YuLu,PengyuanYang*,andYinlongGuo*RapidCommunicationsinMassSpectrometry2002;16:505-511（三）雙噴霧FengZhou,WenqingShui,71離子化方法課件72二、大氣壓化學(xué)電離（atmosphericpressurechemicalionization，APCI）當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管被霧化到加熱管中揮發(fā)，在尖端放電電極的高壓作用下先使溶劑分子電離，形成反應(yīng)氣等離子體。樣品分子在穿過(guò)等離子體時(shí)，通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移被電離形成MH+或（M-H)-。二、大氣壓化學(xué)電離（atmosphericpressure73離子化方法課件74離子化方法課件75離子化方法課件76思考題：1.為什么APCI需要溶解性信息？2.離子源類型，和哪些質(zhì)量分析器匹配？3.應(yīng)用范圍4.為什么APCI比較適合和LC、CE聯(lián)用？5.形成單電荷離子對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響？思考題：77三、大氣壓光化學(xué)電離三、大氣壓光化學(xué)電離78離子化方法課件79思考題：1.為什么APPI需要溶解性信息？2.離子源類型，和哪些質(zhì)量分析器匹配？3.應(yīng)用范圍4.為什么APPI特別適合和LC、CE聯(lián)用？思考題：80API/MS特點(diǎn)分析極性較大的化合物與GC/MS相互補(bǔ)充與LC、CE、CEC的聯(lián)用“軟”電離技術(shù)

API/MS特點(diǎn)分析極性較大的化合物81第三章、離子化方法思考題：樣品分子為什么首先要離子化才能進(jìn)行質(zhì)譜分析？樣品分子電離是質(zhì)譜測(cè)定的必要條件。只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。第三章、離子化方法思考題：82第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即M+eM+。+2e式中M為待測(cè)分子，M+。為分子離子或母體離子。第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法，是使用高能83Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectronPrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrye–Atomormoleculeishitbyhig84Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron

electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig85Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron

electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig86Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryThisenergy-richspecieseject87Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry

formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularione–+

?Thisenergy-richspecieseject88formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularionFengZhou,WenqingShui,YuLu,PengyuanYang*,andYinlongGuo*Somemoleculesundergoverylittlefragmentation只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。2mg/mL，(B)0.細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜（單張圖譜）Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scan第四節(jié)、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）MALDIAccessory-benchmarkdataelectronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculeUbiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute若m1>m2,則v1<v2間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖為什么APCI比較適合和LC、CE聯(lián)用？Delay(Pulsed)Extraction一、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）YuLu,FengZhou,WenqingShui,LipingBian,YinlongGuoandPengyuanYang*X-Ypositioningstage+cameraIR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等TargetplateThemoleculariondissociatestoacation

andaradical.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry+

?formingapositivelycharged,89 20 40 60 80 100 120m/zm/z=78100806040200Relative

intensitySomemoleculesundergoverylittlefragmentation

Benzeneisanexample.Themajorpeakcorrespondstothemolecularion. 20 40 60 80 100 120m/zm/z=90離子化方法課件91思考題：1.EI的應(yīng)用范圍2.EI的特點(diǎn)使用最廣泛，譜庫(kù)最完整；電離效率高；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便；分子離子峰強(qiáng)度較弱或不出現(xiàn)(因電離能量最高)。3.EI中通常的能量為多少？轟擊電子能量改變對(duì)質(zhì)譜的影響有哪些？4.為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會(huì)出現(xiàn)MH+，而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。5.EI適用于何種質(zhì)量分析器？思考題：92離子化方法課件93離子化方法課件94離子化方法課件95第二節(jié)、化學(xué)電離離子化

一、化學(xué)電離離子

二、自身化學(xué)電離離子化第二節(jié)、化學(xué)電離離子化

一、化學(xué)電離離子

96一、化學(xué)電離離子化（ChemicalIonization,CI）

化學(xué)電離源一般在1.3102～1.3103Pa。通過(guò)離子

-分子反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。試劑氣通常為甲烷CH4。首先用高能電子，使CH4電離產(chǎn)生CH5+和C2H5+，即：CH4+eCH4+·+2eCH4+·CH3++H·CH4+·和CH3+很快與大量存在的CH4分子起反應(yīng)，即：CH4+·+CH4CH5++CH3·

CH3++CH4C2H5++H2小量樣品（試樣與甲烷之比為11000）導(dǎo)入離子源，試樣分子（SH）發(fā)生下列反應(yīng)：CH5++SHSH2++CH4

C2H5++SHS++C2H6SH2+和S+然后可能碎裂，產(chǎn)生質(zhì)譜。一、化學(xué)電離離子化（ChemicalIonization,97PCI甲烷反應(yīng)機(jī)理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH3+MMM-H+CH5+CH3?CH4M+H+230eVPCI甲烷反應(yīng)機(jī)理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH398離子化方法課件99三、大氣壓激光解吸離子化CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrytransferoptics含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute[DHB+2Na-H]+形成單電荷離子對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響？表面原子數(shù)量多，表面活性高，碳納米管可以很好的分散樣品分子，來(lái)防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemolecule二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即Solventchargetransferredtoanalytes使用最廣泛，譜庫(kù)最完整；MALDI-TOF,DHBEI適用于何種質(zhì)量分析器？三、大氣壓激光解吸離子化（AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI）可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用，所以脂肪鏈越長(zhǎng)，信號(hào)越好，比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。2,5-二羥基苯甲酸（DHB)MultipoleionguidePCI三、大氣壓激光解吸離子化PCI100NCISpectraNCISpectra101思考題：1.什么情況下需要采用CI？2.CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？3.CI的用途4.比較CI和EI的靈敏度5.CI實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定是否容易？6.CI的局限性思考題：102二、自身化學(xué)電離離子化（Self-chemicalionization,SCI)FTMS和離子阱的內(nèi)離子源中出現(xiàn)的特殊方法。樣品分子本身在電子轟擊時(shí)產(chǎn)生CH5+、C2H5+、C3H7+等可提供質(zhì)子的碎片離子，通過(guò)增加離子在阱中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高它們和分子的碰撞幾率，提高M(jìn)H+的強(qiáng)度，以實(shí)現(xiàn)CI。二、自身化學(xué)電離離子化（Self-chemicalioni103紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖104離子化方法課件105離子化方法課件106乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫(kù)檢索結(jié)果

乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫(kù)檢索結(jié)果107烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖

烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖108離子化方法課件109第二節(jié)、化學(xué)電離離子化離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？2,5-二羥基苯甲酸（DHB)MALDI-TOFMS工作原理保護(hù)樣品，基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品，避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解；IR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？CH3++CH4C2H5++H2屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particleinducedionization),采用高能中型粒子（Ar）轟擊樣品典型的間歇電噴霧的總離子流圖添加金屬離子（如：NaCl、KCl、AgNO3)的目的？含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即[M+CH3CO]+/[CH3CO+]典型的間歇電噴霧的總離子流圖PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。1Million!Somemoleculesundergoverylittlefragmentation－－低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾典型的間歇電噴霧的總離子流圖第二節(jié)、化學(xué)電離離子化(b)連續(xù)電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖，信噪比的平均值為14.MALDI-TOF,DHB[Leu+2Na-H]+間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖保護(hù)樣品，基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品，避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解；二甲苯三個(gè)異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對(duì)強(qiáng)度只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scanIR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等Conditions:離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會(huì)出現(xiàn)MH+，而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。SCOUT100MALDIAccessory荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生Specification:PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryMALDIAccessory-benchmarkdata－－低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾（一）nanospray思考題：1.FTMS中SCI的特點(diǎn)？和CI相比有哪些優(yōu)勢(shì)？2.離子源內(nèi)真空度高對(duì)分析什么樣品有利？3.MH+的強(qiáng)度和哪些因素有關(guān)？4.應(yīng)用范圍第二節(jié)、化學(xué)電離離子化典型的間歇電噴霧的總離子流圖思考題：110間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖

間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜111

二甲苯三個(gè)異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對(duì)強(qiáng)度

[M+H]+/CH3COH+CH3[M+CH3CO]+/[CH3CO+]間二甲苯11.361.54對(duì)二甲苯1.930.425鄰二甲苯0.348二甲苯三個(gè)異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相112第三節(jié)、快原子轟擊離子化（Fastatombombardment,FAB）屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particleinducedionization),采用高能中型粒子（Ar）轟擊樣品常用底物：G甘油NBA間硝基芐醇

第三節(jié)、快原子轟擊離子化（Fastatombombard113離子化方法課件114離子化方法課件115思考題：1.FAB和CI相比有何特點(diǎn)？2.添加金屬離子（如：NaCl、KCl、AgNO3)的目的？3.與活潑氫可以可以發(fā)生反應(yīng)的樣品是否可以進(jìn)行FAB測(cè)定？4.為什么在送FAB測(cè)試樣品時(shí)需要溶解性的信息？5.FAB適用于什么類型樣品？思考題：116第四節(jié)、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）一、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）三、大氣壓激光解吸離子化（AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI）第四節(jié)、激光解吸離子化（LaserDesorptioni117一、激光解吸離子化（LaserDesorptionionization,LD）屬于粒子誘導(dǎo)離子化（particleinducedionization),采用光子轟擊樣品常用激光：IR(CO2激光器)：適用于高分子聚合物、DNA等UV(N2激光器、Nd-YAG）：適用于多肽等一、激光解吸離子化（LaserDesorptionion118MALDI-TOFMS

工作原理qV=1/2(m1v12)=1/2(m2v22)若m1

>

m2,則

v1

<

v2t(m/z)分辯率

~400飛行管激光樣品靶15-25kV檢測(cè)器無(wú)基質(zhì)為L(zhǎng)D不能分析大分子(碎裂)MALDI-TOFMS工作原理qV=1/2(m1v12119延遲(脈沖)引出技術(shù)Delay(Pulsed)Extraction++++++20kVVe20kV

10kV0V20kV10kV1517.512.5++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++調(diào)諧延遲時(shí)間和引出電壓,達(dá)到最佳分辨率線性分辨率優(yōu)于4000

(insulinBchain)DE+Reflectron,分辨率優(yōu)于20000++++++延遲(脈沖)引出技術(shù)++++++20kVVe0V20kV10120NewSCOUT100MALDIsource(fromREFLEX)MALDISourceNewSCOUT100MALDIsourceMAL121SCOUT100MALDISourcewithMultipoleIonGuideMultipoleionguideTargetplateLaserbeamIonplumeExtractionplateFTMSiontransferopticsToICRcellSCOUT100MALDISourcewithMu122SCOUT100MALDIAccessoryFeatures:Switch-ablesourceto/fromESIX-Ypositioningstage+cameraUpto100samples/plateFastloadlockforeasytargetchangeoverElevatedPressureAdvantagesSCOUT100MALDIAccessoryFeatu123思考題：1.LD適用于哪些質(zhì)量分析器？2.為什么有時(shí)加入金屬離子？3.應(yīng)用范圍離子化方法課件124MALDIAccessory-benchmarkdata離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約使用最廣泛，譜庫(kù)最完整；transferoptics是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即Conditions:CH3++CH4C2H5++H2X-Ypositioningstage+camera典型的間歇電噴霧的總離子流圖樣品分子在穿過(guò)等離子體時(shí)，通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移被電離形成MH+或（M-H)-。CI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？（LaserDesorptionionization,LD）PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryCI離子源的壓力為1torr，EI為10-5-10-6torr，為什么？Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.Somemoleculesundergoverylittlefragmentation稀釋樣品，使簇合的大分子解離；含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法，是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個(gè)電子而產(chǎn)生正離子，即Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minuteMALDIAccessory-benchmarkdata二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）常用基質(zhì)：2,5-二羥基苯甲酸（DHB)丁二酸（SA)基質(zhì)的作用：1.稀釋樣品，使簇合的大分子解離；2.保護(hù)樣品，基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品，避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解；3.通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移等使樣品分子離子化。MALDIAccessory-benchmarkda125離子化方法課件126離子化方法課件127寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+128HighMOWSEScoreof159!Masserrorsbelow4mDa!MALDIspectrumofonly1fmoleBSAtrypticdigestusingAnchorChipTM

targets.Withanassumedmax.deviationof5ppm,MASCOTgaveascoreof159forBSA.BSAMALDIanalysisoftrypticdigestsHighMOWSEMasserrorsMALDIs129MALDIAccessory-benchmarkdata34863491349635013506m/zMALDIofInsulinBChainRP=1.1Million!MALDIAccessory-benchmarkda130思考題：1.基質(zhì)的作用2.溶解溶劑的選擇思考題：1313以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約

－－低質(zhì)量區(qū)會(huì)有基質(zhì)信號(hào)的背景干擾3以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析132基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+2Na-H]+DHBdimer亮氨酸亮氨酸[Leu+2Na-H]+基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+2133含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通過(guò)碳納米管傳遞，也可以直接吸收能量進(jìn)行解析，比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收，所以能量不僅可以通134可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用，所以脂肪鏈越長(zhǎng)，信號(hào)越好，比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。頡氨酸可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相135七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜136碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積表面原子數(shù)量多，表面活性高，碳納米管可以很好的分散樣品分子，來(lái)防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。強(qiáng)的紫外吸收電子只要很小的能量就能被激發(fā)，而且可以快速釋放能量弛豫到費(fèi)米能級(jí)，所以碳納米管很容易吸收和傳遞能量使樣品分子從表面解析。碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積137

三、大氣壓激光解吸離子化（AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI）

三、大氣壓激光解吸離子化（Atmosphericpres138第五節(jié)、大氣壓離子化

（AtmosphericPressureIonization,API)一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI）

二、大氣壓化學(xué)電離（atmosphericpressurechemicalionization，APCI）三、大氣壓光化學(xué)電離第五節(jié)、大氣壓離子化

（Atmos139一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI）

離子化過(guò)程：1.荷電液滴的產(chǎn)生當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管的瞬間，在加熱溫度、霧化氣和強(qiáng)電場(chǎng)（3-5Kv)的作用下，溶液迅速霧化并產(chǎn)生高電荷液滴。

2.荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生帶電液滴隨著溶劑蒸發(fā)不斷縮小，液滴表面電荷密度不斷增大，發(fā)生崩散，形成更小的液滴，小的繼續(xù)蒸發(fā)，以類似的方式崩散，產(chǎn)生單電荷和多電荷離子。一、電噴霧離子化（Electrospray，ESI）離子化140ESI(electrosprayionization)SolventsprayedacrosspotentialfieldandionizedDropletsevapora