基因治療課件最新版

危敏副教授南方醫(yī)科大學基因工程研究所基因治療危敏副教授南方醫(yī)科大學基因治療藥物治療手術治療放射治療理療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：

基因治療(genetherapy)藥物治療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：基因治療一、概念二、策略三、基本流程四、應用與展望基因治療一、概念一、基因治療的概念一、基因治療的概念概念的發(fā)展經典概念：將具有正常功能的基因置換或增補患者體內的缺陷基因，從而達到治療疾病的目的。廣義概念：將某種遺傳物質轉移至患者細胞內，使其在體內有效表達，最終達到治療疾病目的的方法，均稱之為基因治療。概念的發(fā)展經典概念：將具有正常功能的基因置換或增補患者體內的二、基因治療的策略

(一)直接策略：針對致病基因(二)

間接策略：導入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因二、基因治療的策略(一)直接策略：(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因置換（genereplacement）基因增補（geneaugmentation）又稱為補償性基因治療4.

基因干預（geneinterference）又稱為反義基因治療(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因矯正（genecorrection）指將致病基因的突變堿基加以糾正，而保留正常部分?；蛑脫Q（genereplacement）指通過同源重組（基因打靶）技術，將正?；蚨c整合到靶細胞基因組內，以原位替換致病基因。不涉及基因組整體改變的情況下對缺陷基因進行精確的原位修復，是最理想的治療方式?；虺C正（genecorrection）基因打靶技術

指目的基因導入靶細胞后，通過目的基因與靶細胞內染色體上同源DNA序列間的交換，將目的基因定點整合到靶細胞基因組上某一確定位點的技術?；虼虬屑夹g指目的基因導入靶細胞后，通過目的基因與3.

基因增補（geneaugmentation）

成熟的策略

是指不去除異?；?，將有功能的正?；驅氩∽兗毎蚱渌毎蟀l(fā)生非定點整合，表達正常產物以補償缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加強。3.基因增補（geneaugmentation）4.基因干預（geneinterference）是采用特定的方法，導入外源基因選擇性地阻斷、干擾、抑制和封閉有害基因在DNA、RNA和蛋白質水平的表達及其生物合成。導入抑癌基因反義核酸技術

(antisensetechnology)：

①反義RNA；②反基因技術；③核酶RNA干擾（RNAinterference)4.基因干預（geneinterference）抑癌基因療法抑癌基因：是正常細胞內正常存在的，能抑制細胞轉化和腫瘤發(fā)生的一類基因群。

Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因p53基因治療研究：

（1）野生型p53基因的替代療法（2）突變型p53基因的阻斷療法（3）與p53基因有關的新型腫瘤疫苗抑癌基因療法抑癌基因：是正常細胞內正常存在的，能抑制細胞轉化反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA互補的RNA，抑制mRNA的加工與翻譯。核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其與相應mRNA結合后能發(fā)揮酶活性，將mRNA降解。反義脫氧寡核苷酸，ODN反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA反義RNA技術體外合成反義RNA，直接導入；將特異的反義基因通過特定的表達載體（質粒、病毒）導入細胞，轉錄出反義RNA發(fā)揮作用，避免了在給藥途徑中易被RNase降解的缺點。反義RNA技術體外合成反義RNA，直接導入；關鍵性問題1.專一性轉移如何專一的作用于病變細胞，而不影響其他正常細胞。2.反義RNA進入靶細胞前的降解問題解決：特定受體介導的反義RNA轉移關鍵性問題1.專一性轉移受體介導的反義RNA轉移

脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介導的轉移，通過化學物質作為中間連接物，將ASGP與多聚賴氨酸（PL）共價結合，得到ASGP-PL復合物，這種復合物可以攜帶RNA，再專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并被吞噬到肝細胞內發(fā)揮作用。受體介導的反義RNA轉移脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介反義RNA應用前景1.

安全性高

不改變基因結構，最終在細胞內被降解。2.

設計和制備方便

體外轉錄獲得。3.

具有劑量調節(jié)效應4.

能直接作用于一些RNA病毒反義RNA應用前景1.安全性高反基因技術脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,

ODN），也被稱為TFO

(triplehelix-formingoligo)通過TFO在DNA結合蛋白的識別位點處，與靶基因結合形成三螺旋，從而位點專一性地干擾DNA與反式作用因子的結合，抑制轉錄起始或轉錄延伸，達到“反基因”的目的。DNA水平阻止基因轉錄肽核酸（peptidenucleicacids，PNA，一種以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA類似物）反基因技術脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucl基因治療課件最新版核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognitionsequences“hammerhead”ribozymes核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognition1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性剪切RNA活性的RNA分子。1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性核酶具有穩(wěn)定的空間結構，不易受到RNA酶的攻擊。核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結合并切割其他的mRNA，效率高于反義RNA。核酶的特點

核酶具有穩(wěn)定的空間結構，不易受到RNA酶的攻擊。核酶的特點RNA干擾技術概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使同源mRNA發(fā)生特異性的降解，從而阻斷相應基因的表達。高度的序列專一性高效性易操作性RNA干擾技術概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞miRNAMicroRNA（miRNA）是內源性的，是一種非編碼的RNA；由miRNA基因表達出最初的pri-miRNA分子。靶標mRNA通常發(fā)生不完全結合，并且結合的位點是mRNA的非編碼區(qū)的3’端；它不會降解靶標mRNA，而只是阻止mRNA的翻譯。miRNA能夠調節(jié)與生長發(fā)育有關的基因。在生物體中的表達具有時序性、保守性和組織特異性miRNAMicroRNA（miRNA）是內源性的，是一種非(二)間接策略

導入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基因治療分子化療特異性細胞殺傷(二)間接策略

導入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基1.免疫基因治療(1)細胞因子基因治療

IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、

INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增強基因療法

MHCI類抗原、共刺激分子(3)腫瘤DNA疫苗療法癌胚抗原（CEA）制備的腫瘤DNA疫苗1.免疫基因治療(1)細胞因子基因治療TumourNecrosisFactorTumourNecrosisFactor2.分子化療(1)

自殺基因療法：TK基因、CD基因(2)化療保護性基因治療：MDR基因(3)

藥物增敏基因治療：鈣調素基因

2.分子化療(1)自殺基因療法：TK基因、CD基因

(1)自殺基因療法

自殺基因（suicidegene)，前體藥物酶轉化基因該基因表達產生的酶可催化無毒性的藥物前體轉變?yōu)榧毎拘晕镔|，從而殺死腫瘤細胞；同時通過“旁觀者效應”（bystandereffect）殺死鄰近未導入該基因的分裂細胞而顯著擴大殺傷效應。由于攜帶該基因的受體細胞本身也被殺死，所以這類基因被稱為“自殺基因”。(1)自殺基因療法自殺基因（suicidegene自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因編碼胸苷激酶（TK）催化丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）成為磷酸化的核苷酸類似物，阻斷DNA的合成而使細胞死亡。大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（CD）基因將5’-氟胞嘧啶（5’-FC）轉化為5’-氟尿嘧啶（5’-FU）而發(fā)揮細胞毒性作用。自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因viralvector（HSV）tumourcellthymidinekinasegeneganciclovir

phosphateGanciclovir（GCV）tkviralvectortumourcellthyGanciclovirphosphateinhibitsDNApolymeraseCelldeath–IncludingbystandercellsGanciclovirphosphateCelldeat(2)化療保護性基因治療指將編碼抗細胞毒性藥物蛋白的基因導入人體細胞，以提高機體耐受腫瘤化療藥物的能力。如將多藥抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1導入骨髓造血干細胞，減少骨髓受抑制的程度，以加大化療劑量，提高化療效果。(2)化療保護性基因治療指將編碼抗細胞毒性藥物蛋白的基

(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細胞后，改變腫瘤細胞對藥物的敏感性。如將鈣調素基因轉入癌細胞，其表達產物作為細胞內信號轉導系統(tǒng)的重要物質，明顯增強腫瘤細胞對化療藥物的吸收量而相應減少了排出量，使癌細胞對化療藥物的敏感性明顯提高。(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細胞后，改變腫瘤3.特異性細胞殺傷指利用重組DNA技術將生物來源的細胞毒素基因與一些特異受體的配體基因融合，構建融合基因，導入高度表達該受體的腫瘤細胞，以特異性殺傷該腫瘤細胞。3.特異性細胞殺傷指利用重組DNA技術將生物來源的細胞毒素基特異性細胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因與TGFα基因組成融合基因TGFα-PE，或TGFα-DT。由于TGFα與表皮生長因子EGF結構類似，也能與表皮生長因子受體（EGFR）結合；故該融合基因可特異性進入并殺死高度表達EGFR的膀胱癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細胞。特異性細胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備（二）載體的選擇與構建（三）靶細胞的選擇（四）基因轉移（五）基因轉染細胞的篩選與鑒定（六）回輸體內

三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備基因治療的方式根據基因導入的方式分為兩種：1.直接體內療法（invivo）是指將目的基因直接導入體內有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。2.間接體內療法（exvivo）是指在體外將目的基因導入靶細胞，經過篩選和增殖后將細胞回輸給患者，使該基因在體內有效地表達相應產物，以達到治療的目的。

基因治療的方式根據基因導入的方式分為兩種：基因治療課件最新版基因治療的種類生殖細胞基因治療可遺傳性倫理學問題

禁止應用人體體細胞基因治療：研究重點基因治療的種類生殖細胞基因治療體細胞治療的概念指應用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體細胞；經體外操作后?；剌敚ɑ蛑踩耄┤梭w的治療方法。體細胞治療的概念指應用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體（一）外源基因的選擇與制備

外源基因目的基因：與致病基因相對應的有功能的正?；蚺c致病基因無關、有治療作用的基因標記基因:新霉素磷酸轉移酶（Neo）基因外源基因的獲得

基因克隆人工合成PCR擴增（一）外源基因的選擇與制備外源基因外源基因的選擇原則體內少量表達就可顯著改善癥狀；過高表達不會對機體造成危害；在抗病毒和病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應在病毒和病原體的生活史中起重要的作用，并且該序列是特異的；腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉入人體；可采用反義技術封閉細胞內活化的癌基因或向細胞內轉入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生長，所針對的癌基因或抑癌基因應與該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有明確的相關性。外源基因的選擇原則體內少量表達就可顯著改善癥狀；（二）載體的選擇與構建

病毒載體：

逆轉錄病毒（RV)腺病毒（AV)腺相關病毒（AAV)單純皰疹病毒（HSV)痘苗病毒（VV)非病毒載體：

脂質體法直接注射法受體介導基因轉移DNA-磷酸鈣共沉淀電穿孔（二）載體的選擇與構建病毒載體：非病毒載體：逆轉錄病毒結構逆轉錄病毒結構逆轉錄病毒的基因組結構3’LTR5’LTRgagpolenv結構基因gag(groupantigen)

：編碼核心蛋白和屬特異性抗原pol(polymerase)

：編碼逆轉錄酶env

(envelop)

：編碼病毒外殼蛋白和包膜蛋白LTR（longterminalrepeat）序列含增強子、啟動子、轉錄所需起始和終止信號逆轉錄病毒的基因組結構3’LTR5’LTRgag逆轉錄病毒的生活史逆轉錄病毒宿主細胞病毒RNAcDNA前病毒病毒RNA包裝蛋白包裝成完整的病毒顆粒出芽分泌子代病毒感染其他細胞整合逆轉錄病毒的生活史逆轉錄病毒宿主細胞病毒RNAcDNA前病病毒載體構建（1）去除病毒致病性結構的基因序列如逆轉錄病毒的gag、pol、env基因，從結構上保證病毒的安全性。同時產生的空白區(qū)以目的基因取而代之；（2）保留其基因的調控序列及包裝序列等；（3）插入標記基因如Neo基因以對基因轉染細胞的抗性篩選等。病毒載體構建（1）去除病毒致病性結構的基因序列如逆轉錄病毒的包裝細胞指將缺失了包裝信號及相關序列的缺陷型逆轉錄病毒（輔助病毒）導入哺乳細胞內而制備成的一種特殊的細胞系.這種細胞因攜帶有完整的病毒結構基因序列能夠大量產生病毒包裝蛋白，而輔助病毒自身缺乏包裝信號（ψ序列）而不能包裝,不產生有復制能力的野生型病毒顆粒。包裝細胞指將缺失了包裝信號及相關序列的缺陷型逆轉錄病毒（輔助假病毒顆粒當逆轉錄病毒載體轉染進包裝細胞后，轉錄出標記基因和目的基因的RNA，含有兩端的LTR和包裝信號，被包裝細胞產生的病毒蛋白包裝成病毒顆粒。因包裝的RNA中不含病毒蛋白的編碼序列，導致這種病毒只有一次感染能力，即在感染細胞后，不能產生新的病毒顆粒，稱為假病毒顆粒。假病毒顆粒釋放到包裝細胞的培養(yǎng)液中，用于感染靶細胞，從而將其攜帶的治療基因送入靶細胞。假病毒顆粒當逆轉錄病毒載體轉染進包裝細胞后，轉錄出標記基因和VectorDNAHelperDNAEngineeringaVirusintoaVectorwildtypevirusViralvectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeuticgeneessentialviral

genesPackagingcellVectorDNAHelperDNAEngineerinYvectorVectoruncoatingTherapeuticmRNAandproteinEpisomalvectorIntegratedexpressionTargetcellGeneTransferBasedonKayetal2001YvectorVectoruncoatingTherape逆轉錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結合細胞膜上的特異性受體，基因轉移效率更高；2.

結構基因gag、env、pol的缺失不影響其他部分的活性；3.

整合到靶細胞基因組，可長期表達；4.

包裝好的假病毒顆粒分泌至包裝細胞的培養(yǎng)上清中，易于分離制備。逆轉錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結合細胞膜上的特問題1.只能感染分裂期細胞,靶細胞DNA合成很活躍，因為病毒感染和整合作用均依賴靶細胞DNA的復制；2.

安全性問題隨機整合：誘發(fā)插入突變，激活癌基因缺陷型逆轉錄病毒通過重組獲得復制能力問題1.只能感染分裂期細胞,靶細胞DNA合成很活躍，因為病腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb2.通過受體介導內吞作用進入細胞，基因導入效率高。3.不整合宿主基因組，安全。4.宿主細胞范圍廣泛。5.可口服、噴霧吸入或氣管內滴注。6.載體容量大。7.體外容易培養(yǎng)制備，病毒滴度較高。腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb基因治療課件最新版常用的病毒載體及其基因轉移的特點

逆轉錄病毒腺病毒腺相關病毒單純皰疹病毒

基因組正鏈RNA線性dsDNA線性ssDNAdsDNA8～11kb36kb4.7kb152kb外源基因容量

<7kb7.5kb<3.5kb30kb重組病毒滴度中高較低高靶細胞狀態(tài)分裂細胞，表面分裂細胞或分裂細胞或分裂細胞或須有特殊受體非分裂細胞非分裂細胞非分裂細胞基因轉移效率高高高高基因整合隨機整合不整合定點整合于不整合染色體19q外源基因表達狀況短暫/穩(wěn)定表達短暫表達穩(wěn)定表達短暫/穩(wěn)定表達安全性及其它相對較安全可能引起炎癥無病原性可能出現(xiàn)毒性反應宿主范圍廣和免疫反應神經細胞嗜向性常用的病毒載體及其基因轉移的特點(三)靶細胞的選擇

生殖細胞:禁止體細胞：淋巴細胞、造血細胞、內皮細胞、肌肉細胞、肝細胞、成纖維細胞腫瘤細胞等(三)靶細胞的選擇生殖細胞:禁止靶細胞的選擇

可根據疾病的特點、目的基因及其轉移的方式等因素來確定。選擇的原則：

(1)便于從體內取出和回輸；

(2)便于在體外培養(yǎng)與增殖；

(3)便于基因的高效轉移；

(4)能夠持續(xù)表達目的基因。靶細胞的選擇可根據疾病的特點、目的基因及其轉移的方式等因素(四)基因轉移病毒法：主要通過攜帶有外源基因的病毒載體感染靶細胞來實現(xiàn)基因的轉移。

非病毒法：物理方法——DNA直接注射、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊及基因槍技術等；化學方法——脂質體融合法、磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法等。受體介導的內吞作用

(四)基因轉移病毒法：脂質體liposomes脂質體liposomes其基本原理是利用陽離子脂質體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質體，然后與細胞一起溫育，即可通過細胞內吞作用將外源DNA轉移到細胞內。優(yōu)勢：使用方便、成本低廉。缺陷：轉染效率較低和轉染基因表達時間短暫?；蛑委熣n件最新版(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定外源基因表達的鑒定：采用Northern印跡雜交：檢測mRNA的表達測定其表達產物即蛋白質的含量等方法。

動物實驗(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定外源基因表達的鑒定：(六)回輸體內方式：靜脈注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修飾的淋巴細胞以靜脈注射的方式回輸到血液中；將皮膚成纖維細胞以細胞膠原懸液注射至患者皮下組織；采用自體骨髓移植的方法輸入造血細胞；或以導管技術將血管內皮細胞定位輸入血管等。(六)回輸體內方式：第一軍醫(yī)大學分子生物學研究所四、基因治療的應用與展望第一軍醫(yī)大學分子生物學研究所四、基因治療的應用基因治療的應用遺傳病替補法，導入正?；虿《拘约膊∽钄嗖《净蛟隗w內的轉錄和翻譯腫瘤基因的補充和修復，免疫療法，細胞毒基因療法基因治療的應用遺傳病遺傳病的基因治療1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2）隱性遺傳的單基因遺傳??；3）該基因的表達不需要精確調控；4)該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞中表達并發(fā)揮生理作用；5）該遺傳病不經治療將有嚴重后果。遺傳病的基因治療1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；遺傳病基因治療的臨床研究1.腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥2.家族性高膽固醇血癥（FH）3.囊性纖維變性（CF）4.粘多糖沉積癥5.血友病B（凝血因子IX缺乏）遺傳病基因治療的臨床研究1.腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥“先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征”(SCID)“先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征”(SCID)AshantiDeSilvawasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapyin1990.ShereceivedinfusionsofTcellsthathadbeentransducedwithageneforADA(anenzymethatshelacks)AshantiDeSilvawasthefirstADA缺陷病的分子機制腺苷脫氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A）和脫氧腺嘌呤核苷（dA）脫氨，生成次黃嘌呤核苷和脫氧次黃嘌呤核苷。ADA缺陷→脫氧腺嘌呤核苷酸代謝受阻→dATP↑

→抑制核糖核苷還原酶活性→阻止DNA復制和修復→導致細胞死亡，對淋巴細胞毒性最強。ADA缺陷病的分子機制腺苷脫氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A1）單個核細胞的分離：使用淋巴細胞分層液分離患兒血中單個核細胞；2）單個核細胞培養(yǎng)：以“CD3抗體+IL2”體外培養(yǎng)以刺激T細胞增殖，分化；3）逆轉錄病毒載體介導外源基因（治療基因+標志基因）轉染T細胞；4）將轉染細胞回輸給患兒體內。ADA基因治療方案1）單個核細胞的分離：使用淋巴細胞分層液分離患兒血中單個核細腫瘤的基因治療策略一、抑制和殺傷腫瘤細胞1.自殺基因療法（tk、CD基因）2.抑制癌基因的表達（反義RNA、核酶、細胞內抗體）3.恢復抑癌基因的功能（p53、Rb基因）4.抗腫瘤血管形成腫瘤的基因治療策略一、抑制和殺傷腫瘤細胞腫瘤的基因治療策略二、腫瘤細胞的基因“修飾”1.導入細胞因子基因2.導入MHC基因和共刺激分子基因腫瘤的基因治療策略二、腫瘤細胞的基因“修飾”三、調節(jié)和增強機體的免疫功能1.細胞因子基因導入免疫細胞2.基因修飾的樹突狀細胞3.分泌免疫毒素的T淋巴細胞4.腫瘤DNA疫苗腫瘤的基因治療策略三、調節(jié)和增強機體的免疫功能腫瘤的基因治療策略腫瘤基因治療臨床試驗方案黑色素瘤83前列腺癌44乳腺癌32間質瘤3卵巢癌31頭頸部癌癥31膠質瘤28結腸癌25肺癌26胰腺癌3腎癌21膀胱癌2成神經細胞瘤7子宮頸癌6腫瘤基因治療臨床試驗方案黑色素瘤83前列腺癌44乳腺癌32間病毒性疾病的基因治療針對病毒:誘導對病毒RNA的降解抑制病毒與宿主細胞結合干擾病毒基因組的轉錄起始和調控抑制病毒基因組的復制和蛋白質合成RNA干擾技術病毒性疾病的基因治療針對病毒:中國的基因治療1991.12血友病B，凝血因子IX，逆轉錄病毒載體，導入患者自身皮膚成纖維細胞。惡性腦膠質瘤，TK基因非小細胞肺癌，逆轉錄病毒，IL-2中國的基因治療1991.12血友病B，凝血因子IX，逆轉基因治療藥物2003年10月16日，擁有自主知識產權的重組人p53腺病毒注射液(Gendicine)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的新藥證書。這是世界上第一個獲得正式批準的基因治療藥物?；蛑委熕幬?003年10月16日，擁有自主知識產權的重組人基因治療存在的問題三個關鍵問題：

構建高效、靶向性基因轉移系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)切實有效的治療基因外源基因表達的調控一個需要重視的問題：

外源基因的導入對機體帶來的不利影響

基因治療存在的問題三個關鍵問題：1999年“杰辛格”基因療法失敗.18歲的澤西·杰辛格患有鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(OTC)缺失癥，接受基因療法后意外死亡。1999年“杰辛格”基因療法失敗.基因治療課件最新版基因治療課件最新版基因治療課件最新版基因治療課件最新版基因治療課件最新版現(xiàn)狀及展望基因治療現(xiàn)階段僅僅是實驗性地運用于經過其他治療無效的“絕癥”；酶及藥物性的化學療法，以及骨髓、器官移植仍然是當前治療多種遺傳病的最有效手段；癌癥的治療仍以手術切除及化療為主。道路曲折，前途光明現(xiàn)狀及展望基因治療現(xiàn)階段僅僅是實驗性地運用于經過其他治療無效本章小結基因治療：指將外源基因轉移至患者細胞內并有效適度表達，以達到治療疾病的目的?；蛑委煵呗裕?1)直接策略：基因矯正、基因置換、基因增補、基因干預；(2)間接策略：免疫基因治療、分子化療、特異性細胞殺傷等。本章小結基因治療：本章小結基因治療方式：直接體內療法和間接體內療法兩種。基本流程：外源基因的選擇與制備、表達載體的選擇與構建、靶細胞的選擇，基因轉移，基因轉染細胞的篩選與鑒定，回輸體內?；蛑委熢谶z傳性疾病、腫瘤、心血管疾病、感染性疾病以及神經系統(tǒng)疾病等的治療中具有誘人的前景。本章小結基因治療方式：思考題腫瘤的基因治療包括哪些基本策略？以逆轉錄病毒載體進行exvivo基因治療為例，試述其技術原理及基本過程。針對目前存在的問題，該怎樣看待基因治療的現(xiàn)狀及發(fā)展前景？思考題腫瘤的基因治療包括哪些基本策略？基因治療課件最新版本文檔支持任意編輯，下載使用，定會成功！本文檔支持任意編輯，下載使用，定會成功！危敏副教授南方醫(yī)科大學基因工程研究所基因治療危敏副教授南方醫(yī)科大學基因治療藥物治療手術治療放射治療理療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：

基因治療(genetherapy)藥物治療傳統(tǒng)治療方法新的生物治療：基因治療一、概念二、策略三、基本流程四、應用與展望基因治療一、概念一、基因治療的概念一、基因治療的概念概念的發(fā)展經典概念：將具有正常功能的基因置換或增補患者體內的缺陷基因，從而達到治療疾病的目的。廣義概念：將某種遺傳物質轉移至患者細胞內，使其在體內有效表達，最終達到治療疾病目的的方法，均稱之為基因治療。概念的發(fā)展經典概念：將具有正常功能的基因置換或增補患者體內的二、基因治療的策略

(一)直接策略：針對致病基因(二)

間接策略：導入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因二、基因治療的策略(一)直接策略：(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因置換（genereplacement）基因增補（geneaugmentation）又稱為補償性基因治療4.

基因干預（geneinterference）又稱為反義基因治療(一)直接策略基因矯正（genecorrection）基因矯正（genecorrection）指將致病基因的突變堿基加以糾正，而保留正常部分?；蛑脫Q（genereplacement）指通過同源重組（基因打靶）技術，將正?；蚨c整合到靶細胞基因組內，以原位替換致病基因。不涉及基因組整體改變的情況下對缺陷基因進行精確的原位修復，是最理想的治療方式?；虺C正（genecorrection）基因打靶技術

指目的基因導入靶細胞后，通過目的基因與靶細胞內染色體上同源DNA序列間的交換，將目的基因定點整合到靶細胞基因組上某一確定位點的技術?；虼虬屑夹g指目的基因導入靶細胞后，通過目的基因與3.

基因增補（geneaugmentation）

成熟的策略

是指不去除異常基因，將有功能的正?；驅氩∽兗毎蚱渌毎蟀l(fā)生非定點整合，表達正常產物以補償缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加強。3.基因增補（geneaugmentation）4.基因干預（geneinterference）是采用特定的方法，導入外源基因選擇性地阻斷、干擾、抑制和封閉有害基因在DNA、RNA和蛋白質水平的表達及其生物合成。導入抑癌基因反義核酸技術

(antisensetechnology)：

①反義RNA；②反基因技術；③核酶RNA干擾（RNAinterference)4.基因干預（geneinterference）抑癌基因療法抑癌基因：是正常細胞內正常存在的，能抑制細胞轉化和腫瘤發(fā)生的一類基因群。

Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因p53基因治療研究：

（1）野生型p53基因的替代療法（2）突變型p53基因的阻斷療法（3）與p53基因有關的新型腫瘤疫苗抑癌基因療法抑癌基因：是正常細胞內正常存在的，能抑制細胞轉化反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA互補的RNA，抑制mRNA的加工與翻譯。核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其與相應mRNA結合后能發(fā)揮酶活性，將mRNA降解。反義脫氧寡核苷酸，ODN反義核酸反義RNA（antisenseRNA）：與mRNA反義RNA技術體外合成反義RNA，直接導入；將特異的反義基因通過特定的表達載體（質粒、病毒）導入細胞，轉錄出反義RNA發(fā)揮作用，避免了在給藥途徑中易被RNase降解的缺點。反義RNA技術體外合成反義RNA，直接導入；關鍵性問題1.專一性轉移如何專一的作用于病變細胞，而不影響其他正常細胞。2.反義RNA進入靶細胞前的降解問題解決：特定受體介導的反義RNA轉移關鍵性問題1.專一性轉移受體介導的反義RNA轉移

脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介導的轉移，通過化學物質作為中間連接物，將ASGP與多聚賴氨酸（PL）共價結合，得到ASGP-PL復合物，這種復合物可以攜帶RNA，再專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并被吞噬到肝細胞內發(fā)揮作用。受體介導的反義RNA轉移脫唾液酸糖蛋白（ASGP）受體介反義RNA應用前景1.

安全性高

不改變基因結構，最終在細胞內被降解。2.

設計和制備方便

體外轉錄獲得。3.

具有劑量調節(jié)效應4.

能直接作用于一些RNA病毒反義RNA應用前景1.安全性高反基因技術脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide,

ODN），也被稱為TFO

(triplehelix-formingoligo)通過TFO在DNA結合蛋白的識別位點處，與靶基因結合形成三螺旋，從而位點專一性地干擾DNA與反式作用因子的結合，抑制轉錄起始或轉錄延伸，達到“反基因”的目的。DNA水平阻止基因轉錄肽核酸（peptidenucleicacids，PNA，一種以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA類似物）反基因技術脫氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucl基因治療課件最新版核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognitionsequences“hammerhead”ribozymes核酶催化RNA切割和RNA剪接Recognition1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性剪切RNA活性的RNA分子。1981年，Cetch和Alfman首次發(fā)現(xiàn)了一類具有特異性核酶具有穩(wěn)定的空間結構，不易受到RNA酶的攻擊。核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結合并切割其他的mRNA，效率高于反義RNA。核酶的特點

核酶具有穩(wěn)定的空間結構，不易受到RNA酶的攻擊。核酶的特點RNA干擾技術概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使同源mRNA發(fā)生特異性的降解，從而阻斷相應基因的表達。高度的序列專一性高效性易操作性RNA干擾技術概念：短的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞miRNAMicroRNA（miRNA）是內源性的，是一種非編碼的RNA；由miRNA基因表達出最初的pri-miRNA分子。靶標mRNA通常發(fā)生不完全結合，并且結合的位點是mRNA的非編碼區(qū)的3’端；它不會降解靶標mRNA，而只是阻止mRNA的翻譯。miRNA能夠調節(jié)與生長發(fā)育有關的基因。在生物體中的表達具有時序性、保守性和組織特異性miRNAMicroRNA（miRNA）是內源性的，是一種非(二)間接策略

導入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基因治療分子化療特異性細胞殺傷(二)間接策略

導入與致病基因無直接聯(lián)系的治療基因免疫基1.免疫基因治療(1)細胞因子基因治療

IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、

INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF(2)免疫增強基因療法

MHCI類抗原、共刺激分子(3)腫瘤DNA疫苗療法癌胚抗原（CEA）制備的腫瘤DNA疫苗1.免疫基因治療(1)細胞因子基因治療TumourNecrosisFactorTumourNecrosisFactor2.分子化療(1)

自殺基因療法：TK基因、CD基因(2)化療保護性基因治療：MDR基因(3)

藥物增敏基因治療：鈣調素基因

2.分子化療(1)自殺基因療法：TK基因、CD基因

(1)自殺基因療法

自殺基因（suicidegene)，前體藥物酶轉化基因該基因表達產生的酶可催化無毒性的藥物前體轉變?yōu)榧毎拘晕镔|，從而殺死腫瘤細胞；同時通過“旁觀者效應”（bystandereffect）殺死鄰近未導入該基因的分裂細胞而顯著擴大殺傷效應。由于攜帶該基因的受體細胞本身也被殺死，所以這類基因被稱為“自殺基因”。(1)自殺基因療法自殺基因（suicidegene自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因編碼胸苷激酶（TK）催化丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）成為磷酸化的核苷酸類似物，阻斷DNA的合成而使細胞死亡。大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（CD）基因將5’-氟胞嘧啶（5’-FC）轉化為5’-氟尿嘧啶（5’-FU）而發(fā)揮細胞毒性作用。自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因viralvector（HSV）tumourcellthymidinekinasegeneganciclovir

phosphateGanciclovir（GCV）tkviralvectortumourcellthyGanciclovirphosphateinhibitsDNApolymeraseCelldeath–IncludingbystandercellsGanciclovirphosphateCelldeat(2)化療保護性基因治療指將編碼抗細胞毒性藥物蛋白的基因導入人體細胞，以提高機體耐受腫瘤化療藥物的能力。如將多藥抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1導入骨髓造血干細胞，減少骨髓受抑制的程度，以加大化療劑量，提高化療效果。(2)化療保護性基因治療指將編碼抗細胞毒性藥物蛋白的基

(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細胞后，改變腫瘤細胞對藥物的敏感性。如將鈣調素基因轉入癌細胞，其表達產物作為細胞內信號轉導系統(tǒng)的重要物質，明顯增強腫瘤細胞對化療藥物的吸收量而相應減少了排出量，使癌細胞對化療藥物的敏感性明顯提高。(3)藥物增敏基因治療將外源基因插入腫瘤細胞后，改變腫瘤3.特異性細胞殺傷指利用重組DNA技術將生物來源的細胞毒素基因與一些特異受體的配體基因融合，構建融合基因，導入高度表達該受體的腫瘤細胞，以特異性殺傷該腫瘤細胞。3.特異性細胞殺傷指利用重組DNA技術將生物來源的細胞毒素基特異性細胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因與TGFα基因組成融合基因TGFα-PE，或TGFα-DT。由于TGFα與表皮生長因子EGF結構類似，也能與表皮生長因子受體（EGFR）結合；故該融合基因可特異性進入并殺死高度表達EGFR的膀胱癌、腎癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤細胞。特異性細胞殺傷如將綠膿桿菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備（二）載體的選擇與構建（三）靶細胞的選擇（四）基因轉移（五）基因轉染細胞的篩選與鑒定（六）回輸體內

三、基因治療的基本流程（一）外源基因的選擇與制備基因治療的方式根據基因導入的方式分為兩種：1.直接體內療法（invivo）是指將目的基因直接導入體內有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。2.間接體內療法（exvivo）是指在體外將目的基因導入靶細胞，經過篩選和增殖后將細胞回輸給患者，使該基因在體內有效地表達相應產物，以達到治療的目的。

基因治療的方式根據基因導入的方式分為兩種：基因治療課件最新版基因治療的種類生殖細胞基因治療可遺傳性倫理學問題

禁止應用人體體細胞基因治療：研究重點基因治療的種類生殖細胞基因治療體細胞治療的概念指應用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體細胞；經體外操作后?；剌敚ɑ蛑踩耄┤梭w的治療方法。體細胞治療的概念指應用人的自體、同種異體或異種（非人體）的體（一）外源基因的選擇與制備

外源基因目的基因：與致病基因相對應的有功能的正?；蚺c致病基因無關、有治療作用的基因標記基因:新霉素磷酸轉移酶（Neo）基因外源基因的獲得

基因克隆人工合成PCR擴增（一）外源基因的選擇與制備外源基因外源基因的選擇原則體內少量表達就可顯著改善癥狀；過高表達不會對機體造成危害；在抗病毒和病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應在病毒和病原體的生活史中起重要的作用，并且該序列是特異的；腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉入人體；可采用反義技術封閉細胞內活化的癌基因或向細胞內轉入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生長，所針對的癌基因或抑癌基因應與該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有明確的相關性。外源基因的選擇原則體內少量表達就可顯著改善癥狀；（二）載體的選擇與構建

病毒載體：

逆轉錄病毒（RV)腺病毒（AV)腺相關病毒（AAV)單純皰疹病毒（HSV)痘苗病毒（VV)非病毒載體：

脂質體法直接注射法受體介導基因轉移DNA-磷酸鈣共沉淀電穿孔（二）載體的選擇與構建病毒載體：非病毒載體：逆轉錄病毒結構逆轉錄病毒結構逆轉錄病毒的基因組結構3’LTR5’LTRgagpolenv結構基因gag(groupantigen)

：編碼核心蛋白和屬特異性抗原pol(polymerase)

：編碼逆轉錄酶env

(envelop)

：編碼病毒外殼蛋白和包膜蛋白LTR（longterminalrepeat）序列含增強子、啟動子、轉錄所需起始和終止信號逆轉錄病毒的基因組結構3’LTR5’LTRgag逆轉錄病毒的生活史逆轉錄病毒宿主細胞病毒RNAcDNA前病毒病毒RNA包裝蛋白包裝成完整的病毒顆粒出芽分泌子代病毒感染其他細胞整合逆轉錄病毒的生活史逆轉錄病毒宿主細胞病毒RNAcDNA前病病毒載體構建（1）去除病毒致病性結構的基因序列如逆轉錄病毒的gag、pol、env基因，從結構上保證病毒的安全性。同時產生的空白區(qū)以目的基因取而代之；（2）保留其基因的調控序列及包裝序列等；（3）插入標記基因如Neo基因以對基因轉染細胞的抗性篩選等。病毒載體構建（1）去除病毒致病性結構的基因序列如逆轉錄病毒的包裝細胞指將缺失了包裝信號及相關序列的缺陷型逆轉錄病毒（輔助病毒）導入哺乳細胞內而制備成的一種特殊的細胞系.這種細胞因攜帶有完整的病毒結構基因序列能夠大量產生病毒包裝蛋白，而輔助病毒自身缺乏包裝信號（ψ序列）而不能包裝,不產生有復制能力的野生型病毒顆粒。包裝細胞指將缺失了包裝信號及相關序列的缺陷型逆轉錄病毒（輔助假病毒顆粒當逆轉錄病毒載體轉染進包裝細胞后，轉錄出標記基因和目的基因的RNA，含有兩端的LTR和包裝信號，被包裝細胞產生的病毒蛋白包裝成病毒顆粒。因包裝的RNA中不含病毒蛋白的編碼序列，導致這種病毒只有一次感染能力，即在感染細胞后，不能產生新的病毒顆粒，稱為假病毒顆粒。假病毒顆粒釋放到包裝細胞的培養(yǎng)液中，用于感染靶細胞，從而將其攜帶的治療基因送入靶細胞。假病毒顆粒當逆轉錄病毒載體轉染進包裝細胞后，轉錄出標記基因和VectorDNAHelperDNAEngineeringaVirusintoaVectorwildtypevirusViralvectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeuticgeneessentialviral

genesPackagingcellVectorDNAHelperDNAEngineerinYvectorVectoruncoatingTherapeuticmRNAandproteinEpisomalvectorIntegratedexpressionTargetcellGeneTransferBasedonKayetal2001YvectorVectoruncoatingTherape逆轉錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結合細胞膜上的特異性受體，基因轉移效率更高；2.

結構基因gag、env、pol的缺失不影響其他部分的活性；3.

整合到靶細胞基因組，可長期表達；4.

包裝好的假病毒顆粒分泌至包裝細胞的培養(yǎng)上清中，易于分離制備。逆轉錄病毒載體的特點1.env編碼的糖蛋白結合細胞膜上的特問題1.只能感染分裂期細胞,靶細胞DNA合成很活躍，因為病毒感染和整合作用均依賴靶細胞DNA的復制；2.

安全性問題隨機整合：誘發(fā)插入突變，激活癌基因缺陷型逆轉錄病毒通過重組獲得復制能力問題1.只能感染分裂期細胞,靶細胞DNA合成很活躍，因為病腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb2.通過受體介導內吞作用進入細胞，基因導入效率高。3.不整合宿主基因組，安全。4.宿主細胞范圍廣泛。5.可口服、噴霧吸入或氣管內滴注。6.載體容量大。7.體外容易培養(yǎng)制備，病毒滴度較高。腺病毒載體1.基因組：雙鏈無包膜DNA病毒，36kb基因治療課件最新版常用的病毒載體及其基因轉移的特點

逆轉錄病毒腺病毒腺相關病毒單純皰疹病毒

基因組正鏈RNA線性dsDNA線性ssDNAdsDNA8～11kb36kb4.7kb152kb外源基因容量

<7kb7.5kb<3.5kb30kb重組病毒滴度中高較低高靶細胞狀態(tài)分裂細胞，表面分裂細胞或分裂細胞或分裂細胞或須有特殊受體非分裂細胞非分裂細胞非分裂細胞基因轉移效率高高高高基因整合隨機整合不整合定點整合于不整合染色體19q外源基因表達狀況短暫/穩(wěn)定表達短暫表達穩(wěn)定表達短暫/穩(wěn)定表達安全性及其它相對較安全可能引起炎癥無病原性可能出現(xiàn)毒性反應宿主范圍廣和免疫反應神經細胞嗜向性常用的病毒載體及其基因轉移的特點(三)靶細胞的選擇

生殖細胞:禁止體細胞：淋巴細胞、造血細胞、內皮細胞、肌肉細胞、肝細胞、成纖維細胞腫瘤細胞等(三)靶細胞的選擇生殖細胞:禁止靶細胞的選擇

可根據疾病的特點、目的基因及其轉移的方式等因素來確定。選擇的原則：

(1)便于從體內取出和回輸；

(2)便于在體外培養(yǎng)與增殖；

(3)便于基因的高效轉移；

(4)能夠持續(xù)表達目的基因。靶細胞的選擇可根據疾病的特點、目的基因及其轉移的方式等因素(四)基因轉移病毒法：主要通過攜帶有外源基因的病毒載體感染靶細胞來實現(xiàn)基因的轉移。

非病毒法：物理方法——DNA直接注射、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊及基因槍技術等；化學方法——脂質體融合法、磷酸鈣沉淀法、DEAE-葡聚糖法等。受體介導的內吞作用

(四)基因轉移病毒法：脂質體liposomes脂質體liposomes其基本原理是利用陽離子脂質體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質體，然后與細胞一起溫育，即可通過細胞內吞作用將外源DNA轉移到細胞內。優(yōu)勢：使用方便、成本低廉。缺陷：轉染效率較低和轉染基因表達時間短暫?；蛑委熣n件最新版(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定外源基因表達的鑒定：采用Northern印跡雜交：檢測mRNA的表達測定其表達產物即蛋白質的含量等方法。

動物實驗(五)基因轉染細胞的篩選與鑒定外源基因表達的鑒定：(六)回輸體內方式：靜脈注射、肌注、皮下注射、滴鼻等基因修飾的淋巴細胞以靜脈注射的方式回輸到血液中；將皮膚成纖維細胞以細胞膠原懸液注射至患者皮下組織；采用自體骨髓移植的方法輸入造血細胞；或以導管技術將血管內皮細胞定位輸入血管等。(六)回輸體內方式：第一軍醫(yī)大學分子生物學研究所四、基因治療的應用與展望第一軍醫(yī)大學分子生物學研究所四、基因治療的應用基因治療的應用遺傳病替補法，導入正?；虿《拘约膊∽钄嗖《净蛟隗w內的轉錄和翻譯腫瘤基因的補充和修復，免疫療法，細胞毒基因療法基因治療的應用遺傳病遺傳病的基因治療1）在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2）隱性遺傳的單基因遺傳病；3）該基因的表達不需要精確調控；4)該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞中表達并發(fā)揮生理作用；5）該遺傳病不經治療將有嚴重后果