治療藥物監(jiān)測(cè)HLC方法建立

治療藥物監(jiān)測(cè)HPLC分析方法建立探討

王峰HPLC在治療藥物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用監(jiān)測(cè)藥物種類繁多：茶堿、華法令、氯丙嗪、抗癲癇類藥物、鎮(zhèn)靜催眠類藥物、胺碘酮、免疫抑制藥物等等?？杀O(jiān)測(cè)濃度范圍：紫外可見光監(jiān)測(cè)器，熒光檢測(cè)器（高２－３各數(shù)量級(jí)），電化學(xué)檢測(cè)器（10-12g），質(zhì)譜檢測(cè)器（10－１５g)，但具體與藥物本身結(jié)構(gòu)與檢測(cè)條件有關(guān)主要的缺陷：操作復(fù)雜、容易被干擾、建立治療藥物監(jiān)測(cè)方法的準(zhǔn)備工作了解所要監(jiān)測(cè)藥物的基本情況：監(jiān)測(cè)范圍、理化性質(zhì)、監(jiān)測(cè)意義查閱文獻(xiàn)結(jié)合實(shí)際條件。方法學(xué)問題探討１、為什么要考察標(biāo)準(zhǔn)曲線？２、為什么要考察緊密度？3、為什么要考察方法回收率？４、為什么要考察絕對(duì)回收率？１、用已知的東西去了解未知東西。２、合理的東西是多大概率上的合理

為什么要考察標(biāo)準(zhǔn)曲線—定量分析依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線是定量分析的根本依據(jù)１、藥物濃度（或質(zhì)量）與藥物在檢測(cè)器上的產(chǎn)生的信號(hào)（通常采用峰面積A）成比例(正比)即C１／C１＝A１／A２或M１／M２＝A１／A２圖示：通常外標(biāo)法計(jì)算CX：CX／C０＝AX/A０結(jié)論：所建立的方法充分條件就是測(cè)定范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)趨向成線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的幾個(gè)問題NCCLSEP6-P，定量分析方法線性的評(píng)價(jià)：推薦指南（1986）。本文件包含評(píng)價(jià)儀器或定量分析方法是否滿足制造商線性要求的方法;以及為廠商提供了檢測(cè)線性范圍聲明的指南。本文件為設(shè)計(jì)評(píng)估臨床化學(xué)儀器精密性能試驗(yàn)提供了指南；將結(jié)果估計(jì)的精密度與制造商的精密要求進(jìn)行比較，以及確定比較是否有效。１、相關(guān)系數(shù)是評(píng)價(jià)線性的客觀標(biāo)準(zhǔn)，但應(yīng)考慮到實(shí)際測(cè)定的需要，合理采用權(quán)重系數(shù)（１／x,1/x2,1/y,1/y2)（回收率）２、標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍確定取決于樣品最低濃度與最高濃度。３、研究方法線性一般采用6-10點(diǎn)，并非點(diǎn)越多越好，合理是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的合理。４、影影響標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲曲線的的可能能因素素儀器相相應(yīng)因因素（（儀器器響應(yīng)應(yīng)線性性與方方法線線性的的關(guān)系系）樣品方方法因因素色譜條條件２、為為什么么要考考察精精密度度－標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲曲線的的必要要保證證精密度度考察察的幾幾個(gè)問問題EP5-A，臨臨床化化學(xué)設(shè)設(shè)備精精密性性能的的評(píng)價(jià)價(jià)：批批準(zhǔn)指指南（（1999）。。本文件件為設(shè)設(shè)計(jì)評(píng)評(píng)估臨臨床化化學(xué)儀儀器精精密性性能試試驗(yàn)提提供了了指南南；將將結(jié)果果估計(jì)計(jì)的精精密度度與制制造商商的精精密要要求進(jìn)進(jìn)行比比較，，以及及確定定比較較是否否有效效。１、精精密度度表示示平行行測(cè)定定結(jié)果果的互互相接接近程程度,一般般用變變異系系數(shù)(coefficientofvariation,cv)表表示。。亦即即重復(fù)復(fù)測(cè)定定同一一實(shí)際際樣品品或模模擬生生物樣樣品的的相對(duì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差差(ＲＲＳＤＤ)。。２、ＣＣＶ可可分為為日內(nèi)內(nèi)（withinday)CV和和日間間(daytoday)ＣＶＶ,批批內(nèi)(intraasay)ＣＶＶ和批批間(interassay)。。批內(nèi)內(nèi)、批批間ＣＣＶ更更具有有實(shí)際際意義義.一般要要求ＣＣＶ應(yīng)應(yīng)小于于15%,低濃濃度水水平或或復(fù)雜雜方法法可放放寬到到小于于20%。。精密度度僅表表示測(cè)測(cè)定的的重現(xiàn)現(xiàn)性,但精精密是是保證證準(zhǔn)確確的提提前。。精密度度考察察設(shè)計(jì)計(jì)：３３－５５點(diǎn)，，２樣樣品２２平行行3、為為什么么要考考察方方法回回收率率？——標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線線效能能指標(biāo)標(biāo)方法回回收率率計(jì)算算R１＝＝C１１／C1｀｀R２＝＝C２２／C２｀｀C：通通過標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲曲線計(jì)計(jì)算所所得濃濃度C｀：：實(shí)際際加入入標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品濃濃度R：回回收率率EP10-A定量臨臨床檢檢驗(yàn)方方法的的初步步評(píng)價(jià)價(jià)：批批準(zhǔn)指指南（（1998）。。本指南南討論論分析析方法法或儀儀器性性能初初步評(píng)評(píng)價(jià)的的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)設(shè)計(jì)計(jì)和數(shù)數(shù)據(jù)分分析（（參見見相產(chǎn)產(chǎn)出版版物GP10-A））相對(duì)回回收率率幾點(diǎn)點(diǎn)問題題定義：：回收收率是是用來來衡量量測(cè)定定方法法對(duì)生生物樣樣品中中待測(cè)測(cè)物的的檢測(cè)測(cè)效能能的,表示示測(cè)定定結(jié)果果與真真實(shí)值值的接接近程程度,亦即即測(cè)量量值的的正確確性。。高、中中、低低濃度度回收收率可可能不不同。。相對(duì)對(duì)回收收率能能直接接反映映測(cè)定定結(jié)果果與真真實(shí)值值的接接近程程度,應(yīng)控控制在在100%左右右(95%～105%)。絕對(duì)回回收率率—另另一個(gè)個(gè)概念念模擬生生物樣樣品經(jīng)經(jīng)整個(gè)個(gè)樣品品處理理過程程,而而相應(yīng)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)溶液液直接接分析析,兩兩者的的響應(yīng)應(yīng)值之之比稱稱為絕絕對(duì)回回收率率(ａａｂｓｓｏｌｌｕｔｔｅｒｒｅｃｃｏｖｖｅｒｒｙ);絕對(duì)回回收率率計(jì)算算R＝A１／／A2絕對(duì)回回收率率幾個(gè)個(gè)問題題絕對(duì)回回收率率與相相對(duì)回回收率率關(guān)系系絕對(duì)回回收率率與相相對(duì)精精密度度的關(guān)關(guān)系絕對(duì)回回收率率要求求,所所得響響應(yīng)值值之比比稱為為相對(duì)對(duì)回收收率relativerecovery)。絕絕對(duì)回回收率率一般般應(yīng)大大于70%,過過低說說明方方法中中待測(cè)測(cè)物質(zhì)質(zhì)損失失嚴(yán)重重,過過高(>105%)靈敏度度（sensitivity）,檢測(cè)測(cè)限(limitofdetection,LOD)ＬＬＯＤＤ是指指分析析方法法定性性檢測(cè)測(cè)生物物樣品品中待待測(cè)物物的最最低濃濃度。。Ｓ/Ｎ)≥3定量限(Limtofquantification,LOQ)ＬＬＯＱ是是指分析析方法能能準(zhǔn)確精精密定量量測(cè)定生生物樣品品中待測(cè)測(cè)物的最最低濃度度。Ｓ/Ｎ≥10專屬性考考察EP7-P，臨臨床化學(xué)學(xué)干擾試試驗(yàn)，推推薦指南南（1986））。本指南提提供了描描述干擾擾物質(zhì)對(duì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)結(jié)果影響響的信息息及程序序。質(zhì)量控制制(ｑｕｕａｌｉｉｔｙｃｃｏｎｔｔｒｏｌｌ,ＱＣＣ)室內(nèi)質(zhì)控控質(zhì)量控制制(QualityControl,QC)為達(dá)到質(zhì)質(zhì)量要求求所采取取的作業(yè)業(yè)技術(shù)和和活動(dòng)。。質(zhì)量控制制包括作作業(yè)技術(shù)術(shù)和活動(dòng)動(dòng)，其目目的在于于監(jiān)視過過程，并并排除質(zhì)質(zhì)量環(huán)節(jié)節(jié)中所有有階段中中導(dǎo)致不不滿意的的原因，，以取得得經(jīng)濟(jì)效效益。質(zhì)量控制制和質(zhì)量量保證的的某些活活動(dòng)是相相互聯(lián)系系的。室間質(zhì)評(píng)評(píng)室間質(zhì)量量評(píng)價(jià)（（ExternalQualityAssessment,EQA））由非本單單位的機(jī)機(jī)構(gòu)，采采用一系系列辦法法來客觀觀地評(píng)價(jià)價(jià)實(shí)驗(yàn)室室的結(jié)果果，其主主要目的的是建立立實(shí)驗(yàn)室室間的可可比性。。該計(jì)劃劃是多個(gè)個(gè)標(biāo)本周周期性地地發(fā)送到到實(shí)驗(yàn)室室進(jìn)行分分析和/或鑒定定，將每每一實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室的結(jié)結(jié)果與同同組的其其它實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室的結(jié)結(jié)果或靶靶值進(jìn)行行比較，，并將比比較的結(jié)結(jié)果報(bào)告告給參與與的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室。方法學(xué)回回顧用已知證證明未知知合理是統(tǒng)統(tǒng)計(jì)上的的合理標(biāo)準(zhǔn)曲線線是根本本精密度結(jié)結(jié)果是標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線線的保障障相對(duì)回收收率是分分析方法法的效能能指標(biāo)絕對(duì)回收收率是重重要相關(guān)關(guān)因素靈敏度、、檢測(cè)限限、選擇擇性是性性能參數(shù)數(shù)治療藥物物監(jiān)測(cè)方方法的特特點(diǎn)臨床要求求快速速樣品量少少，一一般１毫毫升樣品復(fù)雜雜，不確確定干擾擾較多測(cè)定準(zhǔn)確確度要求求高治療藥物物監(jiān)測(cè)方方法的建建立的一一般過程程基本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)技術(shù)5.2.1樣樣品制備備目的是使使樣品與與所使用用的HPLC方方法相兼兼容，即即把分析析樣品中中的待測(cè)測(cè)組分轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為適適合HPLC直直接進(jìn)樣樣分析的的試液。。對(duì)于一一些較復(fù)復(fù)雜的樣樣品，樣樣品制備備還包括括預(yù)分離離富集、、衍生化化等預(yù)處處理步驟驟。液相相色譜法法的精密密度和準(zhǔn)準(zhǔn)確度往往往取決決于樣品品制備的的質(zhì)量。。一、樣品品的溶解解用于溶解解分析樣樣品的溶溶劑應(yīng)與與液相色色譜流動(dòng)動(dòng)相互溶溶，最好好選用流流動(dòng)相來來溶解或或提取被被分析樣樣品的待待測(cè)組分分，這樣樣可以避避免溶劑劑峰的干干擾。制制備好好的分析析試液應(yīng)應(yīng)為均相相溶液，，無不溶溶物，否否則在進(jìn)進(jìn)行色譜譜分析之之前應(yīng)進(jìn)進(jìn)行0.45μμm或0.2μμm微孔孔膜過濾濾。樣品前處處理一過濾和和離心對(duì)于基體體復(fù)雜的的樣品液液，不溶溶物可以以通過過過濾或高高速離心心除去。。有時(shí)加加入合適適沉淀劑劑或改變變?nèi)軇?，，使大分分子基質(zhì)質(zhì)以沉淀淀方式除除去。液液萃取取水樣中的的許多待待測(cè)有機(jī)機(jī)化合物物可以通通過液液液萃取到到有機(jī)相相后進(jìn)行行液相色色譜分析析。固相萃取取利用選擇擇性吸附附與選擇擇性洗脫脫的液相相色譜分分離原理理，使液液體樣品品通過一一吸附劑劑小柱，，保留其其中某些些組分，，再選用用適當(dāng)?shù)牡娜軇_沖洗雜質(zhì)質(zhì)，然后后用少量量溶劑迅迅速洗脫脫，從而而達(dá)到快快速分離離凈化與與濃縮的的目的。。流動(dòng)相的的配制一、配制制對(duì)于二元元溶劑或或多元溶溶劑等度度洗脫，，液相色色譜流動(dòng)動(dòng)相通常常均按溶溶劑體積積比配制制。要求求溶劑必必須互溶溶。二、過濾濾HPLC流動(dòng)相相使用前前要用0.45m微微孔膜過過濾。三、脫氣氣（1）溶溶于流流動(dòng)相的的空氣會(huì)會(huì)影響液液相色譜譜系統(tǒng)的的操作性性能。如如氣泡進(jìn)進(jìn)入泵腔腔將使高高壓泵流流速不穩(wěn)穩(wěn)；而流流動(dòng)相通通過柱子子時(shí)其中中的氣泡泡受到壓壓力而壓壓縮，流流出柱子子到檢測(cè)測(cè)器時(shí)，，會(huì)因?yàn)闉閴毫到抵脸簤憾鴮鈿馀葆尫欧懦鰜?，，造成檢檢測(cè)器噪噪聲增大大，基線線不穩(wěn)。。流動(dòng)相配制過濾脫氣接抽氣機(jī)微孔膜泵泵泵泵泵泵治療藥物物監(jiān)測(cè)HPLC分析方方法建立立實(shí)例HPLC－UV測(cè)定甲甲氨喋呤呤血藥濃濃度1、甲氨氨喋呤血血藥濃度度監(jiān)測(cè)解解決什么么問題血藥濃度度監(jiān)測(cè)能能有效反反映MTX在體體內(nèi)的濃濃度變化化過程，，從而為為臨床治治療與解解救提供供參考大劑量MTX化化療是兒兒童急性性淋巴細(xì)細(xì)胞白血血?。ˋLL）聯(lián)聯(lián)合化療療方案的的重要組組成部分分遇到什么么問題國內(nèi)有關(guān)關(guān)HPLC測(cè)定定MTX的方法法[1-4]進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)時(shí)，發(fā)發(fā)現(xiàn)樣品品用蛋白白沉淀法法，低濃濃度時(shí)MTX受受雜峰干干擾嚴(yán)重重，且難難以達(dá)到到臨床所所需最低低定量濃濃度，而而固相萃萃取方法法則難以以滿足寬寬濃度線線性范圍圍的要求求，且分分析成本本高、周周期長。。[1]GEYong-qian（葛葛勇前）），LUGuo-chun（陸國國椿）。。QuantitationofPlasmaMethotrexateContentbyHPLC（HPLC法法測(cè)定人人血漿中中甲氨喋喋呤的濃濃度）.ChinJPharmAnal（藥物分分析雜志志），2001，21（6））418～420（inChinese））[2]ZhangHuanian（（張華年年），WenLingli（文玲玲莉），，ZhangShaowen（張張少文）），etal.HPLCAssayforMethotrexateUtilizingSolidPhaseExtractionPurificationandSeparationofBiologicalSample（固固相萃取取高效液液相色譜譜法檢測(cè)測(cè)生物樣樣本中甲甲氨喋呤呤）.ChinJPharmAnal（藥物分分析雜志志），2000，20（6））：401～～40（inChinese））[3]WuChuang（吳闖闖），YangZhenhong（楊楊正鴻）），LinGuiyiun（林貴貴遠(yuǎn)），，etal.DeterminationofmethotrexatelevelinplasmaandcereberospinalfluibyHPLC（（反相高高效液相相色譜法法測(cè)定血血漿和腦腦脊液中中甲氨喋喋呤濃度度），（（中國醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)學(xué)雜志）），1999，，19（（5）：：272-274（inChinese）[4]ZhangBi-kui(張畢畢奎)，，LIHuan-de(李李煥德)，ZHANGXiang-sheng(張湘湘生),etal.Studiesonserumdrugmonitoringandeliminationofhigh-doseMTXchemotherapyinpatientswithboneandsofttissuemalignanttumors(骨骨及組織織腫瘤大大劑量甲甲氨喋呤呤化療時(shí)時(shí)血藥濃濃度的動(dòng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)測(cè)及體內(nèi)內(nèi)消除研研究).ChinPharmJ,(中中國藥學(xué)學(xué)雜志)2002.4.;37(4):290-293色譜條件件選擇色譜柱為為ZirchromKromasilC18柱（（250××4.6mm，5μm），，柱溫40℃℃，流動(dòng)動(dòng)相為乙乙腈：25mmol.L-