產(chǎn)前分子診斷中需要注意的若干問題鄭主任修改

產(chǎn)前分子診斷中需要注意的若干問題

產(chǎn)前診斷基本概念染色體核型分析NIPT/CNV巨細(xì)胞病毒的檢測目錄產(chǎn)前診斷，又稱宮內(nèi)診斷或出生前診斷，是對胚胎或胎兒是否患某種嚴(yán)重遺傳病或先天性畸形做出準(zhǔn)確診斷，以預(yù)防患兒的出生，是預(yù)防優(yōu)生學(xué)的重要組成部分。一、產(chǎn)前診斷的基本概念（一）產(chǎn)前診斷的定義（一）產(chǎn)前診斷的意義1.優(yōu)生的重要措施，減少出生缺陷，提高全民素質(zhì)2.減輕家庭及社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)3.阻斷致病基因在家族中的傳遞4.給孕婦有更大的空間和更多的選擇，對于高危孕婦同樣可以懷孕并且得到一個健康的小孩5.考慮要保存患病胎兒的孕婦，提供宮內(nèi)治療的可行性，提供良好的產(chǎn)前治療依據(jù)一、產(chǎn)前診斷的基本概念篩查/

診斷篩查/診斷新生兒篩查篩查/診斷三級預(yù)防一級預(yù)防二級預(yù)防產(chǎn)前孕前植入前一、產(chǎn)前診斷的基本概念出生缺陷的三級預(yù)防（三）產(chǎn)前診斷的指征

35歲以上的高齡孕婦羊水過多的孕婦有原因不明的習(xí)慣性流產(chǎn)史的孕婦具有遺傳病家族史，或系近親婚配的孕婦

X連鎖遺傳病基因攜帶者孕婦夫婦之一有致畸因素接觸史的孕婦夫婦之一有染色體畸變，特別是平衡易位攜帶者；夫婦核型雖正常，但生育過染色體病患兒的孕婦。夫婦之一有開放性神經(jīng)管畸形，或是生育過這種畸形兒的孕婦夫婦之一有先天性代謝缺陷，或生育過這種患兒的孕婦一、產(chǎn)前診斷的基本概念（四）產(chǎn)前診斷技術(shù)產(chǎn)前診斷技術(shù)包括兩方面：

取材技術(shù)、實驗室檢測技術(shù)一、產(chǎn)前診斷的基本概念取材技術(shù)非侵入性：超聲波檢查母血胎兒細(xì)胞檢查

母血胎DNA/RNA檢查侵入性：絨毛取樣（孕7-9周）

羊膜腔穿刺（孕16-20周）臍帶穿刺（孕20-24周）

胎兒鏡檢查（孕18-20周）

產(chǎn)前診斷檢測技術(shù)應(yīng)用范圍一、產(chǎn)前診斷的基本概念（一）應(yīng)選擇合適的時期和方法進(jìn)行染色體相關(guān)疾病的產(chǎn)前診斷

二、染色體核型分析孕期12-26+6w＜16w16-22w24-28w樣本外周血胎兒DNA絨毛羊水臍帶血方法NIPT核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS報告時間10個工作日FISH：1w核型：3wNGS：10個工作日FISH：1w核型：3wNGS：10個工作日FISH：1w核型：3wNGS：10個工作日染色體核型：46，X，del（X）（q25）

（二）典型案例分析A：女，36，體格檢查未見明顯異常二、染色體核型分析染色體核型：45，XY，rob（13；13），-13，-13（二）典型案例分析B：男，50，身體健康二、染色體核型分析（二）典型案例分析C：劉××，女，表型正常二、染色體核型分析45，XX，rob（14；21）（q10；q10）

？女方：28歲，孕3產(chǎn)0，胎停育2次，染色體核型：46XX,

t（3;5）(q25；p15)男方：核型正常孕20周，外院影像學(xué)排畸沒有發(fā)現(xiàn)異常二、染色體核型分析（三）多種方法平行使用A——3號和5號染色體平衡異位患者胎兒CNV檢測愉快木偶綜合征（快樂天使綜合征）染色體異常：15q11-q13缺失發(fā)病率：1/40000臨床特征：小頭畸形、嚴(yán)重智力障礙、語言障礙、共濟(jì)失調(diào)步態(tài)、好動、無意識發(fā)笑機(jī)制：母源性15q11-q13缺失或UBE3A基因突變二、染色體核型分析（三）多種方法交叉使用B——Angelman綜合征患兒染色體核型未見異常二、染色體核型分析FISH檢測結(jié)果示：15q11-q13缺失二、染色體核型分析33歲孕婦，孕24周，46，XN，B超提示胎兒多處軟指標(biāo)異常，表現(xiàn)為胎兒頸后軟組織增厚，腸管回聲增強(qiáng)，單臍動脈，對培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞進(jìn)行了高通量測序染色體異常檢測，結(jié)果顯示：存在1處染色體結(jié)構(gòu)異常：22q11.21-22q11.23存在2.3M缺失，該片段包UBE2L3,YDJC,CCDC116等幾十個基因或基因片段。22q11.21-22q11.23區(qū)域的片段缺失與22q11.2缺失綜合征（22q11.2deletionsyndrome）有關(guān)，臨床表現(xiàn)為身材矮小，面部異常，智力障礙等。二、染色體核型分析（三）多種方法交叉使用——核型正常，B超異常的染色體因素深度排查（一）NIPT結(jié)果分析？

結(jié)果檢測項目陽性真陽性假陽性假陰性拒絕隨訪/失聯(lián)21三體0.199%0.111%0.044%0.022%0.044%性染色體異常0.155%0.044%0.044%-----0.066%二、NIPT/CNVNIPT的假陽性胎兒染色體核型分型重視知情同意2.NIPT的假陰性重視影像學(xué)的檢查？

結(jié)果檢測項目陽性真陽性假陽性假陰性拒絕隨訪或失聯(lián)21三體0.199%0.111%0.044%0.022%0.044%（個別拒絕隨訪）性染色體異常0.155%0.044%0.044%-----0.066%二、NIPT/CNV胎盤嵌合-假陽性發(fā)生率約1/1000NewEnglandJournalofMedicine，371;6577-578（2014）胎盤嵌合-假陰性2117周NIPT檢測結(jié)果：45，XO；羊穿結(jié)果：47，XX，+18MolecularCytogenetics.

2014,7:48假陰性原因排查過程原因排查過程

取樣：母親血細(xì)胞DNA、胎兒組織、胎盤組織

分析方法：測序、FISH和CMA母親核型正常46，XX（排除母體干擾）NIPT流產(chǎn)的胎兒組織：

T18胎盤組織：45,X(~60%)

andT18(嵌合率~30%)FISH流產(chǎn)的胎兒組織：

T18胎盤組織：45,X

cells(67%,62/92)andT18cells(30%,28/92)SNP-array流產(chǎn)的胎兒組織：

T18胎盤組織：45,Xcells(67%)andT18cells(50%)胎兒為100%濃度的47，XX，+18胎盤嵌合，大部分細(xì)胞為45,XO;少量細(xì)胞為47，XX，+18

母體自身染色體異常干擾樣本ID實驗編號chr13chr18chr21180100721-0.4263.713-1.256180100722-0.5763.2290.366180100723-1.1094.207-0.676180100724-1.0152.816-0.631孕婦年齡30歲，孕27周，NIPT多次上機(jī)均提示T18高風(fēng)險。胎兒B超未發(fā)現(xiàn)任何異常，羊穿顯示為46，XY。后來CNV分析顯示為母體18號染色體短臂微重復(fù)所致的假陽性。影響無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的因素母體染色體核型異常：母體的實質(zhì)腫瘤：發(fā)生內(nèi)在基因組成改變的狀況胎盤嵌合體（confinedplacentalmosaicism，CPM）染色體單親二倍體（uni-parentaldisomy,UPD）胎兒嵌合孿生兒消失現(xiàn)象胎兒游離DNA濃度太低：實驗室操作錯誤

孕周（>12W）妊娠情況（單胎/雙胎/多胎?）既往病史

如異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、免疫治療、腫瘤、病毒感染等可能引入外源DNA或改變胎兒游離DNA的組成和比例，影響檢測結(jié)果）樣本狀態(tài)及運(yùn)輸

溶血？是否及時采用冷鏈運(yùn)輸知情同意非常重要！！分析前質(zhì)量控制分析中質(zhì)量控制產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)合理的實驗室分區(qū)嚴(yán)格的實驗室環(huán)境控制（如溫濕度，穩(wěn)壓或不間斷電源）儀器設(shè)備及管理（PCR儀、離心機(jī)、加樣器等定期維護(hù)并校準(zhǔn)）人員資質(zhì)及培訓(xùn)產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測序技術(shù)）緩沖間測序區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向文庫擴(kuò)增與檢測區(qū)標(biāo)本與文庫制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)胎兒游離DNA濃度測定方法

多重SNP法(>4%)

Y染色體法文庫構(gòu)建--DNA片段篩選盡可能消除母體基因組DNA的背景干擾，富集游離DNA（cfDNA）分析中質(zhì)控準(zhǔn)確的文庫質(zhì)檢是后續(xù)獲得高質(zhì)量、均一數(shù)據(jù)的關(guān)鍵分析中質(zhì)量控制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線法文庫濃度測定：1.qPCR法/Qubit對DNA濃度準(zhǔn)確定量；2.Aiglent2100對文庫的質(zhì)量進(jìn)行定性2100檢測結(jié)果分析后質(zhì)量控制

審核項數(shù)據(jù)要求異常處理原始數(shù)據(jù)量（M）≥3.5M重上機(jī)Q30(1000個堿基中的錯誤率)≤85重上機(jī)Uniquereads數(shù)量（M）≥2M重上機(jī)比對率≥62.5%重建庫Duplication率≤15%重建庫樣本GC含量EDTA:

38%-42%Ardent:

35%-42%重建庫分析完成后，首先查看原始數(shù)據(jù)量，Q30，對照品結(jié)果和GC偏移度是否通過等等..下機(jī)樣本數(shù)據(jù)要求（二）CNV結(jié)果的解讀發(fā)現(xiàn)明確致病的基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）未檢出染色體非整倍體或100kb以上已知明確致病的基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）其他類型100Kb以上的拷貝數(shù)變異（CNVs）

數(shù)據(jù)庫中沒有記錄的

數(shù)據(jù)庫中記錄為多態(tài)性的二、NIPT/CNVCNV結(jié)果分析樣本類型臨床意義沒有檢出致病性CNV意義不明CNV多態(tài)性總例數(shù)外周血43110761羊水0241126流產(chǎn)物34115353臍血10001總數(shù)7836161114二、NIPT/CNV特別關(guān)注?。。【藜?xì)胞病毒感染的現(xiàn)況胎兒先天性巨細(xì)胞病毒感染的后果巨細(xì)胞病毒的血清學(xué)檢測巨細(xì)胞病毒的分子檢測重視孕婦和新生兒的巨細(xì)胞病毒的檢測四、巨細(xì)胞病毒的檢測1.巨細(xì)胞病毒感染現(xiàn)況巨細(xì)胞病毒血清學(xué)檢測

IgG和IgM滴度

IgG親和力四、巨細(xì)胞病毒的檢測1.巨細(xì)胞病毒感染現(xiàn)況IgG抗體檢測陽性率：>90%IgM抗體檢測陽性率（4.5個月）

產(chǎn)科+生殖科：11/1038=0.0106兒科：41/940=0.0436

四、巨細(xì)胞病毒的檢測圍產(chǎn)期感染宮內(nèi)感染(先天性CMV感染)2.胎兒巨細(xì)胞病毒感染我國育齡婦女幾乎均為巨細(xì)胞病毒抗體陽性；巨細(xì)胞病毒的先天性感染是兒童感覺神經(jīng)性耳聾最主要的病因，早期診斷價值高；抗體陽性孕婦對巨細(xì)胞病毒的垂直傳播并不低于孕期胎兒的原發(fā)性感染。四、巨細(xì)胞病毒的檢測垂直傳播：病毒血癥孕婦的垂直傳播率高達(dá)44%不良妊娠結(jié)局：死胎90%出生時沒有癥狀，后遺癥13%10%出生時有癥狀，60%的后遺癥：聽力、視力、智力，腦發(fā)育和肝脾、血液系統(tǒng)等（7歲前發(fā)生）羊水的病毒載量與垂直傳播風(fēng)險和后遺癥的癥狀相關(guān)原發(fā)性感染復(fù)發(fā)性感染潛伏在體內(nèi)的CMV被重新激活再次感染外源性其他血清型的病原體。如果妊娠前的免疫狀態(tài)未知，診斷基于特異性IgM抗體，特異性IgM抗體陽性的孕婦只有部分為原發(fā)性感染復(fù)發(fā)性感染孕婦中也可檢出IgM抗體，并且原發(fā)性感染數(shù)月后血清中還可檢出IgM抗體IgM抗體陽性可能還包括IgM抗體假陽性者抗體：間隔3～4周后重復(fù)測定診斷依據(jù)包括血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(初次血清抗體陰性的孕婦出現(xiàn)特異性IgG抗體)，或者IgG抗體滴度增加4倍IgG抗體親和力測定：親和力指