基因治療課件最新版

危敏副教授南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所基因治療危敏副教授南方醫(yī)科大學(xué)基因治療藥物治療手術(shù)治療放射治療理療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：

基因治療(genetherapy)藥物治療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：基因治療一、概念二、策略三、基本流程四、應(yīng)用與展望基因治療一、概念一、基因治療的概念一、基因治療的概念概念的發(fā)展經(jīng)典概念：將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)的缺陷基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。廣義概念：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)有效表達(dá)，最終達(dá)到治療疾病目的的方法，均稱之為基因治療。概念的發(fā)展經(jīng)典概念：將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)的二、基因治療的策略

(一)直接策略：針對致病基因(二)

間接策略：導(dǎo)入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因二、基因治療的策略(一)直接策略：(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因置換（genereplacement）基因增補(bǔ)（geneaugmentation）又稱為補(bǔ)償性基因治療4.

基因干預(yù)（geneinterference）又稱為反義基因治療(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因矯正（genecorrection）指將致病基因的突變堿基加以糾正，而保留正常部分。基因置換（genereplacement）指通過同源重組（基因打靶）技術(shù)，將正常基因定點整合到靶細(xì)胞基因組內(nèi)，以原位替換致病基因。不涉及基因組整體改變的情況下對缺陷基因進(jìn)行精確的原位修復(fù)，是最理想的治療方式?；虺C正（genecorrection）基因打靶技術(shù)

指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后，通過目的基因與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的交換，將目的基因定點整合到靶細(xì)胞基因組上某一確定位點的技術(shù)?；虼虬屑夹g(shù)指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后，通過目的基因與3.

基因增補(bǔ)（geneaugmentation）

成熟的策略

是指不去除異?；颍瑢⒂泄δ艿恼；?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞后發(fā)生非定點整合，表達(dá)正常產(chǎn)物以補(bǔ)償缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加強(qiáng)。3.基因增補(bǔ)（geneaugmentation）4.基因干預(yù)（geneinterference）是采用特定的方法，導(dǎo)入外源基因選擇性地阻斷、干擾、抑制和封閉有害基因在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)及其生物合成。導(dǎo)入抑癌基因反義核酸技術(shù)

(antisensetechnology)：

①反義RNA；②反基因技術(shù)；③核酶RNA干擾（RNAinterference)4.基因干預(yù)（geneinterference）抑癌基因療法抑癌基因：是正常細(xì)胞內(nèi)正常存在的，能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的一類基因群。

Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因p53基因治療研究：

（1）野生型p53基因的替代療法（2）突變型p53基因的阻斷療法（3）與p53基因有關(guān)的新型腫瘤疫苗抑癌基因療法抑癌基因：是正常細(xì)胞內(nèi)正常存在的，能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA互補(bǔ)的RNA，抑制mRNA的加工與翻譯。核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其與相應(yīng)mRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性，將mRNA降解。反義脫氧寡核苷酸，ODN反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA反義RNA技術(shù)體外合成反義RNA，直接導(dǎo)入；將特異的反義基因通過特定的表達(dá)載體（質(zhì)粒、病毒）導(dǎo)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA發(fā)揮作用，避免了在給藥途徑中易被RNase降解的缺點。反義RNA技術(shù)體外合成反義RNA，直接導(dǎo)入；關(guān)鍵性問題1.專一性轉(zhuǎn)移如何專一的作用于病變細(xì)胞，而不影響其他正常細(xì)胞。2.反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題解決：特定受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移關(guān)鍵性問題1.專一性轉(zhuǎn)移受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移

脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，通過化學(xué)物質(zhì)作為中間連接物，將ASGP與多聚賴氨酸（PL）共價結(jié)合，得到ASGP-PL復(fù)合物，這種復(fù)合物可以攜帶RNA，再專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識別，并被吞噬到肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介反義RNA應(yīng)用前景1.

安全性高

不改變基因結(jié)構(gòu)，最終在細(xì)胞內(nèi)被降解。2.

設(shè)計和制備方便

體外轉(zhuǎn)錄獲得。3.

具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)4.

能直接作用于一些RNA病毒反義RNA應(yīng)用前景1.安全性高反基因技術(shù)脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,

ODN），也被稱為TFO

(triplehelix-formingoligo)通過TFO在DNA結(jié)合蛋白的識別位點處，與靶基因結(jié)合形成三螺旋，從而位點專一性地干擾DNA與反式作用因子的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄延伸，達(dá)到“反基因”的目的。DNA水平阻止基因轉(zhuǎn)錄肽核酸（peptidenucleicacids，PNA，一種以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA類似物）反基因技術(shù)脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucl基因治療課件最新版核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognitionsequences“hammerhead”ribozymes核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognition1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性剪切RNA活性的RNA分子。1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性核酶具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合并切割其他的mRNA，效率高于反義RNA。核酶的特點

核酶具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。核酶的特點RNA干擾技術(shù)概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使同源mRNA發(fā)生特異性的降解，從而阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。高度的序列專一性高效性易操作性RNA干擾技術(shù)概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞miRNAMicroRNA（miRNA）是內(nèi)源性的，是一種非編碼的RNA；由miRNA基因表達(dá)出最初的pri-miRNA分子。靶標(biāo)mRNA通常發(fā)生不完全結(jié)合，并且結(jié)合的位點是mRNA的非編碼區(qū)的3’端；它不會降解靶標(biāo)mRNA，而只是阻止mRNA的翻譯。miRNA能夠調(diào)節(jié)與生長發(fā)育有關(guān)的基因。在生物體中的表達(dá)具有時序性、保守性和組織特異性miRNAMicroRNA（miRNA）是內(nèi)源性的，是一種非(二)間接策略

導(dǎo)入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基因治療分子化療特異性細(xì)胞殺傷(二)間接策略

導(dǎo)入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基1.免疫基因治療(1)細(xì)胞因子基因治療

IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、

INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增強(qiáng)基因療法

MHCI類抗原、共刺激分子(3)腫瘤DNA疫苗療法癌胚抗原（CEA）制備的腫瘤DNA疫苗1.免疫基因治療(1)細(xì)胞因子基因治療TumourNecrosisFactorTumourNecrosisFactor2.分子化療(1)

自殺基因療法：TK基因、CD基因(2)化療保護(hù)性基因治療：MDR基因(3)

藥物增敏基因治療：鈣調(diào)素基因

2.分子化療(1)自殺基因療法：TK基因、CD基因

(1)自殺基因療法

自殺基因（suicidegene)，前體藥物酶轉(zhuǎn)化基因該基因表達(dá)產(chǎn)生的酶可催化無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，從而殺死腫瘤細(xì)胞；同時通過“旁觀者效應(yīng)”（bystandereffect）殺死鄰近未導(dǎo)入該基因的分裂細(xì)胞而顯著擴(kuò)大殺傷效應(yīng)。由于攜帶該基因的受體細(xì)胞本身也被殺死，所以這類基因被稱為“自殺基因”。(1)自殺基因療法自殺基因（suicidegene自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因編碼胸苷激酶（TK）催化丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）成為磷酸化的核苷酸類似物，阻斷DNA的合成而使細(xì)胞死亡。大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（CD）基因?qū)?’-氟胞嘧啶（5’-FC）轉(zhuǎn)化為5’-氟尿嘧啶（5’-FU）而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因viralvector（HSV）tumourcellthymidinekinasegeneganciclovir

phosphateGanciclovir（GCV）tkviralvectortumourcellthyGanciclovirphosphateinhibitsDNApolymeraseCelldeath–IncludingbystandercellsGanciclovirphosphateCelldeat(2)化療保護(hù)性基因治療指將編碼抗細(xì)胞毒性藥物蛋白的基因?qū)肴梭w細(xì)胞，以提高機(jī)體耐受腫瘤化療藥物的能力。如將多藥抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1導(dǎo)入骨髓造血干細(xì)胞，減少骨髓受抑制的程度，以加大化療劑量，提高化療效果。(2)化療保護(hù)性基因治療指將編碼抗細(xì)胞毒性藥物蛋白的基

(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細(xì)胞后，改變腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。如將鈣調(diào)素基因轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要物質(zhì)，明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的吸收量而相應(yīng)減少了排出量，使癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性明顯提高。(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細(xì)胞后，改變腫瘤3.特異性細(xì)胞殺傷指利用重組DNA技術(shù)將生物來源的細(xì)胞毒素基因與一些特異受體的配體基因融合，構(gòu)建融合基因，導(dǎo)入高度表達(dá)該受體的腫瘤細(xì)胞，以特異性殺傷該腫瘤細(xì)胞。3.特異性細(xì)胞殺傷指利用重組DNA技術(shù)將生物來源的細(xì)胞毒素基特異性細(xì)胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因與TGFα基因組成融合基因TGFα-PE，或TGFα-DT。由于TGFα與表皮生長因子EGF結(jié)構(gòu)類似，也能與表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)合；故該融合基因可特異性進(jìn)入并殺死高度表達(dá)EGFR的膀胱癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞。特異性細(xì)胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備（二）載體的選擇與構(gòu)建（三）靶細(xì)胞的選擇（四）基因轉(zhuǎn)移（五）基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定（六）回輸體內(nèi)

三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備基因治療的方式根據(jù)基因?qū)氲姆绞椒譃閮煞N：1.直接體內(nèi)療法（invivo）是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。2.間接體內(nèi)療法（exvivo）是指在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。

基因治療的方式根據(jù)基因?qū)氲姆绞椒譃閮煞N：基因治療課件最新版基因治療的種類生殖細(xì)胞基因治療可遺傳性倫理學(xué)問題

禁止應(yīng)用人體體細(xì)胞基因治療：研究重點基因治療的種類生殖細(xì)胞基因治療體細(xì)胞治療的概念指應(yīng)用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體細(xì)胞；經(jīng)體外操作后。回輸（或植入）人體的治療方法。體細(xì)胞治療的概念指應(yīng)用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體（一）外源基因的選擇與制備

外源基因目的基因：與致病基因相對應(yīng)的有功能的正?；蚺c致病基因無關(guān)、有治療作用的基因標(biāo)記基因:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Neo）基因外源基因的獲得

基因克隆人工合成PCR擴(kuò)增（一）外源基因的選擇與制備外源基因外源基因的選擇原則體內(nèi)少量表達(dá)就可顯著改善癥狀；過高表達(dá)不會對機(jī)體造成危害；在抗病毒和病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史中起重要的作用，并且該序列是特異的；腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉(zhuǎn)入人體；可采用反義技術(shù)封閉細(xì)胞內(nèi)活化的癌基因或向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生長，所針對的癌基因或抑癌基因應(yīng)與該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有明確的相關(guān)性。外源基因的選擇原則體內(nèi)少量表達(dá)就可顯著改善癥狀；（二）載體的選擇與構(gòu)建

病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV)腺病毒（AV)腺相關(guān)病毒（AAV)單純皰疹病毒（HSV)痘苗病毒（VV)非病毒載體：

脂質(zhì)體法直接注射法受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移DNA-磷酸鈣共沉淀電穿孔（二）載體的選擇與構(gòu)建病毒載體：非病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)3’LTR5’LTRgagpolenv結(jié)構(gòu)基因gag(groupantigen)

：編碼核心蛋白和屬特異性抗原pol(polymerase)

：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶env

(envelop)

：編碼病毒外殼蛋白和包膜蛋白LTR（longterminalrepeat）序列含增強(qiáng)子、啟動子、轉(zhuǎn)錄所需起始和終止信號逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)3’LTR5’LTRgag逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史逆轉(zhuǎn)錄病毒宿主細(xì)胞病毒RNAcDNA前病毒病毒RNA包裝蛋白包裝成完整的病毒顆粒出芽分泌子代病毒感染其他細(xì)胞整合逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史逆轉(zhuǎn)錄病毒宿主細(xì)胞病毒RNAcDNA前病病毒載體構(gòu)建（1）去除病毒致病性結(jié)構(gòu)的基因序列如逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag、pol、env基因，從結(jié)構(gòu)上保證病毒的安全性。同時產(chǎn)生的空白區(qū)以目的基因取而代之；（2）保留其基因的調(diào)控序列及包裝序列等；（3）插入標(biāo)記基因如Neo基因以對基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗性篩選等。病毒載體構(gòu)建（1）去除病毒致病性結(jié)構(gòu)的基因序列如逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞指將缺失了包裝信號及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助病毒）導(dǎo)入哺乳細(xì)胞內(nèi)而制備成的一種特殊的細(xì)胞系.這種細(xì)胞因攜帶有完整的病毒結(jié)構(gòu)基因序列能夠大量產(chǎn)生病毒包裝蛋白，而輔助病毒自身缺乏包裝信號（ψ序列）而不能包裝,不產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒顆粒。包裝細(xì)胞指將缺失了包裝信號及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助假病毒顆粒當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄出標(biāo)記基因和目的基因的RNA，含有兩端的LTR和包裝信號，被包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒蛋白包裝成病毒顆粒。因包裝的RNA中不含病毒蛋白的編碼序列，導(dǎo)致這種病毒只有一次感染能力，即在感染細(xì)胞后，不能產(chǎn)生新的病毒顆粒，稱為假病毒顆粒。假病毒顆粒釋放到包裝細(xì)胞的培養(yǎng)液中，用于感染靶細(xì)胞，從而將其攜帶的治療基因送入靶細(xì)胞。假病毒顆粒當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄出標(biāo)記基因和VectorDNAHelperDNAEngineeringaVirusintoaVectorwildtypevirusViralvectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeuticgeneessentialviral

genesPackagingcellVectorDNAHelperDNAEngineerinYvectorVectoruncoatingTherapeuticmRNAandproteinEpisomalvectorIntegratedexpressionTargetcellGeneTransferBasedonKayetal2001YvectorVectoruncoatingTherape逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結(jié)合細(xì)胞膜上的特異性受體，基因轉(zhuǎn)移效率更高；2.

結(jié)構(gòu)基因gag、env、pol的缺失不影響其他部分的活性；3.

整合到靶細(xì)胞基因組，可長期表達(dá)；4.

包裝好的假病毒顆粒分泌至包裝細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，易于分離制備。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結(jié)合細(xì)胞膜上的特問題1.只能感染分裂期細(xì)胞,靶細(xì)胞DNA合成很活躍，因為病毒感染和整合作用均依賴靶細(xì)胞DNA的復(fù)制；2.

安全性問題隨機(jī)整合：誘發(fā)插入突變，激活癌基因缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒通過重組獲得復(fù)制能力問題1.只能感染分裂期細(xì)胞,靶細(xì)胞DNA合成很活躍，因為病腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb2.通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，基因?qū)胄矢摺?.不整合宿主基因組，安全。4.宿主細(xì)胞范圍廣泛。5.可口服、噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注。6.載體容量大。7.體外容易培養(yǎng)制備，病毒滴度較高。腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb基因治療課件最新版常用的病毒載體及其基因轉(zhuǎn)移的特點

逆轉(zhuǎn)錄病毒腺病毒腺相關(guān)病毒單純皰疹病毒

基因組正鏈RNA線性dsDNA線性ssDNAdsDNA8～11kb36kb4.7kb152kb外源基因容量

<7kb7.5kb<3.5kb30kb重組病毒滴度中高較低高靶細(xì)胞狀態(tài)分裂細(xì)胞，表面分裂細(xì)胞或分裂細(xì)胞或分裂細(xì)胞或須有特殊受體非分裂細(xì)胞非分裂細(xì)胞非分裂細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率高高高高基因整合隨機(jī)整合不整合定點整合于不整合染色體19q外源基因表達(dá)狀況短暫/穩(wěn)定表達(dá)短暫表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)短暫/穩(wěn)定表達(dá)安全性及其它相對較安全可能引起炎癥無病原性可能出現(xiàn)毒性反應(yīng)宿主范圍廣和免疫反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞嗜向性常用的病毒載體及其基因轉(zhuǎn)移的特點(三)靶細(xì)胞的選擇

生殖細(xì)胞:禁止體細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞腫瘤細(xì)胞等(三)靶細(xì)胞的選擇生殖細(xì)胞:禁止靶細(xì)胞的選擇

可根據(jù)疾病的特點、目的基因及其轉(zhuǎn)移的方式等因素來確定。選擇的原則：

(1)便于從體內(nèi)取出和回輸；

(2)便于在體外培養(yǎng)與增殖；

(3)便于基因的高效轉(zhuǎn)移；

(4)能夠持續(xù)表達(dá)目的基因。靶細(xì)胞的選擇可根據(jù)疾病的特點、目的基因及其轉(zhuǎn)移的方式等因素(四)基因轉(zhuǎn)移病毒法：主要通過攜帶有外源基因的病毒載體感染靶細(xì)胞來實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。

非病毒法：物理方法——DNA直接注射、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊及基因槍技術(shù)等；化學(xué)方法——脂質(zhì)體融合法、磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法等。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

(四)基因轉(zhuǎn)移病毒法：脂質(zhì)體liposomes脂質(zhì)體liposomes其基本原理是利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起溫育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)勢：使用方便、成本低廉。缺陷：轉(zhuǎn)染效率較低和轉(zhuǎn)染基因表達(dá)時間短暫。基因治療課件最新版(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定外源基因表達(dá)的鑒定：采用Northern印跡雜交：檢測mRNA的表達(dá)測定其表達(dá)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)的含量等方法。

動物實驗(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定外源基因表達(dá)的鑒定：(六)回輸體內(nèi)方式：靜脈注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修飾的淋巴細(xì)胞以靜脈注射的方式回輸?shù)窖褐校粚⑵つw成纖維細(xì)胞以細(xì)胞膠原懸液注射至患者皮下組織；采用自體骨髓移植的方法輸入造血細(xì)胞；或以導(dǎo)管技術(shù)將血管內(nèi)皮細(xì)胞定位輸入血管等。(六)回輸體內(nèi)方式：第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所四、基因治療的應(yīng)用與展望第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所四、基因治療的應(yīng)用基因治療的應(yīng)用遺傳病替補(bǔ)法，導(dǎo)入正常基因病毒性疾病阻斷病毒基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯腫瘤基因的補(bǔ)充和修復(fù)，免疫療法，細(xì)胞毒基因療法基因治療的應(yīng)用遺傳病遺傳病的基因治療1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2）隱性遺傳的單基因遺傳?。?）該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4)該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮生理作用；5）該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果。遺傳病的基因治療1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；遺傳病基因治療的臨床研究1.腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥2.家族性高膽固醇血癥（FH）3.囊性纖維變性（CF）4.粘多糖沉積癥5.血友病B（凝血因子IX缺乏）遺傳病基因治療的臨床研究1.腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥“先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征”(SCID)“先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征”(SCID)AshantiDeSilvawasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapyin1990.ShereceivedinfusionsofTcellsthathadbeentransducedwithageneforADA(anenzymethatshelacks)AshantiDeSilvawasthefirstADA缺陷病的分子機(jī)制腺苷脫氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A）和脫氧腺嘌呤核苷（dA）脫氨，生成次黃嘌呤核苷和脫氧次黃嘌呤核苷。ADA缺陷→脫氧腺嘌呤核苷酸代謝受阻→dATP↑

→抑制核糖核苷還原酶活性→阻止DNA復(fù)制和修復(fù)→導(dǎo)致細(xì)胞死亡，對淋巴細(xì)胞毒性最強(qiáng)。ADA缺陷病的分子機(jī)制腺苷脫氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A1）單個核細(xì)胞的分離：使用淋巴細(xì)胞分層液分離患兒血中單個核細(xì)胞；2）單個核細(xì)胞培養(yǎng)：以“CD3抗體+IL2”體外培養(yǎng)以刺激T細(xì)胞增殖，分化；3）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)外源基因（治療基因+標(biāo)志基因）轉(zhuǎn)染T細(xì)胞；4）將轉(zhuǎn)染細(xì)胞回輸給患兒體內(nèi)。ADA基因治療方案1）單個核細(xì)胞的分離：使用淋巴細(xì)胞分層液分離患兒血中單個核細(xì)腫瘤的基因治療策略一、抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞1.自殺基因療法（tk、CD基因）2.抑制癌基因的表達(dá)（反義RNA、核酶、細(xì)胞內(nèi)抗體）3.恢復(fù)抑癌基因的功能（p53、Rb基因）4.抗腫瘤血管形成腫瘤的基因治療策略一、抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞腫瘤的基因治療策略二、腫瘤細(xì)胞的基因“修飾”1.導(dǎo)入細(xì)胞因子基因2.導(dǎo)入MHC基因和共刺激分子基因腫瘤的基因治療策略二、腫瘤細(xì)胞的基因“修飾”三、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能1.細(xì)胞因子基因?qū)朊庖呒?xì)胞2.基因修飾的樹突狀細(xì)胞3.分泌免疫毒素的T淋巴細(xì)胞4.腫瘤DNA疫苗腫瘤的基因治療策略三、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能腫瘤的基因治療策略腫瘤基因治療臨床試驗方案黑色素瘤83前列腺癌44乳腺癌32間質(zhì)瘤3卵巢癌31頭頸部癌癥31膠質(zhì)瘤28結(jié)腸癌25肺癌26胰腺癌3腎癌21膀胱癌2成神經(jīng)細(xì)胞瘤7子宮頸癌6腫瘤基因治療臨床試驗方案黑色素瘤83前列腺癌44乳腺癌32間病毒性疾病的基因治療針對病毒:誘導(dǎo)對病毒RNA的降解抑制病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合干擾病毒基因組的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控抑制病毒基因組的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成RNA干擾技術(shù)病毒性疾病的基因治療針對病毒:中國的基因治療1991.12血友病B，凝血因子IX，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，導(dǎo)入患者自身皮膚成纖維細(xì)胞。惡性腦膠質(zhì)瘤，TK基因非小細(xì)胞肺癌，逆轉(zhuǎn)錄病毒，IL-2中國的基因治療1991.12血友病B，凝血因子IX，逆轉(zhuǎn)基因治療藥物2003年10月16日，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組人p53腺病毒注射液(Gendicine)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的新藥證書。這是世界上第一個獲得正式批準(zhǔn)的基因治療藥物?；蛑委熕幬?003年10月16日，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組人基因治療存在的問題三個關(guān)鍵問題：

構(gòu)建高效、靶向性基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)切實有效的治療基因外源基因表達(dá)的調(diào)控一個需要重視的問題：

外源基因的導(dǎo)入對機(jī)體帶來的不利影響

基因治療存在的問題三個關(guān)鍵問題：1999年“杰辛格”基因療法失敗.18歲的澤西·杰辛格患有鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(OTC)缺失癥，接受基因療法后意外死亡。1999年“杰辛格”基因療法失敗.基因治療課件最新版基因治療課件最新版基因治療課件最新版基因治療課件最新版基因治療課件最新版現(xiàn)狀及展望基因治療現(xiàn)階段僅僅是實驗性地運用于經(jīng)過其他治療無效的“絕癥”；酶及藥物性的化學(xué)療法，以及骨髓、器官移植仍然是當(dāng)前治療多種遺傳病的最有效手段；癌癥的治療仍以手術(shù)切除及化療為主。道路曲折，前途光明現(xiàn)狀及展望基因治療現(xiàn)階段僅僅是實驗性地運用于經(jīng)過其他治療無效本章小結(jié)基因治療：指將外源基因轉(zhuǎn)移至患者細(xì)胞內(nèi)并有效適度表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的?；蛑委煵呗裕?1)直接策略：基因矯正、基因置換、基因增補(bǔ)、基因干預(yù)；(2)間接策略：免疫基因治療、分子化療、特異性細(xì)胞殺傷等。本章小結(jié)基因治療：本章小結(jié)基因治療方式：直接體內(nèi)療法和間接體內(nèi)療法兩種。基本流程：外源基因的選擇與制備、表達(dá)載體的選擇與構(gòu)建、靶細(xì)胞的選擇，基因轉(zhuǎn)移，基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定，回輸體內(nèi)?；蛑委熢谶z傳性疾病、腫瘤、心血管疾病、感染性疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的治療中具有誘人的前景。本章小結(jié)基因治療方式：思考題腫瘤的基因治療包括哪些基本策略？以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行exvivo基因治療為例，試述其技術(shù)原理及基本過程。針對目前存在的問題，該怎樣看待基因治療的現(xiàn)狀及發(fā)展前景？思考題腫瘤的基因治療包括哪些基本策略？基因治療課件最新版本文檔支持任意編輯，下載使用，定會成功！本文檔支持任意編輯，下載使用，定會成功！危敏副教授南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所基因治療危敏副教授南方醫(yī)科大學(xué)基因治療藥物治療手術(shù)治療放射治療理療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：

基因治療(genetherapy)藥物治療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：基因治療一、概念二、策略三、基本流程四、應(yīng)用與展望基因治療一、概念一、基因治療的概念一、基因治療的概念概念的發(fā)展經(jīng)典概念：將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)的缺陷基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。廣義概念：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)有效表達(dá)，最終達(dá)到治療疾病目的的方法，均稱之為基因治療。概念的發(fā)展經(jīng)典概念：將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)的二、基因治療的策略

(一)直接策略：針對致病基因(二)

間接策略：導(dǎo)入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因二、基因治療的策略(一)直接策略：(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因置換（genereplacement）基因增補(bǔ)（geneaugmentation）又稱為補(bǔ)償性基因治療4.

基因干預(yù)（geneinterference）又稱為反義基因治療(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因矯正（genecorrection）指將致病基因的突變堿基加以糾正，而保留正常部分?；蛑脫Q（genereplacement）指通過同源重組（基因打靶）技術(shù)，將正?；蚨c整合到靶細(xì)胞基因組內(nèi)，以原位替換致病基因。不涉及基因組整體改變的情況下對缺陷基因進(jìn)行精確的原位修復(fù)，是最理想的治療方式?；虺C正（genecorrection）基因打靶技術(shù)

指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后，通過目的基因與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的交換，將目的基因定點整合到靶細(xì)胞基因組上某一確定位點的技術(shù)?；虼虬屑夹g(shù)指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后，通過目的基因與3.

基因增補(bǔ)（geneaugmentation）

成熟的策略

是指不去除異?；?，將有功能的正?；?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞后發(fā)生非定點整合，表達(dá)正常產(chǎn)物以補(bǔ)償缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加強(qiáng)。3.基因增補(bǔ)（geneaugmentation）4.基因干預(yù)（geneinterference）是采用特定的方法，導(dǎo)入外源基因選擇性地阻斷、干擾、抑制和封閉有害基因在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)及其生物合成。導(dǎo)入抑癌基因反義核酸技術(shù)

(antisensetechnology)：

①反義RNA；②反基因技術(shù)；③核酶RNA干擾（RNAinterference)4.基因干預(yù)（geneinterference）抑癌基因療法抑癌基因：是正常細(xì)胞內(nèi)正常存在的，能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的一類基因群。

Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因p53基因治療研究：

（1）野生型p53基因的替代療法（2）突變型p53基因的阻斷療法（3）與p53基因有關(guān)的新型腫瘤疫苗抑癌基因療法抑癌基因：是正常細(xì)胞內(nèi)正常存在的，能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA互補(bǔ)的RNA，抑制mRNA的加工與翻譯。核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其與相應(yīng)mRNA結(jié)合后能發(fā)揮酶活性，將mRNA降解。反義脫氧寡核苷酸，ODN反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA反義RNA技術(shù)體外合成反義RNA，直接導(dǎo)入；將特異的反義基因通過特定的表達(dá)載體（質(zhì)粒、病毒）導(dǎo)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出反義RNA發(fā)揮作用，避免了在給藥途徑中易被RNase降解的缺點。反義RNA技術(shù)體外合成反義RNA，直接導(dǎo)入；關(guān)鍵性問題1.專一性轉(zhuǎn)移如何專一的作用于病變細(xì)胞，而不影響其他正常細(xì)胞。2.反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題解決：特定受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移關(guān)鍵性問題1.專一性轉(zhuǎn)移受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移

脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，通過化學(xué)物質(zhì)作為中間連接物，將ASGP與多聚賴氨酸（PL）共價結(jié)合，得到ASGP-PL復(fù)合物，這種復(fù)合物可以攜帶RNA，再專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識別，并被吞噬到肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介反義RNA應(yīng)用前景1.

安全性高

不改變基因結(jié)構(gòu)，最終在細(xì)胞內(nèi)被降解。2.

設(shè)計和制備方便

體外轉(zhuǎn)錄獲得。3.

具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)4.

能直接作用于一些RNA病毒反義RNA應(yīng)用前景1.安全性高反基因技術(shù)脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,

ODN），也被稱為TFO

(triplehelix-formingoligo)通過TFO在DNA結(jié)合蛋白的識別位點處，與靶基因結(jié)合形成三螺旋，從而位點專一性地干擾DNA與反式作用因子的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄延伸，達(dá)到“反基因”的目的。DNA水平阻止基因轉(zhuǎn)錄肽核酸（peptidenucleicacids，PNA，一種以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA類似物）反基因技術(shù)脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucl基因治療課件最新版核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognitionsequences“hammerhead”ribozymes核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognition1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性剪切RNA活性的RNA分子。1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性核酶具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合并切割其他的mRNA，效率高于反義RNA。核酶的特點

核酶具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。核酶的特點RNA干擾技術(shù)概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使同源mRNA發(fā)生特異性的降解，從而阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。高度的序列專一性高效性易操作性RNA干擾技術(shù)概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞miRNAMicroRNA（miRNA）是內(nèi)源性的，是一種非編碼的RNA；由miRNA基因表達(dá)出最初的pri-miRNA分子。靶標(biāo)mRNA通常發(fā)生不完全結(jié)合，并且結(jié)合的位點是mRNA的非編碼區(qū)的3’端；它不會降解靶標(biāo)mRNA，而只是阻止mRNA的翻譯。miRNA能夠調(diào)節(jié)與生長發(fā)育有關(guān)的基因。在生物體中的表達(dá)具有時序性、保守性和組織特異性miRNAMicroRNA（miRNA）是內(nèi)源性的，是一種非(二)間接策略

導(dǎo)入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基因治療分子化療特異性細(xì)胞殺傷(二)間接策略

導(dǎo)入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基1.免疫基因治療(1)細(xì)胞因子基因治療

IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、

INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增強(qiáng)基因療法

MHCI類抗原、共刺激分子(3)腫瘤DNA疫苗療法癌胚抗原（CEA）制備的腫瘤DNA疫苗1.免疫基因治療(1)細(xì)胞因子基因治療TumourNecrosisFactorTumourNecrosisFactor2.分子化療(1)

自殺基因療法：TK基因、CD基因(2)化療保護(hù)性基因治療：MDR基因(3)

藥物增敏基因治療：鈣調(diào)素基因

2.分子化療(1)自殺基因療法：TK基因、CD基因

(1)自殺基因療法

自殺基因（suicidegene)，前體藥物酶轉(zhuǎn)化基因該基因表達(dá)產(chǎn)生的酶可催化無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，從而殺死腫瘤細(xì)胞；同時通過“旁觀者效應(yīng)”（bystandereffect）殺死鄰近未導(dǎo)入該基因的分裂細(xì)胞而顯著擴(kuò)大殺傷效應(yīng)。由于攜帶該基因的受體細(xì)胞本身也被殺死，所以這類基因被稱為“自殺基因”。(1)自殺基因療法自殺基因（suicidegene自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因編碼胸苷激酶（TK）催化丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）成為磷酸化的核苷酸類似物，阻斷DNA的合成而使細(xì)胞死亡。大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（CD）基因?qū)?’-氟胞嘧啶（5’-FC）轉(zhuǎn)化為5’-氟尿嘧啶（5’-FU）而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因viralvector（HSV）tumourcellthymidinekinasegeneganciclovir

phosphateGanciclovir（GCV）tkviralvectortumourcellthyGanciclovirphosphateinhibitsDNApolymeraseCelldeath–IncludingbystandercellsGanciclovirphosphateCelldeat(2)化療保護(hù)性基因治療指將編碼抗細(xì)胞毒性藥物蛋白的基因?qū)肴梭w細(xì)胞，以提高機(jī)體耐受腫瘤化療藥物的能力。如將多藥抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1導(dǎo)入骨髓造血干細(xì)胞，減少骨髓受抑制的程度，以加大化療劑量，提高化療效果。(2)化療保護(hù)性基因治療指將編碼抗細(xì)胞毒性藥物蛋白的基

(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細(xì)胞后，改變腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。如將鈣調(diào)素基因轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要物質(zhì)，明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的吸收量而相應(yīng)減少了排出量，使癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性明顯提高。(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細(xì)胞后，改變腫瘤3.特異性細(xì)胞殺傷指利用重組DNA技術(shù)將生物來源的細(xì)胞毒素基因與一些特異受體的配體基因融合，構(gòu)建融合基因，導(dǎo)入高度表達(dá)該受體的腫瘤細(xì)胞，以特異性殺傷該腫瘤細(xì)胞。3.特異性細(xì)胞殺傷指利用重組DNA技術(shù)將生物來源的細(xì)胞毒素基特異性細(xì)胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因與TGFα基因組成融合基因TGFα-PE，或TGFα-DT。由于TGFα與表皮生長因子EGF結(jié)構(gòu)類似，也能與表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)合；故該融合基因可特異性進(jìn)入并殺死高度表達(dá)EGFR的膀胱癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞。特異性細(xì)胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備（二）載體的選擇與構(gòu)建（三）靶細(xì)胞的選擇（四）基因轉(zhuǎn)移（五）基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定（六）回輸體內(nèi)

三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備基因治療的方式根據(jù)基因?qū)氲姆绞椒譃閮煞N：1.直接體內(nèi)療法（invivo）是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。2.間接體內(nèi)療法（exvivo）是指在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。

基因治療的方式根據(jù)基因?qū)氲姆绞椒譃閮煞N：基因治療課件最新版基因治療的種類生殖細(xì)胞基因治療可遺傳性倫理學(xué)問題

禁止應(yīng)用人體體細(xì)胞基因治療：研究重點基因治療的種類生殖細(xì)胞基因治療體細(xì)胞治療的概念指應(yīng)用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體細(xì)胞；經(jīng)體外操作后?；剌敚ɑ蛑踩耄┤梭w的治療方法。體細(xì)胞治療的概念指應(yīng)用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體（一）外源基因的選擇與制備

外源基因目的基因：與致病基因相對應(yīng)的有功能的正?；蚺c致病基因無關(guān)、有治療作用的基因標(biāo)記基因:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Neo）基因外源基因的獲得

基因克隆人工合成PCR擴(kuò)增（一）外源基因的選擇與制備外源基因外源基因的選擇原則體內(nèi)少量表達(dá)就可顯著改善癥狀；過高表達(dá)不會對機(jī)體造成危害；在抗病毒和病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史中起重要的作用，并且該序列是特異的；腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉(zhuǎn)入人體；可采用反義技術(shù)封閉細(xì)胞內(nèi)活化的癌基因或向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生長，所針對的癌基因或抑癌基因應(yīng)與該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有明確的相關(guān)性。外源基因的選擇原則體內(nèi)少量表達(dá)就可顯著改善癥狀；（二）載體的選擇與構(gòu)建

病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV)腺病毒（AV)腺相關(guān)病毒（AAV)單純皰疹病毒（HSV)痘苗病毒（VV)非病毒載體：

脂質(zhì)體法直接注射法受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移DNA-磷酸鈣共沉淀電穿孔（二）載體的選擇與構(gòu)建病毒載體：非病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)3’LTR5’LTRgagpolenv結(jié)構(gòu)基因gag(groupantigen)

：編碼核心蛋白和屬特異性抗原pol(polymerase)

：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶env

(envelop)

：編碼病毒外殼蛋白和包膜蛋白LTR（longterminalrepeat）序列含增強(qiáng)子、啟動子、轉(zhuǎn)錄所需起始和終止信號逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)3’LTR5’LTRgag逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史逆轉(zhuǎn)錄病毒宿主細(xì)胞病毒RNAcDNA前病毒病毒RNA包裝蛋白包裝成完整的病毒顆粒出芽分泌子代病毒感染其他細(xì)胞整合逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史逆轉(zhuǎn)錄病毒宿主細(xì)胞病毒RNAcDNA前病病毒載體構(gòu)建（1）去除病毒致病性結(jié)構(gòu)的基因序列如逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag、pol、env基因，從結(jié)構(gòu)上保證病毒的安全性。同時產(chǎn)生的空白區(qū)以目的基因取而代之；（2）保留其基因的調(diào)控序列及包裝序列等；（3）插入標(biāo)記基因如Neo基因以對基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗性篩選等。病毒載體構(gòu)建（1）去除病毒致病性結(jié)構(gòu)的基因序列如逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞指將缺失了包裝信號及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助病毒）導(dǎo)入哺乳細(xì)胞內(nèi)而制備成的一種特殊的細(xì)胞系.這種細(xì)胞因攜帶有完整的病毒結(jié)構(gòu)基因序列能夠大量產(chǎn)生病毒包裝蛋白，而輔助病毒自身缺乏包裝信號（ψ序列）而不能包裝,不產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒顆粒。包裝細(xì)胞指將缺失了包裝信號及相關(guān)序列的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（輔助假病毒顆粒當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄出標(biāo)記基因和目的基因的RNA，含有兩端的LTR和包裝信號，被包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒蛋白包裝成病毒顆粒。因包裝的RNA中不含病毒蛋白的編碼序列，導(dǎo)致這種病毒只有一次感染能力，即在感染細(xì)胞后，不能產(chǎn)生新的病毒顆粒，稱為假病毒顆粒。假病毒顆粒釋放到包裝細(xì)胞的培養(yǎng)液中，用于感染靶細(xì)胞，從而將其攜帶的治療基因送入靶細(xì)胞。假病毒顆粒當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)包裝細(xì)胞后，轉(zhuǎn)錄出標(biāo)記基因和VectorDNAHelperDNAEngineeringaVirusintoaVectorwildtypevirusViralvectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeuticgeneessentialviral

genesPackagingcellVectorDNAHelperDNAEngineerinYvectorVectoruncoatingTherapeuticmRNAandproteinEpisomalvectorIntegratedexpressionTargetcellGeneTransferBasedonKayetal2001YvectorVectoruncoatingTherape逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結(jié)合細(xì)胞膜上的特異性受體，基因轉(zhuǎn)移效率更高；2.

結(jié)構(gòu)基因gag、env、pol的缺失不影響其他部分的活性；3.

整合到靶細(xì)胞基因組，可長期表達(dá)；4.

包裝好的假病毒顆粒分泌至包裝細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，易于分離制備。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結(jié)合細(xì)胞膜上的特問題1.只能感染分裂期細(xì)胞,靶細(xì)胞DNA合成很活躍，因為病毒感染和整合作用均依賴靶細(xì)胞DNA的復(fù)制；2.

安全性問題隨機(jī)整合：誘發(fā)插入突變，激活癌基因缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒通過重組獲得復(fù)制能力問題1.只能感染分裂期細(xì)胞,靶細(xì)胞DNA合成很活躍，因為病腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb2.通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，基因?qū)胄矢摺?.不整合宿主基因組，安全。4.宿主細(xì)胞范圍廣泛。5.可口服、噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注。6.載體容量大。7.體外容易培養(yǎng)制備，病毒滴度較高。腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb基因治療課件最新版常用的病毒載體及其基因轉(zhuǎn)移的特點

逆轉(zhuǎn)錄病毒腺病毒腺相關(guān)病毒單純皰疹病毒

基因組正鏈RNA線性dsDNA線性ssDNAdsDNA8～11kb36kb4.7kb152kb外源基因容量

<7kb7.5kb<3.5kb30kb重組病毒滴度中高較低高靶細(xì)胞狀態(tài)分裂細(xì)胞，表面分裂細(xì)胞或分裂細(xì)胞或分裂細(xì)胞或須有特殊受體非分裂細(xì)胞非分裂細(xì)胞非分裂細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率高高高高基因整合隨機(jī)整合不整合定點整合于不整合染色體19q外源基因表達(dá)狀況短暫/穩(wěn)定表達(dá)短暫表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)短暫/穩(wěn)定表達(dá)安全性及其它相對較安全可能引起炎癥無病原性可能出現(xiàn)毒性反應(yīng)宿主范圍廣和免疫反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞嗜向性常用的病毒載體及其基因轉(zhuǎn)移的特點(三)靶細(xì)胞的選擇

生殖細(xì)胞:禁止體細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞腫瘤細(xì)胞等(三)靶細(xì)胞的選擇生殖細(xì)胞:禁止靶細(xì)胞的選擇

可根據(jù)疾病的特點、目的基因及其轉(zhuǎn)移的方式等因素來確定。選擇的原則：

(1)便于從體內(nèi)取出和回輸；

(2)便于在體外培養(yǎng)與增殖；

(3)便于基因的高效轉(zhuǎn)移；

(4)能夠持續(xù)表達(dá)目的基因。靶細(xì)胞的選擇可根據(jù)疾病的特點、目的基因及其轉(zhuǎn)移的方式等因素(四)基因轉(zhuǎn)移病毒法：主要通過攜帶有外源基因的病毒載體感染靶細(xì)胞來實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。

非病毒法：物理方法——DNA直接注射、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊及基因槍技術(shù)等；化學(xué)方法——脂質(zhì)體融合法、磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法等。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用

(四)基因轉(zhuǎn)移病毒法：脂質(zhì)體liposomes脂質(zhì)體liposomes其基本原理是利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起溫育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)勢：使用方便、成本低廉。缺陷：轉(zhuǎn)染效率較低和轉(zhuǎn)染基因表達(dá)時間短暫。基因治療課件最新版(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定外源基因表達(dá)的鑒定：采用Northern印跡雜交：檢測mRNA的表達(dá)測定其表達(dá)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)的含量等方法。

動物實驗(五)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與鑒定外源基因表達(dá)的鑒定：(六)回輸體內(nèi)方式：靜脈注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修飾的淋巴細(xì)胞以靜脈注射的方式回輸?shù)窖褐?；將皮膚成纖維細(xì)胞以細(xì)胞膠原懸液注射至患者皮下組織；采用自體骨髓移植的方法輸入造血細(xì)胞；或以導(dǎo)管技術(shù)將血管內(nèi)皮細(xì)胞定位輸入血管等。(六)回輸體內(nèi)方式：第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所四、基因治療的應(yīng)用與展望第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所四、基因治療的應(yīng)用基因治療的應(yīng)用遺傳病替補(bǔ)法，導(dǎo)入正?；虿《拘约膊∽钄嗖《净蛟隗w內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯腫瘤基因的補(bǔ)充和修復(fù)，免疫療法，細(xì)胞毒基因療法基因治療的應(yīng)用遺傳病遺傳病的基因治療1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2）隱性遺傳的單基因遺傳??；3）該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4)該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮生理作用；5）該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果