發(fā)酵生產的染菌及防治

關于發(fā)酵生產的染菌及防治第一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日緒論 發(fā)酵染菌指在發(fā)酵過程中除了生產菌以外，還有其它微生物浸入發(fā)酵系統(tǒng)生長繁殖，影響了純種培養(yǎng)過程。據報道內青霉素發(fā)酵染菌率為2%，鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素發(fā)酵的染菌率為5%，谷氨酸發(fā)酵噬菌體感染率為1%~2%。染菌對發(fā)酵過程有重大的影響，進而影響到發(fā)酵產率、提取率、得率、產品質量、三廢處理等。 在現有的科學技術條件下要做到完全不染菌是不可能。目前要做的是要提高生產技術水平，強化生產過程管理，防止發(fā)酵染菌的發(fā)生。如發(fā)生染菌，應盡快找出污染的原因，并采取相應的有效措施，把發(fā)酵染菌造成的損失降低到最小。第二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日1、染菌對發(fā)酵的影響種子染菌發(fā)酵染菌(發(fā)酵前、中、后）2、染菌檢查判斷鏡檢肉湯培養(yǎng)平板/斜面培養(yǎng)第三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3、染菌原因分析

菌體生長緩慢

種子培養(yǎng)異常菌絲結團泡沫多異?，F象代謝不正常

發(fā)酵異常菌體生長差

PH過高或過低溶解氧異常菌濃過高或過低第四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日4、常見染菌類型青霉素細短產氣桿菌、粗大產氣桿菌鏈霉素細短桿菌、假單孢桿菌、產氣桿菌、粗大產氣桿菌四環(huán)素雙球菌、芽孢桿菌、夾膜桿菌檸檬酸

青霉菌谷氨酸噬菌體酒類發(fā)酵醋酸菌、乳酸菌規(guī)模：大量罐染菌，個別連續(xù)染菌、部分罐染菌第五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日無菌室沙土管，試管種子帶菌培養(yǎng)基空氣帶菌污染途徑操作失誤設備噬菌體種子培養(yǎng)期：滅菌或棄之染菌挽救發(fā)酵前期：滅菌后補加種子或分罐中、后期：加殺菌劑或抗生素、通風攪拌設備用120℃30min殺菌第六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日6、污染不同種類和性質的微生物的影響 生產不同的品種，可污染不同種類和性質的微生物。不同污染時間，不同污染途徑，污染不同菌量，不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件又可產生不同后果。第七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日6.1、噬菌體的污染與防止感染途徑：

三個必要條件

環(huán)境帶菌、環(huán)境帶活菌、噬菌體與活菌接觸防止措施：（1）、以環(huán)境凈化為中心（2）、以“種”為中心（3）、以空氣凈化系統(tǒng)為中心（4）、以設備、管道為中心（5）、以管理為中心、輪換使用菌種Phage的主要生物學特征:（1）具有專一的寄主性，在菌體繁殖的情況下繁殖（2）不耐熱性，700C以上其基本失（3）pH穩(wěn)定性pH大于10，pH小于5Phage急劇失活（4）不耐藥性（5）對干燥的穩(wěn)定性第八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日6.2污染其它雜菌

有些雜菌會使生產菌自溶產生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程的通氣攪拌。

有的雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產品破壞。特別是染芽孢桿菌，由于芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會反復染菌。

第十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

大罐染菌的挽救1、發(fā)酵前期；滅噬、易種法、用抗性菌2、發(fā)酵中期：易種、并罐3、發(fā)酵后期：實消放罐噬菌體的檢測1、單層噬菌斑法2、雙層噬菌斑3、平板交叉劃線法4、快速檢查法5、液體培養(yǎng)檢查法事前分別配制2%和1%瓊脂的兩種培養(yǎng)基，將2%的培養(yǎng)機作底層，鋪成平板待用，用生理鹽水洗下生長旺盛的細菌斜面，配制菌懸液。取此0.2ml和被測定的Phage液or待檢樣品液0.1ml于試管中，加入冷卻至450C的含1%的瓊脂培養(yǎng)基3~4ml混勻后立即倒在2%的培養(yǎng)基平板上，保溫培養(yǎng)16~20hr，如有Phage，在上層出現透明無菌的圓形or近圓形空斑。將Phage和菌懸液與含有0.5~0.8%瓊脂的培養(yǎng)基混合，在無菌載波片上凝固，經過培養(yǎng)后在鏡檢計數。用500ml三角瓶加50ml一級種子培養(yǎng)基，經滅菌后，接入0.5~1ml需檢查之發(fā)酵液或種子液，置于搖床上培養(yǎng)10~12hr,觀察液體渾濁度。若渾濁度OD正常，鏡檢無染菌，正常。若液體清，說明感染。第十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日一、染菌對不同發(fā)酵過程的影響

由于各種發(fā)酵過程所用的微生物菌種、培養(yǎng)基以及發(fā)酵的條件、產物的性質不同，染菌造成的危害程度也不同。如：青霉素的發(fā)酵過程核苷或核苷酸的發(fā)酵過程檸檬酸等有機酸的發(fā)酵過程谷氨酸的發(fā)酵過程

第一節(jié)染菌對發(fā)酵的影響 染菌對發(fā)酵過程的影響很大，但由于生產的產品不同、污染雜菌的種類和性質不同、染菌發(fā)生的時間不同以及染菌的途徑和程度不同，染菌造成的危害及后果不同。T4噬菌體細菌第十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日一、染菌對不同發(fā)酵過程的影響（續(xù)）：

放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。（1）抗生素：青霉素生產中污染產青霉素酶的雜菌（自身產生或誘導產生），在發(fā)酵過程中，都會使青霉素迅速分解破壞，使目的產物得率降低，危害十分嚴重。一般污染細短產氣桿菌比粗大桿菌的危害大。鏈霉素（污染細短桿菌、假單孢桿菌和產氣桿菌比粗大桿菌的危害大）、四環(huán)素（污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大）、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對細菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。

第十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

（2）核苷或核苷酸發(fā)酵過程：因生產菌多為營養(yǎng)缺陷型微生物，其生長能力差，所需的培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，易受到雜菌的污染，且染菌后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴重抑制了生產菌的生長和代謝產物的生成，污染芽孢桿菌的危害最大。

（3）檸檬酸等有機酸發(fā)酵過程：一般在產酸后發(fā)酵液的pH值比較低，雜菌生長十分困難，在發(fā)酵中、后期不太會發(fā)生染菌，主要是要預防發(fā)酵前期染菌，最怕污染青霉菌。（4）谷氨酸發(fā)酵：周期短，生產菌繁殖快，培養(yǎng)基不太豐富，一般較少污染雜菌，但噬菌體污染對谷氨酸發(fā)酵的影響較大。（5）疫苗：多采用深層培養(yǎng)，是不經提純直接使用的產品，在其培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內外毒素，都應全部廢棄。第十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日三、染菌發(fā)生的不同時間對發(fā)酵的影響

污染時間：是指用無菌檢測方法能檢測到的污染時間（因為雜菌進入培養(yǎng)液后，需有足夠的生長、繁殖的時間才能顯現出來），不是雜菌浸入發(fā)酵系統(tǒng)的時間。顯現的時間又與污染菌量有關。3.1、種子培養(yǎng)期染菌種子培養(yǎng)期（主要是細胞生長繁殖期）：微生物菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)十分豐富、培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素（產物）或只有很少抗生素（產物），故比較容易染菌，。措施：一旦發(fā)現種子受到雜菌的污染，應經滅菌后棄去，并對種子罐、管道等進行仔細檢查和徹底滅菌。第十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3.2、發(fā)酵前期染菌

雜菌與生產菌爭奪營養(yǎng)成分，干擾生產菌的繁殖和產物的形成，發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。措施：可以用降低培養(yǎng)溫度，調整補料量，用酸堿調pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。第十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3.3、發(fā)酵中期染菌

嚴重干擾生產菌的繁殖和產物的生成。較嚴重影響發(fā)酵液理化性質，如雜菌大量產酸，pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產物分泌減少或停止，有時甚至會使已產生的產物分解。有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產生大量泡沫。措施降溫培養(yǎng)，減少補料，密切注意代謝變化情況。如果發(fā)酵單位到達一定水平可以提前放罐，或者抗生素生產中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。第十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3.4、發(fā)酵后期染菌

發(fā)酵后期發(fā)酵液內已積累大量的產物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅能力。如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。如污染嚴重，可采取措施提前放罐第十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日四、不同染菌途徑對發(fā)酵的影響種子帶菌：種子帶菌可使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性空氣帶菌：空氣帶菌也使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性，導致染菌范圍擴大至所有發(fā)酵罐培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續(xù)性設備滲漏：這種途徑造成染菌的危害性較大第十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日五、染菌對產物提取和產品質量的影響（1）對過濾的影響發(fā)酵液的粘度加大（菌體自溶、發(fā)酵不徹底）。造成過濾時間拉長，影響設備的周轉使用，破壞生產平衡；大幅度降低過濾收率。（2）對提取的影響溶媒萃取：易發(fā)生乳化離子交換：預處理分離不徹底的膠體物質（水溶性蛋白質等）易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量，洗脫時易混入產品中。第二十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（3）對產品質量的影響因含有較多分離不徹底的蛋白質等物質，對產品的純度有較大影響，同時會使產品放置一段時間后增大出現混濁的可能，影響產品的外觀。六、染菌對三廢處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用，發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費用和時間。第二十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第二節(jié)發(fā)酵異?，F象及原因分析一、種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異?，F象發(fā)酵過程中的種子培養(yǎng)和發(fā)酵的異常現象是指發(fā)酵過程中某些物理參數、化學參數或生物參數發(fā)生與原有規(guī)律不同的改變，這些改變必然影響發(fā)酵水平，使生產蒙受損失。1、種子培養(yǎng)異常（表現為培養(yǎng)的種子質量不合格）：菌體生長緩慢；菌絲結團；代謝不正常。2、發(fā)酵異常：菌體生長差；pH值過高或過低；溶解氧水平異常；泡沫過多；菌體濃度過高或過低；菌體生長差。第二十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日谷氨酸發(fā)酵時正常和異常的溶氧曲線噬菌體第二十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日二、染菌的檢查和判斷

1、檢查的目的、意義以無菌試驗的結果較可靠、迅速的判斷染菌，以及時采取處理措施。每個工序或經一定時間都應進行取樣檢查。無菌試驗的目的：（1）監(jiān)測培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及附屬設備滅菌是否徹底（2）監(jiān)測發(fā)酵過程中是否有雜菌從外界侵入，生產過程中是否存在染菌的隱患和死角

2、生產上常用的檢查方法有：①顯微鏡檢查（簡便、快速，能及時發(fā)現雜菌，但鏡撿取樣少，觀察面也小，則不易撿出早期雜菌）；②平板劃線檢查；③肉湯培養(yǎng)檢查。（后兩種操作較繁瑣（需過夜培養(yǎng)），但能撿出比前者更少的雜菌，結果為主要依據）第二十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日表8-1發(fā)酵過程的雜菌檢查

除了上述方法外，還對參數的變化情況進行實時監(jiān)控，以參數的異常變化來判斷是否染菌。第二十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3、發(fā)酵染菌率計算基準總染菌率指一年發(fā)酵染菌的批（次）數與總投料批（次）數之比的百分率。染菌批次數應包括染菌后培養(yǎng)基經重新滅菌，又再次染菌的批次數在內。是我國的統(tǒng)一的習慣計算方法總染菌率%=還用設備染菌率（統(tǒng)計發(fā)酵罐或其他設備的染菌率）、不同品種發(fā)酵的染菌率、不同發(fā)酵階段的染菌率、季節(jié)染菌率、操作染菌率等統(tǒng)計，以很好地控制生產。第二十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日1、例如：表8-2日本工業(yè)技術院發(fā)酵研究所多年來抗生素發(fā)酵染菌原因分析項目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設備滲漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94三、染菌原因第二十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

表6-3國內一制藥廠染菌原因分析

第二十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日管理不善而染菌的有31個罐批，占25.08％經分析有下表所列原因：

表8-4管理不善染菌的原因第二十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

表8-5國內一抗生素生產廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析

項目百分率%外界帶入雜菌（取樣、補料）8.20設備穿孔7.60空氣系統(tǒng)有菌26.00停電罐壓跌零1.60接種11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足0.60管理問題7.80操作違反規(guī)程1.60種子帶菌0.60原因不明35.00第三十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2、造成染菌的主要原因總結（1）種子帶菌-P233

種子帶菌又分為種子本身帶菌和種子培養(yǎng)過程中染菌。第三十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（2）、空氣帶菌-P233

無菌空氣帶菌是發(fā)酵染菌的主要原因之一（19.96％，26%）。國內外空氣除菌技術雖已有較大改善，但仍然沒有使染菌率降低到理想的程度。因為空氣除菌系統(tǒng)較為復雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會導致空氣除菌失敗。（3）、設備滲漏-P234

設備滲漏包括冷卻夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設備漏等。（33.85％，37.5％）。所以說加強設備本身及附屬零部件的嚴密度檢查。第三十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（4）、滅菌不徹底滅菌技術的好壞與滅菌質量很有關系蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時間蒸汽總壓是否達到要求標準環(huán)境中的雜菌數量因季節(jié)而有很大差別原材料儲存和保管，如玉米漿、母液糖等有機原料——雜菌的數量發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設備的清洗質量——有無滅菌的死角第三十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（5）、生產技術管理不善

技術管理就是要對發(fā)酵每個環(huán)節(jié)嚴格控制，必須制定嚴格工藝衛(wèi)生管理制度。否則發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理第三十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日四、發(fā)酵染菌原因分析

1、染菌的雜菌種類分析表8-6染菌的雜菌種類分析第三十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2、發(fā)酵染菌的規(guī)模分析表8-7大批量發(fā)酵罐染菌（情況較少，危害較大）第三十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日表8-8部分發(fā)酵罐染菌

個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌（如果采用間歇滅菌工藝，一般不會發(fā)生）：大都由于設備滲漏造成（設備的腐蝕磨損所引起的染菌會出現每批發(fā)酵的染菌時間向前推移的現象，），應仔細檢查閥門、罐體或罐器是否清潔等。第三十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3、不同污染時間分析

（1）、染菌發(fā)生在種子培養(yǎng)階段，或稱種子培養(yǎng)期染菌。通常是由種子帶菌、培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底，以及接種操作不當或設備因素等原因而引起染菌。（2）在發(fā)酵過程的初始階段發(fā)生染菌，或稱發(fā)酵前期染菌。大部分也是由于種子帶菌、培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底，以及接種操作不當或設備因素、無菌空氣等原因而引起。（3）發(fā)酵后期染菌大部分是由空氣過濾不徹底、中間補料染菌、設備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題而引起。第三十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第三節(jié)發(fā)酵過程染菌的防止一、種子帶菌的原因及防止

1、帶菌的原因（1）無菌室的無菌條件不符合要求；（2）培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底；（3）操作不當（移接、培養(yǎng)過程中受污染）。

2、種子帶菌的防治（1）無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內要供給恒溫恒濕的無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學藥品滅菌。第三十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日無菌室要求

接種、移種等無菌操作需要在無菌室內進行。無菌室面積不宜過大，一般約4~6m2高約2.6米。為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有1~3個套間(緩沖過道)(參照下圖)。無菌室內部的墻壁、天花板要涂白漆或采用瓷磚，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形，便于揩擦清洗以減少空氣中微生物的潛伏場所，室內布置應盡量簡單，最好能安裝空氣調節(jié)裝置，通入無菌空氣并調節(jié)室內的溫濕度。

在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時，關燈后15分鐘再接種。用消毒藥水如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，開啟超凈臺的通風，接種時必須在超凈臺上操作，超凈臺裝有一臺鼓風機，進風口有一粗過濾器，出風口有高效過濾器，保證無菌風從超凈臺吹出，外界有菌空氣不可能進入接種區(qū)域，保證無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。第四十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日

無菌室內無菌度的要求是：把無菌培養(yǎng)皿平板打開蓋子在無菌室內放置30分鐘，根據一般工廠的經驗，長出的菌落在3個以下為好。在種子的無菌條件不要求很高的情況下，可以不采用無菌室而直接用無菌箱進行操作，但無菌要求很高的情況下，即使在無菌室內還要用無菌箱操作。第四十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（2）在制備種子時對砂土管、斜面、三角瓶及搖瓶均嚴格進行管理（3）對每一級種子的培養(yǎng)物均應進行嚴格的無菌檢查（4）對菌種培養(yǎng)基或器具進行嚴格的滅菌處理第四十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日二、空氣帶菌及其防治必須從空氣的凈化工藝和設備的設計、過濾介質的選用和裝填、過濾介質的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統(tǒng)。

1、加強生產環(huán)境的衛(wèi)生管理，減少生產環(huán)境中空氣的含菌量。

2、設計合理的空氣預處理工藝，盡可能減少生產環(huán)境中空氣帶油、水量，提高進入過濾器的空氣溫度，降低空氣的相對濕度，保持過濾介質的干燥狀態(tài)，防止空氣冷卻器漏水，防止冷卻水進入空氣系統(tǒng)等。第四十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日3、設計和安裝合理的空氣過濾器，防止過濾器失效。選用除菌效率高的過濾介質，在過濾器滅菌時要防止過濾介質被沖翻而造成短路，防止過濾介質的裝填不均而使空氣走短路，保證一定的介質充填密度。在操作中要防止空氣壓力的劇變和流速的急增。第四十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日三、操作失誤導致染菌及其防治淀粉質原料容易結塊“夾生”攪拌混合或加入一定量的α-淀粉酶或罐外預先配料混均滅菌時壓力表顯示“假壓”打開排氣閥門及有關聯(lián)接管的邊閥、壓力表接管邊閥等排汽培養(yǎng)基滅菌中產生泡沫添加消泡劑工人操作不當加強技術培訓和責任心教育第四十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日四、設備滲漏或“死角”造成的染菌及其防治

發(fā)酵設備及附件由于化學腐蝕、電化學腐蝕，物料與設備摩擦造成機械磨損以及加工制作不良等原因會導致設備及附件形成微小漏孔所發(fā)生的滲漏現象。1、發(fā)酵罐的滲漏（1）冷卻管的滲漏是發(fā)酵罐中最容易滲漏的部件之一，氣壓試驗和水壓試驗（2）罐體的穿孔

每年大修時需檢查鋼板減簿的程度。有夾套的發(fā)酵罐可在夾套內用水壓或氣壓的試驗方法檢查罐壁有無滲漏。發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢罐底的加強板第四十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2、管件的滲漏（1）閥據統(tǒng)計，因閥的滲漏引起的染菌占染菌率的比例很大，采用密封性較高的閥門。目前使用的大小閥門大多采用截止閥和橡膠隔膜閥。

1)嚴密不漏。2)無填料。3)閥結構為流線型，流量大，阻力小，無死角，無堆積物，在關閉時不會使緊密面軋壞。4)檢修方便。但須定期檢查隔膜有否老化及脫落。

第四十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2、管路的連接管子的連接有螺紋連接、法蘭連接和焊接三種。

3、管路的配置排氣管與下水管第四十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日第四十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日4、發(fā)酵罐與管件的死角所謂死角是指滅菌時因某些原因使滅菌溫度達不到或不易達到的局部地區(qū)。（1）法蘭連接的死角法蘭的“死角”a—墊圈內徑過小；b—墊圈內徑過大；c—法蘭不平造成的泄漏與“死角”第五十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（2）渣滓在罐底與用環(huán)式空氣分布管所形成的死角圖A圖B圖C第五十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日（3）不銹鋼襯里的死角小型發(fā)酵罐通常采用不銹鋼制造。對于大型發(fā)酵罐，一般都采用不銹鋼襯里的方法。可采用復合鋼板(將兩種不同材質的鋼板軋合為一體的鋼板)制造發(fā)酵罐。不銹鋼襯里破裂造成“死角”第五十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日(4)接種罐管路的死角滅菌時蒸汽不易通達的“死角”及其消除方法第五十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日(6)壓力表安裝不合理形成的死角

另外，須注意罐內結垢形成的死角，對于不銹鋼罐及普通碳鋼罐的處理不同。壓力表安裝不合理形成“死角”1,6—發(fā)酵罐；2—緩沖管；3,4—壓力表；5—旋塞第五十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日5、設備與管道的清洗與殺菌管件和閥門清洗清水漂洗5～10min常溫洗滌劑洗滌15～20min常溫～70℃清洗漂洗常溫5～10min消毒劑處理15～20min常溫清水漂洗(15～20min，常溫)第五十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日CIP清洗系統(tǒng)定義：

CIP，是英文Clean-In-Place的縮寫，即就地清洗或稱為原位清洗,其定義為不拆卸設備或元件,在密閉的條件下,用一定溫度和濃度的清洗液對清洗裝置加以強力作用,使與食品接觸的表面洗凈和殺菌的方法。第五十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日與傳統(tǒng)的手工拆卸機器零件的清洗方式相比,CIP的優(yōu)點主要有:(1)能維持一定的清洗效果,保證產品的安全性。

(2)節(jié)約操作時間、提高效率,以實現商業(yè)的最大利潤。

(3)節(jié)省勞動力,保證操作的安全性。

(4)節(jié)省清洗用水和蒸汽。相比之下,常規(guī)拆卸清洗的缺點是:費時、費力,易損壞聯(lián)接件;設備停機時間長,設備利用率低;清洗不徹底,有時對操作者也不十分安全。

CIP的優(yōu)點第五十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日清洗程序分7個步驟：

㈠預沖洗：30s，10次；㈡堿預洗：16分；㈢中間清洗：清水4分；㈣清水噴沖：3次，每次30S；㈤堿噴沖：15分；㈥清水沖洗；㈦酸性水沖洗。第五十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日6、設備及管路的殺菌發(fā)酵罐及容器的殺菌過程容器的氣密性試驗，打開所有的冷凝水排除閥，開啟進蒸汽閥。一定壓強后，打開排空氣閥，把容器中原有的空氣排除干凈。當罐內壓強升至0.1MPa(121℃)，計滅菌時間，殺菌過程中不斷排除蒸汽管路及罐內的蒸汽冷凝水。結束滅菌操作時，先關閉所有排污閥及排氣閥，然后關蒸汽進口閥，打開無菌空氣進口閥，以確保罐內壓強。第五十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日設備及管路的殺菌空氣分布器的蒸汽滅菌管路布置導流筒空氣分布器BA無菌空氣蒸汽第六十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日設備及管路的殺菌浸沒管路與旁路進口管的殺菌布管蒸汽蒸汽AB蒸汽進料管ABC第六十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日蒸汽滅菌無菌排料ABCEDF蒸汽冷凝水排污或CIP返回排料系統(tǒng)蒸汽殺菌第六十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日設備及管路的殺菌罐的CIP清洗系統(tǒng)蒸汽殺菌配管CIPABC蒸汽第六十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日設備及管路的殺菌發(fā)酵罐攪拌器密封裝置的蒸汽滅菌配管第六十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日設備及管路的殺菌空氣過濾器的殺菌止逆閥第六十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日設備及管路的殺菌閥門的殺菌(2)隔膜閥第六十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日設備及管路的殺菌取樣閥門的殺菌第六十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日保證管道徹底滅菌的設計要求管道應有一定的斜度，通常取1/100或更大；凹陷低點安裝排污閥；管路有足夠的支撐點；盡可能減少和簡化管路，盡可能少用彎頭管件和閥門；盡可能減少最高與最低點，且在每個最高點裝設蒸汽進管，在最低點均裝冷水閥；每個罐及管道盡可能分開滅菌。這樣才能保證蒸汽殺菌的嚴密性與穩(wěn)定安全性。設備及管路的殺菌第六十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日1罐2罐兩個罐及連接管的蒸汽殺菌ACBDEF第六十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日冷凝水的排放自由排放用汽水閥自動排放利用計算機自動控制排除冷凝水設備及管路的殺菌第七十頁，共一百零一頁，2022年，8月28日空罐滅菌

滅菌溫度和滅菌時間的要求是高溫長時(121℃，60分鐘)，既合理經濟，又能殺滅設備中各死角殘存的雜菌或芽孢。

設備及管路的殺菌第七十一頁，共一百零一頁，2022年，8月28日通氣發(fā)酵罐清洗與滅菌管路圖止回閥第七十二頁，共一百零一頁，2022年，8月28日三路進汽：在對培養(yǎng)基滅菌時，直接蒸汽從通風、取樣和出料口進入罐內直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時間,達到培養(yǎng)基滅菌之目的。實罐滅菌的進汽和排氣原則:“非進即出”，就是說所有進入發(fā)酵罐的管道在滅菌過程中如果不進入蒸汽就一定要進行排氣，使所有管道都被蒸汽（或二次蒸汽）通過，得以滅菌。不能有既不進汽也不排汽的管道（死角）存在。

發(fā)酵罐實罐滅菌第七十三頁，共一百零一頁，2022年，8月28日四、操作失誤導致染菌及其防治1、通常對于淀粉質培養(yǎng)基的滅菌采用實罐滅菌較好，先配料，過濾大顆粒物之后，在進行滅菌。2、在滅菌升溫時，要打開排氣閥門，使蒸汽能通過并驅除罐內冷空氣，一般可避免“假壓”造成染菌（自動控溫）。3、為加快升溫速度，凡能進蒸汽的管路在滅菌時都可同時進汽，但各管路的阻力不同，易造成蒸汽短路現象，使物料受熱不勻，需調整各進汽管的流量。4、滅菌蒸汽要求采用飽和蒸汽，冷凝水越少越好，滅菌時蒸汽壓力要求平穩(wěn)。第七十四頁，共一百零一頁，2022年，8月28日5、泡沫問題培養(yǎng)基和水的傳熱系數比空氣的傳熱系數大，如果滅菌時升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內的空氣排出較慢，就會產生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。4、其他操作問題

實罐滅菌時，罐內因蒸汽冷凝而使罐壓突然降低甚至會形成真空，所以此時必須將無菌空氣通入罐內保持一定壓力，并注意壓力變化，隨時進行調節(jié)。5、發(fā)酵過程越來越多的采用自動控制，一些控制儀器逐漸被應用。一般常采用化學試劑浸泡等方法來滅菌。第七十五頁，共一百零一頁，2022年，8月28日五、發(fā)酵染菌后的措施1、如果種子培養(yǎng)或種子罐中發(fā)現污染——倒罐2、發(fā)酵早期染菌——可以適當添加營養(yǎng)物質，重新滅菌后再接種發(fā)酵。或采用加大接種量的辦法3、中、后期染菌，如果雜菌的生長將影響發(fā)酵的正常進行或影響產物的提取時，應該提早放罐。但對發(fā)酵液中的碳、氮源還較多，此時應先設法使碳、氮源消耗，再放罐提取?；蛟谌揪陌l(fā)酵液內添加抑菌劑(如小劑量的抗菌素或醛類)用以抑制雜菌的生長也是一種辦法。第七十六頁，共一百零一頁，2022年，8月28日5、染菌后的培養(yǎng)基必須滅菌后才可放下水道。滅菌方法：可通蒸汽滅菌，也可加入過氧乙酸等化學滅菌劑攪拌半小時，才放下水道。否則由于各罐的管道相通，會造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也會造成空氣的污染而導致其它罐批染菌。6、染菌厲害時，車間環(huán)境（罐內、原料儲罐等）要用石灰或甲醛熏蒸消毒。7、凡染菌的罐要找染菌的原因，對癥下藥。第七十七頁，共一百零一頁，2022年，8月28日六、染噬菌體的防治1、染噬菌體對發(fā)酵的影響發(fā)酵過程中如果受噬菌體的侵染，一般發(fā)生溶菌，隨之出現發(fā)酵遲緩或停止，而且受噬菌體感染后，往往會反復連續(xù)感染，使生產無法進行，甚至使種子全部喪失。第七十八頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2、染噬菌體表現為：（1）、鏡檢可發(fā)現菌體數量明顯減少，菌體不規(guī)則，嚴重時完全看不到菌體，且在短時間內菌體自溶。（2）、發(fā)酵pH值逐漸上升，4~8小時之內可達8.0以上，不再下降。（3）、發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。?）、生產量甚少或增長緩慢或停止第七十九頁，共一百零一頁，2022年，8月28日2、產生噬菌體的原因通常在工廠投產初期并不感到噬菌體的危害，經過1~2年以后，主要是由于生產和試