基因工程菌的發(fā)酵課件

第十四章基因工程菌的發(fā)酵第一節(jié)工程菌的來源和應(yīng)用一、何謂基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA的重組技術(shù)。重組即利用供體生物的遺傳物質(zhì)或人工合成的基因，經(jīng)過體外或離體的限制酶切割后與適當?shù)妮d體連接起來形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導入到受體細胞或受體生物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計好的藍圖表現(xiàn)出另外一種生物的某種性狀。除DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導入技術(shù)等。二、工程菌的獲得確定目的產(chǎn)物。找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細胞。將細胞破碎后提純出全部信使RNA。這些信使中包含了該細胞內(nèi)表達的所有蛋白質(zhì)的合成信息。利用基因擴增技術(shù)（PCR），找出所需的目的基因。將目的基因連接到設(shè)計好的質(zhì)粒載體，形成了重組DNA分子。將重組后DNA分子引入到受體細胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細胞繁殖。根據(jù)選擇性標記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。三、工程菌應(yīng)具備的條件發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可進行連續(xù)發(fā)酵。菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。代謝控制容易進行。能進行適當?shù)腄NA重組，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易脫落。四、工程菌的應(yīng)用1，基因藥物紅細胞生成素胰島素干優(yōu)素乙肝疫苗生長激素粒細胞巨噬細胞集落刺激因子2，其它發(fā)酵產(chǎn)品酶制劑氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）抗生素一、安全問題關(guān)于基因工程的社會問題，必須提到它的潛在危險性。經(jīng)過重組的菌和質(zhì)粒一旦用于工業(yè)化生產(chǎn)，就不可避免地進入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問題是極其重要的。物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。實驗規(guī)模在20L以下時，物理密封由密封設(shè)施、實驗室設(shè)計和實驗注意事項組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級，數(shù)字越大，密封水平越高。生物學密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉(zhuǎn)移至其它活細胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴散。按密封程度分B1和B2級，B2級的密封要求最嚴格。三、工程菌的培養(yǎng)工程菌的營養(yǎng)控制質(zhì)粒穩(wěn)定性重組質(zhì)?？截悢?shù)的控制及表達效率1，底物濃度的控制在基因工程茵培養(yǎng)過程，至少要遵循PI級物理防護的規(guī)定，因此必需進行菌體的高密度培養(yǎng)。從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型突變株。2，質(zhì)粒穩(wěn)定性（1）質(zhì)粒不穩(wěn)定的類型分離性不穩(wěn)定：這是由于在細胞分裂過程中質(zhì)粒缺失分配到子細胞中而導致整個質(zhì)粒丟失。結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定：這是由于重組質(zhì)粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化。（2）影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對其穩(wěn)定性的影響宿主對質(zhì)粒穩(wěn)定的影響質(zhì)?？截悢?shù)重組質(zhì)粒的表達對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響（3）使質(zhì)粒穩(wěn)定的措施組建合適載體選擇適當宿主施加選擇壓力抗生素添加法抗生素依賴變異法營養(yǎng)缺陷型法控制基因過量表達控制培養(yǎng)條件假定在分批培養(yǎng)過程中，細胞在對數(shù)生長期每次分裂時，其質(zhì)粒丟失率為P，則Fn為3，表達效率及質(zhì)粒拷貝數(shù)控制在工程菌培養(yǎng)過程中，表達效率與質(zhì)粒拷貝數(shù)有關(guān)。在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能提高細胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細胞負荷，此時拷貝數(shù)較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)?？截悢?shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。所以對于底物對于產(chǎn)物第四節(jié)培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。在進行以工業(yè)化為目的的DNA重組實驗，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌時，當然應(yīng)采用簡便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)?，F(xiàn)在多半使用大腸桿菌為宿主，而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長良好。二、工程菌外漏的防范首先應(yīng)了解培養(yǎng)微生物在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作。歸納起來有：排氣，機械密封，接種，取樣，培養(yǎng)后的滅菌(通入濕熱蒸氣)，排液(輸至下一工序)。1，排氣2，機械密封考慮培養(yǎng)液外漏的情況，培養(yǎng)基因工程菌時，以用上部攪拌的雙機械密封為好。4，培養(yǎng)后的滅菌培養(yǎng)后對培養(yǎng)液和管道等進行滅菌時，一開始流出的末滅菌排水有可能存在活的重組菌。取樣、排液的管道中能產(chǎn)生這類排水，因此，一定要另行安裝排水管并與廢液滅菌貯槽等相連接，以便排放污水。5，接種向罐內(nèi)直接接種的方法是不安全的。簡單的安全接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連接后，用無菌空氣加壓壓入的方法。另一種方法是先把種子液在安全柜內(nèi)移至供接種用的小罐內(nèi)，再將其與培養(yǎng)罐連接，用蒸汽對連接部分滅菌后，把種子罐中的種子液接入培養(yǎng)罐內(nèi)。6，排液培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序，這時也有可能產(chǎn)生氣溶膠和重組菌的擴散。安全的方法是在培養(yǎng)開始前就將排液口與下段工序相連接并進行滅菌，這樣培養(yǎng)一結(jié)束即可直接輸送培養(yǎng)液。如果排液口未與下段工序相連那就應(yīng)與連結(jié)廢液滅菌罐的排水管道相接，這樣就安全了。三、培養(yǎng)罐的管道布局下圖表示重組菌培養(yǎng)罐(P2、P3級)的整體流程圖。重組菌培養(yǎng)罐中，凡有可能外漏重組菌的部分都與排污管道相連。圖中所示的管路能分離并排出污染重組菌的污水。四、基因工程產(chǎn)品的提取和精制

傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的不同，主要表現(xiàn)在下列兩方面：傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子(工業(yè)用酶除外，但它們對純度要求不高，提取方法較簡單)，其理化性能，如平衡關(guān)系等數(shù)據(jù)都已知，因此放大比較有根據(jù)；相反，基因工程產(chǎn)品都是大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗?；蚬こ坍a(chǎn)品大多處于細胞內(nèi)，提取前需將細胞破碎，增添了很多困難。另外，對于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全(biosafety)問題