轉基因動物和轉基因技術概論分析研究 生物技術專業(yè)

轉基因動物和轉基因技術概論摘要：近年來生物科學技術飛快發(fā)展，轉基因技術在研發(fā)方面取得了全球化性進展，并已顯示了極高的效益，本文綜述了轉基因技術的原理及轉基因動物的發(fā)展歷史，重點闡述了轉基因技術用于動物科學的各個領域的進展及突破性成果,尤其在研究基因功能、轉基因動物育種（抗病育種和提高生產性能）、治療人類疾?。ㄉa藥用蛋白和異種器官移植）等方面得到了廣泛的應用，并提出了轉基因動物技術存在的一些技術難題和安全性問題，最后對轉基因技術的未來發(fā)展進行了展望。關鍵詞：轉基因技術；轉基因動物；實驗動物；生物反應器；疾病模型IntroductiontotransgenicanimalsandtechnologyAbstract:Inrecentyears,withtherapiddevelopmentofbiologicalscienceandtechnology,transgenictechnologyhasmadeglobalprogressinresearchanddevelopment,andhasshowngreatbenefits.Thispapersummarizestheprincipleoftransgenictechnologyandthedevelopmenthistoryoftransgenicanimals,focusingontheprogressandbreakthroughachievementsoftransgenictechnologyinvariousfieldsofanimalscience.

Inparticular,itiswidelyusedintheresearchofgenefunction,transgenicanimalbreeding(disease-resistancebreedingandimprovementofproductionperformance),treatmentofhumandiseases(productionofpharmaceuticalproteinandxenotransplantation).

Sometechnicalproblemsandsafetyproblemsoftransgenicanimaltechnologywereputforward.Finally,thefuturedevelopmentoftransgenictechnologywasprospected.Keywords:TransgenicTechnology;TransgenicAnimals;ExperimentalAnimals;Bioreactor;Diseasemodel引言20世紀生命科學與技術的迅猛發(fā)展，科學界對于生物體的研究從宏觀逐漸發(fā)展到微觀，對生物體的操作也從隨機逐漸變?yōu)槎ㄏ蚍肿由飳W迅速發(fā)展，DNA重組，細胞融合等技術日益成熟，轉基因技術得以誕生，到目前為止，轉基因動物已經經歷了30多年的發(fā)展，其技術體系也日趨成熟[1]。轉基因技術是指將人為選擇的優(yōu)質外源基因，通過剪切、修飾轉移到受體細胞中，而達到人為地改變受體生物性狀的目的。通過這種技術可將選定的個體的優(yōu)良基因由一個生物體轉移到另一個生物體，也可在不相關的物種之間進行轉移。通過各種方法將外源性基因插入動物生殖細胞的基因組而獲得具有插入基因特性，并能正常繁衍的動物稱為轉基因動物（transgenicanimals）。動物個體被認為是生物學研究，藥物開發(fā)、毒理學和安全篩選研究中不可或缺的工具，而目前轉基因動物是生物科學最有效、最令人振奮的研究手段之一。轉基因技術在動物品種的改良，生物反應器的開發(fā)，人類模型和藥物篩選模型的的建立，以及異種器官供體的構建等領域不斷發(fā)展。轉基因物種涉及了豬、牛、羊、雞、魚、家蠶、果蠅等，涉及的性狀囊括了生長、繁殖、抗病、肉質、人源化器官、新型藥物等，轉基因動物所表現出的優(yōu)異表型，展示了其巨大的發(fā)展?jié)摿皬V闊的應用前景。但其作為一門新興技術也給我們帶來了巨大的挑戰(zhàn)，轉基因動物也存在諸多問題，如畸形、生長遲緩、不育、抗病力差等[2]。所以這些轉基因產品如果為人所用，必須通過國家相應的安全評定[3]。1轉基因技術1.1轉基因技術的原理轉基因技術是指將人為選擇的優(yōu)質外源基因，通過剪切、修飾轉移到受體細胞中，而達到人為地改變受體生物性狀的目的。轉基因技術的理論基礎在于各種生物的遺傳密碼都是統(tǒng)一的。都是以3個堿基決定一個氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時各種生物從DNA到蛋白質合成都服從“中心法則”，當一個物種的細胞內加入另一物種或人工合成的DNA（即基因）后就可能產生新的性狀。

1.2轉基因的技術手段轉基因技術涉及外源基因的獲得，DNA的重新組建、重組基因的導入、及轉基因受體胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)等方面的研究內容。通過基因組編輯技術（ZFN、TALEN與CRISPR/Cas9）可實現人為可控地在確定的DNA序列上制造雙鏈斷裂，并定向轉入基因。而將基因導入受體中并使其發(fā)揮作用主要的技術包括顯微原核注射法[4]，逆轉錄病毒感染法[5]，胚胎干細胞介導法[6]，體細胞核移植技術[7]，精子載體法[8]，胞漿內單精子注射法[9]，卵母細胞載體法[10]等。近年來，研究者們?yōu)榱颂岣咿D基因效率并將目的片段準確的整合到特定的基因位點，做了大量的研究工作。2轉基因轉基因研究的歷史及發(fā)展1966年小鼠卵母細胞顯微注射開始興起；1968年美國科學家Cohen等在研究細菌的時，慢慢發(fā)展起來了“重組DNA技術”；1969年科學家成功分離出第一個基因；隨著基因工程等分子生物學技術的發(fā)展，1974年Jaenisch和Mintz將猿猴空泡病毒（SV40)的DNA注入小鼠胚泡，發(fā)現40％子代鼠的器官中整合有外源基因，并且它們長至1歲仍沒有發(fā)現腫瘤跡象，創(chuàng)造了首只轉基因小鼠，開啟了科學技術的新大門；1980年Gordon等科學家育成帶有人胸苷激酶(ThymidineKinase，TK)基因的轉基因小鼠;1982年美國科學家Palmiter等人采用顯微注射法將大鼠的生長激素基因導入小鼠受精卵的雄原核中獲得了生長速率快2-4倍，體型大一倍的轉基因“超級小鼠”，轉基因動物技術轟動了整個生命科學界。此后，轉基因迅速發(fā)展并逐步改進，廣泛應用于生物界，轉基因技術應用于動物并取得了眾多的矚目成果。1985年獲得了轉基因家畜；1987年成功利用轉基因技術構建了動物生物反應器；1992年獲得了首只抗病轉基因豬；1997年，Wilmut等通過體細胞核移植技術率先制作出世界上第一頭轉基因克隆羊“多莉”，這是人類首次對哺乳動物體細胞核進行移植，同時也改善了轉基因效率低等問題，該實驗也直接證明了轉基因技術可以在更接近人的高等動物中實現，從而使該技術更好地為人類服務[11]。2000年科學家們利用基因編輯技術獲得了基因敲除家畜；2001年獲得了首只靈長類轉基因動物，該成果的突破有利于構建更接近人的疾病模型。2006年世界首個利用轉基因動物乳腺生物反應器生產的基因工程蛋白藥物—重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名:ATryn）獲得歐洲醫(yī)藥評價署人用醫(yī)藥產品委員會的上市許可，標志著通過轉基因動物進行藥物生產進入產業(yè)化階段。2015年世界上首例導入外源基因使生長速度變快的轉基因三文魚（商品名:AquAdvanage三文魚）獲得美國食品和藥品管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批準進入市場銷售，是轉基因動物經層層檢測最終認定其安全性并可供人類食用邁出的關鍵一步。轉基因技術發(fā)展的30余年，培育出的轉基因動物不計其數?？茖W家們通過體細胞克隆等技術培育了轉基因等魚、兔子、豬、牛、羊等20多種轉基因動物。其中轉基因動物的研究在疾病模型的建立、作為器官移植的供體、動物生物反應器的構建、新品種的培育、以及通過轉基因和基因編輯等技術提高動物生產性能、增強動物抗病能力等研究領域都有著深遠的意義。3轉基因技術的主要應用及突破性進展3.1轉基因在動物育種領域的應用目前的轉基因動物培育工作主要改針對善動物自身生存能力如提高其對環(huán)境適應能力、以及增加其抗病及抗寄生蟲能力等、此外也致力于提高轉基因動物生長速度、提高動物源性產品的品質和產量、減少動物排泄物對環(huán)境污染等工程。3.1.1動物產品產量、品質等性狀改良我國作為人口大國，食品資源的產量及品質是大家一直關注的話題，提高動物產品的品質及產量也一直是科學研究的重點課題。從人們認識到雜種優(yōu)勢現象后，雜交育種作為品種改良的重要手段長期以來一直被普遍采用，但由于兩親本間的基因交換和轉移重組是隨機發(fā)生的，在親本優(yōu)良基因轉移的同時，也伴隨其他非優(yōu)良基因的轉移，器件還會發(fā)生大量不定向的變異和非預期的性狀重組，優(yōu)良品種的選擇不僅耗費大量的人力和物力，其育種周期也很長，很難達到預期的結果。轉基因技術自開發(fā)以來在改善動物各類經濟性狀，如生長速度加快、瘦肉率提高，肉質品質提高，飼料利用率提高和抗病力增強等方面不斷取得新進展[12]。利用基因敲除、轉入功能基因或性狀基因等，可培育出產肉量增加、肉品質、產毛率及毛品質改善的家畜新品種。豬肉作為我國主要的肉類食品來源，提高豬的產肉量和瘦肉率是豬育種工作的重要目標。2015年，Qian等利用ZFN技術成功獲得MSTN突變的基因編輯梅山豬，目前已經繁育第5代，雙等位突變基因編輯豬育種群瘦肉率顯著提高[13]。Myostatin(MSTN)基因是目前為止發(fā)現唯一對肌肉生長起負調控作用，可控制豬個體生長發(fā)育和脂肪沉積，從而改善豬產肉性能。此后，科學家們通過各種技術手段獲得MSTN基因編輯豬，有些獲準開展轉基因生物安全評價的中間試驗。對于該基因的編輯也對牛等經濟動物實施操作，并已得到預期的結果。2018年，Xiang等利用CRISPR/Cas9技術成功獲得了IGF2基因第3個內含子一個保守的SNP位點編輯的巴馬豬。與野生型巴馬豬相比，IGF2基因編輯豬顯著提高了產肉量和瘦肉率[14]。2003年，研究人員在奶牛的胚胎細胞中轉入了兩種額外的基因：β-酪蛋白和K-酪蛋白，由此培育的轉基因奶牛所產的奶中β-酪蛋白含量提高了20%，K-酪蛋白的含量也增加了一倍。該基因牛已完成安全性評價，正在推進產業(yè)化[15]。不飽和脂肪酸包括ω-3和ω-6，其中ω-3在改善心血管病癥中扮演著重要角色，但由于作為人們使用的動物豬牛等牲畜體內缺乏將ω-6脂肪酸轉化成ω-3脂肪酸的酶[16-17]，導致肉質中ω-3含量較低，不能滿足人類健康飲食的需求。2006年，Lai等在豬中過表達秀麗線蟲Fat-1基因，使豬肉中ω-6脂肪酸轉變?yōu)棣?3脂肪酸，成功培育出了富含ω-3脂肪酸的轉基因豬，在肌肉和脂肪中不飽和脂肪酸含量大幅提高，從而大大提高了豬肉的營養(yǎng)健康價值[18]。最值得一提的是由AquaBountyTechnologoes公司所培育的轉基因三文魚（AquAdvantage），該魚主要是應用原核注射的技術，巧妙的將奇努克三文魚的生長激素基因、大洋鱈魚的抗凍蛋白基因注射到大西洋三文魚的受精卵中，從而獲得的性狀優(yōu)良的新品種[19-20]。野生大西洋三文魚的生長發(fā)育對水溫要求高，適應環(huán)境能力差，生長時間長．研究人員將奇努克三文魚的生長激素基因以及大洋鱈魚的抗凍蛋白基因轉入野生三文魚制備了AquAdvantage三文魚，使其適應環(huán)境能力更強，生長速度更快，體型更大，且可全年生長，上市時間大大縮短[21-22]。2015年11月16日，美國FDA發(fā)布公告確定水優(yōu)三文魚與非轉基因三文魚一樣安全可以商業(yè)銷售和食用，該轉基因三文魚在美國已經獲得權威機構的最終批準，首個獲批供食用的轉基因動物產品被端上人類的餐桌，這是世界轉基因動物育種研究與產業(yè)化應用的歷史性突破和里程碑事件[23]。世界上第一批轉基因魚是由我國科學家朱作言率先培育的，這些轉基因魚導入了人生長激素基因后生長速度增快，餌料轉化效率提高，體重均顯著提升，從而降低了成本，縮短了飼養(yǎng)時間，具有極其重要的經濟價值。經過后續(xù)發(fā)展，科學家對于轉基因魚研究使用的過表達生長激素基因的載體經歷了從使用哺乳動物載體到應用魚類生長激素基因及調控元件的載體這樣一個過程，從而減弱了對環(huán)境及生物安全的影響。我國科學家已成功獲得多種“全魚”（即轉生長激素基因的構成元件均來自于魚類．）轉基因魚，如泥鰍、鯉魚、鲇魚、青鳉魚等。這些轉基因魚具有很大的發(fā)展空間，將會創(chuàng)造巨大的經濟價值。3.1.2動物轉基因抗病育種牲畜及禽類等經濟動物傳染病的爆發(fā)不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失，而且人畜共患病也嚴重威脅人類的安全。禽流感、布病、瘋牛病和SARS等動物源性人畜共患病的多次、重復性爆發(fā)，引起了全球恐慌?？股氐拇罅渴褂茫瑢е驴股氐臍埩艏碍h(huán)境的污染，許多傳染病疫苗的嚴重匱乏，以及所制備的疫苗頻繁失效，科研人員逐漸意識到，單純依靠疫苗和藥物治療已經無法徹底防控各種傳染病利用轉基因技術開發(fā)強抗病力新品種成為抗病育種的全新手段與方法。近年來，科研人員在動物轉基因抗病育種領域做了大量的研究工作，利用轉基因和基因編輯技術，已在各種牲畜及禽類抗病育種中獲得了突破性的進展。豬作為重要的農業(yè)經濟動物是人類肉類產品的主要來源，豬傳染病的爆發(fā)給人類社會造成了巨大的損失。其中豬的幾種常見疾病已有重大突破，有些轉基因豬已進入生產性試驗。藍耳病全稱豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS），是一種由PRRS病毒引起的繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的傳染病，我國將其列為二類\t"/item/%E7%8C%AA%E8%93%9D%E8%80%B3%E7%97%85/_blank"傳染病，該病接觸傳染性很高，且具有持續(xù)性感染的特征，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的病毒性疫病之一。研究表明，清道夫受體超家族成員CD163被認為是豬肺泡巨噬細胞（PAMs）被PRRSV感染和內化最重要的受體[24-25]。從2013年起，Prather團隊針對PRRSV的受體構建了多種基因敲除豬[26-28]，發(fā)現CD163第7外顯子結構域5可作為病毒結合位點，該雙等位基因敲除豬攻毒后未表現出臨床癥狀，具有良好的抗藍耳病能力。此后，抗豬藍耳病基因編輯豬育種經多家科研機構以及科研院所研究并逐漸發(fā)展成熟，現已成功獲得了抗豬藍耳病豬群體[29-32]。CD163基因編輯豬與野生型對照相比，在感染PRRSV后不表現高熱、呼吸障礙癥狀等臨床癥狀，血清指標及抗體指標均保持正常水平?？谔阋呤怯煽谔阋卟《?Footandmouthdiseasevirus，FMDV)引起的一種偶蹄動物急性、高度傳播性疾病。2015年Hu等人成功制備了針對豬整合素β6亞基FMDV受體的轉干擾RNA的轉基因豬，該轉基因豬有效表達了針對豬整合素β6亞基的siRNA，豬整合素β6的RNAi可抑制病毒在豬成纖維細胞中的繁殖，且該轉基因豬不表現出感染病毒后的臨床癥狀和病理特征[33]；隨后Xie等科學家利用同樣的方法，成功獲得定點整合轉shRNA的抗豬瘟轉基因豬，該豬可有效抵抗豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CFSV)的感染[34]。此外，Yan等人通過超表達抗黏液病毒基因(Myxovirusresistancegene，Mx1)也成功制備有效抑制CFSV繁殖的轉Mx1基因豬[35]。非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，阻礙了全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。尤其近些年由于非洲豬瘟的爆發(fā)已嚴重影響豬養(yǎng)殖業(yè)的經濟狀況。2018年8月3日，首例非洲豬瘟疫情在中國遼寧省沈陽市確診，隨后迅速蔓延至全國，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失。盡管研究人員在免疫佐劑、DNA疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗等方面做了大量的研究工作，但臨床結果表明這些疫苗均不能發(fā)揮良好的作用[36]。2016年，Lillico等科學家研究發(fā)現，非洲疣豬可攜帶非洲豬瘟病毒卻不發(fā)病，而家豬在感染非洲豬瘟病毒后，死亡率高達100%。通過基因組測序分析，家豬和非洲疣豬在RELA基因上存在3個SNP位點的遺傳差異，這可能是家豬易感ASFV的一個重要原因。隨后該團隊利用ZFN技術成功制備將家豬RELA基因的3個SNP精確替換為非洲疣豬的SNP的基因編輯豬，但其抗病效率還需要進一步確認。對于畜牧業(yè)同樣重要的牛也有許多傳染病阻礙著產業(yè)的發(fā)展。乳腺炎是一種由病原體通過乳頭管進入乳腺腔引起的乳腺疾病。對于通過產奶獲得經濟效益的奶牛，乳腺感染會造成巨大的經濟損失。2005年，DonovanDM等人創(chuàng)造了可在乳腺上皮中表達溶菌酶并將抗菌肽分泌到牛奶中的轉基因奶牛，使奶牛產的乳汁以劑量依賴的方式殺死細菌，在一定程度上保護牛免受乳腺炎侵害[37]。瘋牛病(MadCowDisease)，又稱為牛海綿狀腦病(BovineSpongiformEncephali-tis，BSE)，是動物傳染性海綿樣腦病(TransmissibleSpongiformEncephalitis，TSE)中的一種，為嚴重的人畜共患病，它是由朊病毒引起的一種亞急性進行性神經系統(tǒng)疾病，其癥狀以神經錯亂為主并伴隨全身癥狀，以潛伏期長、死亡率高、傳染性強為特征。2007年，Richt等利用基因打靶技術獲得了瘋牛病相關基因（PRNP）雙位點敲除的轉基因牛，牛的臨床、生理、組織病理、免疫和繁殖正常，且其腦組織勻漿對朊病毒的體外繁殖有抵抗力[38]。此外在羊，雞等常見畜牧業(yè)動物中抗病育種的研究也取得了較大的成果。2011年中國農業(yè)大學獲得過表達TLR4基因的轉基因綿羊，該轉基因羊在病毒攻擊后，表現出強烈的急性炎癥反應，從而加大了對病原體的清除能力；英國羅斯林研究所獲得了表達抗IBV的小RNA轉基因雞，對轉基因雞免疫細胞體外進行IBV攻毒后，IBV病毒的復制明顯減弱，急性期的炎癥因子明顯降低，表現出了良好的抗病毒復制特征。我國是世界上畜禽養(yǎng)殖數量最多的國家，高密度、集約化飼養(yǎng)為病原體快速傳播與突變提供了合適條件，各種傳染病的爆發(fā)對我國經濟，社會等方面都造成巨大影響，因此抗病育種研究十分重要。3.2轉基因在醫(yī)學領域的應用3.2.1生物反應器應用轉基因動物乳腺生物反應器生產轉基因藥物是一種全新的生物藥物生產模式具有成本低，效益高和產量高等優(yōu)點。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展和人們對重組蛋白藥物的接受逐漸提高，利用動物作為生物反應器生產醫(yī)用蛋白的研發(fā)工作已在各領域取得進展。從1987年Gordon等人在轉基因小鼠乳汁中得到人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子，到現在已有數十種人體蛋白在家畜乳腺中表達，這些蛋白可以用于治療人類相關疾病，其中組織溶酶原激活因子（tPA）、a1胰蛋白酶（a1-AT）及抗凝血酶Ⅲ、人血紅蛋白（Hb）、人乳鐵蛋白（LF）等已進入臨床試驗階段，其中血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶等表達已經達到商業(yè)化水平。目前，國際上主要的動物生物反應器包括山羊、奶牛、豬、兔、小鼠、家蠶等，主要利用血液系統(tǒng)、動物膀胱、禽類的卵及哺乳動物乳腺等生產目標產物[39]。1990年12月，荷蘭Pharming公司用酪蛋白啟動子與人乳鐵蛋白(hLF)的cDNA構建了轉基因載體，并通過顯微注射法獲得了世界上第一頭轉基因公牛。該公牛與非轉基因母牛生產的轉基因后代中1/4后代母牛乳汁中表達了人乳鐵蛋白[40]。2006年6月，美國GTC公司利用轉基因山羊乳腺生物反應器生產的世界首個利用轉基因動物乳腺生物反應器生產的基因工程蛋白藥物-重組人抗凝血酶Ⅲ（ATryn，一種可供人類使用的抗凝血藥，既能用于冠狀動脈旁路手術，又能治療燒傷、敗血病等）已在歐洲和美國上市。人血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質，在維持血液滲透壓、體液平衡和營養(yǎng)供給等方面具有重要功能，在臨床上可以治療失血、創(chuàng)作等引起的休克或水腫等病癥[41]。Peng等人，利用CRISPR/Cas9技術，首次構建豬乳腺反應器，生產人重組血清白蛋白[42]，此后Li等，利用TALEN技術成功制備在血液中高表達人血清白蛋白的轉基因豬[43]。我國在醫(yī)藥保健和疫苗制備等領域開展轉基因動物生物反應器研發(fā)，并取得了驚人的成成就，我國已經在牛、羊、豬等動物體內成功表達了許多貴重的藥用蛋白，如抗腫瘤蛋白、提高免疫力蛋白、疾病治療相關蛋白等。1983年我國成功獲得表達乙肝病毒表面抗原的轉基因兔。中國農業(yè)大學李寧院士等在2005年利用轉基因體細胞克隆技術，分別獲得了導入“人乳鐵蛋白”、“人α-乳清白蛋白”、“溶菌酶”及“巖藻糖化蛋白”的轉基因牛，這幾種蛋白是人乳中重要的營養(yǎng)保健成分，有多種抗菌和抗癌等藥用功能，這些成果為開發(fā)“人乳化”牛奶提供了航向。2008年獲得首例胚胎冷凍保存的體細胞克隆牛和首例攜帶有人胰島素基因的轉基因克隆牛。此外我國通過轉基因技術還獲得了乳腺中高表達可治療人B淋巴細胞癌等惡性腫瘤的CD20蛋白的轉基因牛以及含有轉乳糖分解酶基因的克隆牛。2009年中國農業(yè)大學獲得富含人乳鐵蛋白的轉基因牛，該轉基因牛分泌乳鐵蛋白含量達到目前國際報道的最高水平，在國際上處于領先地位[44-45]。目前，進入臨床試驗的動物生物反應器重組蛋白藥物已達100多種，全球從事動物生物反應器研發(fā)的企業(yè)有20多家，包括5家上市公司?？梢?，通過轉基因技術構建動物生物反應器具有重大的科學意義以及廣闊的發(fā)展前景。3.2.2異種器官移植器官移植供體短缺一直是人類醫(yī)學領域的一大難題，而異種器官移植可能是解決此問題的有效途徑。動物異種器官移植供體研究主要是建立基因改造的克隆豬作為異種移植的供體。以豬作為異種器官移植的供體不僅因為其在體型大小、生理條件、器官發(fā)育和疾病發(fā)展等方面與人類相似，而且豬易于繁殖，供應量大，費用低廉，產業(yè)化的前景甚為樂觀，以豬作為器官供體還可避免靈長類動物作為異種供體源的倫理問題，因此豬是人類異種器官來源的良好供體。但以異種動物豬作為器官移植的供體面臨著許多問題，如會發(fā)生超急性排斥反應(hyperacuterejection，HAR)、急性血管性排斥反應和慢性排斥反應等，并且豬內源性逆轉錄病毒(Porcineendogenousretroviruses，PERVs)對病人也具有潛在風險。因此科學家通過基因編輯轉基因等技術建立“器官巢”，并排除可能阻礙器官移植的干擾因素，為下一步利用體細胞核移植技術獲得異種器官移植供體豬奠定了基礎。隨著動物基因編輯和胚胎發(fā)育基礎理論和技術的發(fā)展，豬人源化器官再造技術為人類器官移植提供了一個新的解決思路。2010年，Kobayashi等人用大鼠ESCs囊胚嵌合彌補了Pdx1基因敲除小鼠的胰腺缺陷，獲得了長有大鼠胰腺的小鼠[46]；2013年，Matsunari等人利用豬正常裂球彌補了Pdx1基因敲除豬的胰腺缺陷[47]。從理論上講，使用人的胚胎干細胞或iPS細胞系與人源化器官缺失動物嵌合，可以獲得由人細胞組成的胰腺器官，該器官在向人移植是可以避免異種移植時免疫排斥危害。2003年，美國密蘇里大學哥倫比亞分校研究團隊培育的a-1，3-半乳糖苷酶基因（α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除豬，基本上解決了異種器官移植超急性排斥反應。2017年云南大學魏紅江課題組生產出世界首例內源性逆轉錄病毒（Porcineendogenousretroviruses，PERVs）基因敲除豬，研究團隊通過CRISPR/Cas9技術在整個基因組同時滅活了PERVs的全部62個拷貝，被編輯細胞的PERVs轉染效率降低了1000倍[48]。來自這些低免疫排斥無內源病毒的基因修飾豬的多種器官，例如肝、腎、肺和胰腺等已被嘗試移植至多種靈長類動物，并成功延長多種受體動物的存活時間。此外科研人員也通過各種轉基因及基因編輯手段提高基因編輯后供體器官在受體中正常存活并發(fā)揮功能的能力。3.2.3人類疾病模型及藥物篩選模型的構建目前，很多研究表明絕大多數疾病與基因遺傳均有一定程度的相關性，通過以轉基因可以精確地失活或增強某些基因的表達，以轉基因動物作為疾病模型研究遺傳與疾病的關系，比其他方法有優(yōu)勢，它可以在動物原來遺傳背景的基礎上，通過改變某種基因的表達水平而用以研究外源基因在整體動物中的表達調控規(guī)律，對于開展病理研究與新藥篩選，闡明遺傳改變所產生的效應，確定致病基因的功能和致病機理，從而預防與治療疾病有重要意義，且具有篩選準確、經濟、試驗次數少等優(yōu)勢[49]。目前已經建立起了各種人類遺傳病的模型，包括老年性癡呆癥、帕金森病、關節(jié)炎、肌肉營養(yǎng)缺乏癥、腫瘤發(fā)生、高血壓模型等；此外還有許多藥物篩選模型。豬的生理學、解剖學和遺傳學特征與人類非常接近，是一種研究人類疾病的最佳動物模型。2011年，Yang等利用ZFN技術和體細胞核移植技術，成功構建出PPARγ基因敲除豬，研究發(fā)現該豬較好地擬合了人類心血管疾病病癥，為研究PPARγ在人類心血管疾病中的作用奠定了基礎[50]。2014年，Hai等通過基因編輯高效制備了vWF雙等位敲除基因的廣西巴馬小型基因編輯豬，該豬出現嚴重的凝血功能障礙，與血管性血友病患者的臨床表現相似，這將為人類Ⅰ型和Ⅲ型血管性血友病的病理研究及治療提供重要的模型支撐[51]。針對許多神經退行性疾病，包括肌萎縮側索硬化癥(Amyotrophiclateralsclerosis，ALS)、亨廷頓舞蹈癥(Huntington’sdisease，HD)的動物疾病模型也已建立，并在病理研究及治療方面發(fā)揮了巨大作用。此外，2010年中科院昆明動物研究所成功培育出中國首例轉基因獼猴，非人靈長類動物模型的研制成功為人類重大疾病研究奠定了重要基礎。對于致癌試驗常用的模型為轉基因小鼠模型，包括Tg，rasH2模型、p53+/-敲除小鼠模型、Tg，AC模型以及XPA敲除模型等[52]，但目前使用較為廣泛的模型是Tg，rasH2模型，其次是p53+/-敲除小鼠模型。利用轉基因動物模型開展致癌試驗，較普通嚙齒類動物而言具有動物用量少、試驗周期短、費用低、特異性及敏感性高等多個方面的優(yōu)勢，且該類模型符合國際上通行的3R原則要求。4轉基因技術面臨的挑戰(zhàn)及安全性問題轉基因動物的操作成功率極低，基因整合的機制尚不清楚，轉基因在宿主基因組中的行為難以控制。轉基因在插入宿主基組的過程中可能導致內源基因的破壞或失活，也可能激活原本處于關閉狀態(tài)的基因（尤其是癌基因）。其結果將導致轉基因陽性個體出現不育、胚胎死亡、四肢畸形等異常。轉基因動物的外源基因轉入的效率低，且即使成功轉入的基因由于機體內的排異機制很有可能不久后便沉默了；當構建生物反應器時，存在轉基因效率低，外源基因表達量低以及蛋白質沒有正確折疊等問題。而建立藥物篩選模型時也常常存在假陽性等問題，此外人們最關注的是轉基因的安全性問題，轉基因動物器官移植可能會增加“人獸共患”病的傳播機會，轉基因食品帶來的非期望效應是不可預測的，如果不經過嚴格的安全審查直接進入市場，可能會帶來安全隱患如可能使食用者中毒或發(fā)生過敏反應等，有人指出因為動物的生存周期長，某些轉入基因的特征可能導致動物體內對獸藥、重金屬等外源化學物質的累積，從而增加人類患病風險。此外，轉基因動物攜帶外源基因，釋放至環(huán)境中可能通過雜交導致“基因逃逸”，使外源基因轉到其野生近緣種造成“基因污染”，危及生物多樣性安全。5展望技術的發(fā)明和成果的創(chuàng)新都推進人類及社會的發(fā)展，然而任何一種新技術都會存在潛在的風險性。控制得當會給生活帶了便利，相反，則有可能會帶來災難性后果。面對轉基因動物技術，既要保障生物技術的健康發(fā)展，又要制定嚴格的轉基因動物食用安全評價體系，全面的評估轉基因技術帶來的風險。從而公正科學地引導大眾了解轉基因生物及其產品安全性，并可更好的推進轉基因動物產業(yè)的發(fā)展。首個被美國FDA獲批供食用的轉基因動物(水優(yōu)三文魚）產品被端上人類的餐桌，這是世界轉基因動物育種研究與產業(yè)化應用的歷史性突破和里程碑事件，這很大程度上鼓舞了轉基因行業(yè)的發(fā)展。通過科學地使用新型技術手段并且制定嚴謹的評價體系，可讓新型技術更換好地為人類為社會服務。

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