革蘭氏染色法

革蘭氏染色法原理通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。鑒定原理革蘭氏染色該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。 G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色，呈現(xiàn)藍紫色。特性染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定。革蘭氏染色屬復(fù)染法，即將標(biāo)本固定后，先用龍膽紫染色,加碘液媒染后用迺精脫色，再用蕃紅復(fù)染。染色后除可以看到細(xì)菌形態(tài)外，還可將細(xì)菌分為兩大類，即不被酒精脫色而保留紫色者為革蘭氏陽性菌(G+)。被酒精脫色復(fù)染成紅色者為革蘭氐陰性菌(G-)。革蘭氏染色原理尚不肯定，可能與細(xì)菌所帶核糖核酸、細(xì)菌壁結(jié)構(gòu)通透性、等電點等因素有關(guān)。致病菌如金黃色葡萄球菌、綠色溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、碳疽桿菌等屬革蘭氏染色陽性菌。百日咳桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌、流行性腦膜炎雙球菌、淋病雙球菌等均屬革蘭氏陰性。所以根據(jù)細(xì)菌的革蘭氏染色性質(zhì)，可以縮小鑒定范圍，有利于進一步分離鑒定，以對疾病做出診斷。又由于各種抗生素的抗菌譜不同，革蘭氏染色尚可做為選用抗生素的參考。

染色結(jié)果革蘭氏陽性菌都呈紫色，革蘭氏陰性菌都呈紅色。實驗流程1、 取載玻片用紗布擦干，載玻片的一面用marker筆畫一個小圈（用來大致確定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2、 涂片：液體培養(yǎng)基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰附近5cm左右打開管蓋；右手持接種環(huán)在火焰中燒灼滅菌，等冷卻后從試管中沾取菌液一環(huán)，在潔凈無脂的載玻片上涂直徑2mm左右的涂膜，最后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。固體培養(yǎng)基:先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環(huán)取少量菌體，涂在載玻片上，使其薄而均勻。3、 晾干：讓涂片在空氣中自然干燥。4、固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。5、染色：將固定過的涂片放報紙上，滴加草酸銨結(jié)晶紫液，染 1min。6、 水洗：用水緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。簡單染色結(jié)束可觀察細(xì)胞形態(tài)。7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8、脫色：吸去殘留水，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-30S至流出液無紫色，立即水洗。9、 復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染3-5min，水洗。至此，革蘭氏染色結(jié)束。可能誤差在實驗中經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果，假陽性主要是由于脫色不完全，可能是由于涂片過厚，或者是結(jié)晶紫染色過度，導(dǎo)致脫色不完全。假陰性可能是因為細(xì)胞固定過度，造成細(xì)胞壁通透性的改變，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；另外，細(xì)胞培養(yǎng)時間太長，可能已經(jīng)有部分細(xì)胞發(fā)生死亡或者自溶，也導(dǎo)致細(xì)胞壁通透性的改變而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

常見致病菌和抗菌藥物的選擇革蘭氏陽性菌：葡萄球菌屬（主要是金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、鏈球菌屬（肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、腸球菌等）、白喉桿菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、蠟樣芽抱桿菌等，其中，金黃色葡萄球菌、腸球菌等為臨床重要等病原菌。革蘭氏陽性菌通常對青霉素類、第一（或第二）代頭抱菌素、萬古霉素、克林霉素等高度敏感，但是因為抗生素的濫用，MRSA/MRSE、VRSA/VISA、PISP/PRSP、VRE等多重耐藥菌已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類的生命，這些細(xì)菌感染時，可以考慮使用萬古霉素、共殺素（奎奴普丁/達福普?。⒗芜虬贰⑦_托霉素、泰利霉素、夫西地酸（建議與耐酶的青霉素類或利福平聯(lián)用）等。另外,CNS（凝固酶陰性葡萄球菌）等細(xì)菌也要引起足夠等重視。革蘭氏陰性菌：埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬、假單胞菌屬（ 綠膿桿菌等）、莫拉菌屬（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌屬（淋球菌、腦膜炎雙球菌等）、不動桿菌屬（鮑曼不動桿菌、羅菲不動桿菌等）、克雷伯菌屬（主要是肺炎克雷伯桿菌）、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬（痢疾桿菌等）、黃桿菌屬、變形桿菌屬、軍團菌屬、耶爾森菌屬、嗜血桿菌屬（杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌等）、產(chǎn)氣桿菌屬、霍亂弧菌、陰溝腸桿菌等。革蘭氏陰性菌在院內(nèi)感染中的細(xì)菌感染中占了大約 65%，且大多菌株容易對抗菌藥物耐藥，目前，產(chǎn)“新德里金屬酶”（NDM-1）的絕大多數(shù)細(xì)菌都是革蘭氏陰性菌（主要是大腸桿菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯桿菌）。革蘭氏陰性菌對第三代頭抱菌素（頭抱他啶、頭抱噻肟、頭抱曲松等）、氨基糖苷類（慶大霉素、妥布霉素等）、抗假單胞菌屬的青霉素類（哌拉西林、替卡西林、羧芐西林等）、多粘菌素等高度敏感，對頭霉素類和第二代頭抱菌素也較敏感，但是，MDR-AB/PDR-AB、PDR-PA等多重耐藥菌給臨床用藥帶來過很大的困難。 多粘菌素碳青霉烯類（亞胺培南、美羅培南等）、替加環(huán)素等可以用于多重耐藥菌等治療，但要慎用，否則很可能會到無藥可醫(yī)的地步（綠膿桿菌和鮑曼不動桿菌的一些菌株甚至已經(jīng)對碳青霉烯類有耐藥性）。值得注意的是，頭抱哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦替卡西林/克拉維酸、氧頭抱烯類（拉氧頭抱、氟氧頭抱等）對某些多重耐藥菌也有特效，比如產(chǎn)ESBLs或AmpC酶的菌株，可以考慮與其他抗菌藥物（磷霉素等）聯(lián)用，另外，多西環(huán)素和多粘菌素聯(lián)用時，幾乎對所有對細(xì)菌都有協(xié)同抗菌作用，也可考慮。根據(jù)細(xì)菌的革蘭氏染色性質(zhì)，可以縮小鑒