三大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化課件

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

制備及轉(zhuǎn)化

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

制備及轉(zhuǎn)化1實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩苽浜捅４娲竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法掌握轉(zhuǎn)化的方法技術(shù)了解轉(zhuǎn)化過程中各因素對轉(zhuǎn)化率的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩苽浜捅４娲竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法2感受態(tài)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理定義感受態(tài)（Competence)：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)轉(zhuǎn)化（transformation)：異源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程致敏過程:用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作感受態(tài)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理3在生長周期的任何時(shí)刻自動產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.枯草桿菌）在生長周期的特定時(shí)刻產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.大腸桿菌）細(xì)菌產(chǎn)生感受態(tài)的類型在生長周期的任何時(shí)刻自動產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.枯草桿菌）細(xì)4受體菌與質(zhì)粒的選擇

受體菌：

E.ColiDH5α：無Ap抗性外源質(zhì)粒

Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力

選擇:

如進(jìn)行藍(lán)白斑篩選時(shí)可選用DH5α、JM109、TG1；用T7啟動子進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)可選用BL21(DE3)；受體菌與質(zhì)粒的選擇

受體菌：5制備感受態(tài)細(xì)胞方法

原生質(zhì)體法電擊法特殊試劑誘導(dǎo)法：CaCl2誘導(dǎo)法制備感受態(tài)細(xì)胞方法6

+質(zhì)粒DNA420C熱擊復(fù)蘇Amp+細(xì)菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)短時(shí)間420C熱擊處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時(shí)間，使抗氨芐青霉素的表型表達(dá)后再轉(zhuǎn)到含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上，長出來的菌即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌株。+質(zhì)粒DNA420C熱擊復(fù)蘇Amp+細(xì)菌處于00C,CaC7轉(zhuǎn)化率定義及計(jì)算公式：轉(zhuǎn)化子數(shù)/ugDNA=單菌落數(shù)質(zhì)粒濃度(ng/ul)X

1uL2.5ng/uLX10x1000轉(zhuǎn)化率定義及計(jì)算X10x10008影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長狀態(tài)：大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感受態(tài)OD值：0.3－0.5(5X107個/ml)試劑的質(zhì)量：化合物及無機(jī)離子：Rb+、Mn+、二甲亞砜等質(zhì)粒：大小、構(gòu)型外源DNA（質(zhì)粒）與細(xì)胞的比例：器皿的潔凈度污染—盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺中進(jìn)行影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長狀態(tài)：大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感9感受態(tài)細(xì)胞的保存

制備好的感受態(tài)細(xì)胞每100uL分裝一支EP管輕輕混勻----可以用tip頭輕輕攪勻.

4℃保存（不加甘油），可保存一周；加30%甘油，-20℃保存，可保存一月；加30%甘油，80℃保存，可保存六月；感受態(tài)細(xì)胞的保存制備好的感受態(tài)細(xì)胞每100uL分裝一支E10實(shí)驗(yàn)器材搖床分光光度計(jì)冷凍離心機(jī)超凈工作臺恒溫水浴涂布棒恒溫培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)器材搖床11實(shí)驗(yàn)試劑LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基氨芐青霉素0.1MCaCl230%甘油實(shí)驗(yàn)試劑LB液體培養(yǎng)基12實(shí)驗(yàn)流程1、接單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜2、5%（250ul)菌液接種到含5mlLB的試管中，370C振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)，至OD6000.4-0.5（已完成）3、將1.5mL菌液轉(zhuǎn)移到離心管中4、離心5000rpm，40C，5min5、倒出培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)流程1、接單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C、1136.用冰預(yù)冷的1mL0.1M的CaCl2處理、懸浮細(xì)胞，7.冰上20min8.(取1.5mL)5000rpm離心5min，傾去上清9.100uLCaCl2輕輕懸浮，冰浴大腸桿菌DH5α感受態(tài)的制備6.用冰預(yù)冷的1mL0.1M的CaCl2處理、懸浮細(xì)14實(shí)驗(yàn)流程大腸桿菌DH5α受態(tài)的制備--------1ml-----------20min實(shí)驗(yàn)流程大腸桿菌DH5α受態(tài)的制備--------1ml-15實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1.實(shí)驗(yàn)樣品:吸取50uL感受態(tài)細(xì)胞到另一個1.5mlEP管中，加入1uL質(zhì)粒（槍頭輕輕混勻，勿吹打）

2.陰性對照：

DH5α感受態(tài)細(xì)胞50uL冰浴20mins42℃90秒（靜置，勿搖動）迅速放到冰上,冰浴2mins加入950uLLB培養(yǎng)基，標(biāo)明組號，37℃200rpm搖床培養(yǎng)45mins實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1.實(shí)驗(yàn)樣品:吸取50uL感受態(tài)細(xì)胞到16

制備LB瓊脂平板(已完成)

含Ap的LB固體培養(yǎng)基倒平板,每組5個.（編號1,2,3,4,5）不含Ap的LB固體培養(yǎng)基平板。（編號6）涂布

樣品(轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的菌液),涂布于1,2,3,4,5號平板，各100uL。

陰性對照(轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的菌液)100uL：涂布于6號平板。

靜置15mins,倒置平板37℃培養(yǎng)過夜

制備LB瓊脂平板(已完成)17涂布棒的使用

酒精燈的使用使用前，浸入75%酒精中；在酒精燈上引燃涂布棒上的酒精（不要燒到手）；等酒精燒完后，讓涂布棒在空氣中冷卻；涂布均勻；將涂布棒重新除菌以備下一次使用。涂布棒的使用18觀察結(jié)果（明天上午）預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1-4號平板上出若干單菌落，說明？

5號平板上沒有可見菌落，說明？

6號平板上出現(xiàn)大量菌落，說明？計(jì)數(shù)單菌落,計(jì)算轉(zhuǎn)化率.觀察結(jié)果（明天上午）預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果：19如陰性對照中長出菌，可能原因是什么？菌的密度過高或培養(yǎng)時(shí)間過長時(shí)會在陽性菌的周圍長出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是非Amp抗性的，試分析原因。思考題如陰性對照中長出菌，可能原因是什么？思考題20

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

制備及轉(zhuǎn)化

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

制備及轉(zhuǎn)化21實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩苽浜捅４娲竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法掌握轉(zhuǎn)化的方法技術(shù)了解轉(zhuǎn)化過程中各因素對轉(zhuǎn)化率的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩苽浜捅４娲竽c桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法22感受態(tài)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理定義感受態(tài)（Competence)：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)轉(zhuǎn)化（transformation)：異源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程致敏過程:用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作感受態(tài)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理23在生長周期的任何時(shí)刻自動產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.枯草桿菌）在生長周期的特定時(shí)刻產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.大腸桿菌）細(xì)菌產(chǎn)生感受態(tài)的類型在生長周期的任何時(shí)刻自動產(chǎn)生感受態(tài)；（e.g.枯草桿菌）細(xì)24受體菌與質(zhì)粒的選擇

受體菌：

E.ColiDH5α：無Ap抗性外源質(zhì)粒

Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力

選擇:

如進(jìn)行藍(lán)白斑篩選時(shí)可選用DH5α、JM109、TG1；用T7啟動子進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)可選用BL21(DE3)；受體菌與質(zhì)粒的選擇

受體菌：25制備感受態(tài)細(xì)胞方法

原生質(zhì)體法電擊法特殊試劑誘導(dǎo)法：CaCl2誘導(dǎo)法制備感受態(tài)細(xì)胞方法26

+質(zhì)粒DNA420C熱擊復(fù)蘇Amp+細(xì)菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細(xì)胞表面,經(jīng)短時(shí)間420C熱擊處理,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放在非選擇性培養(yǎng)基上保溫一段時(shí)間，使抗氨芐青霉素的表型表達(dá)后再轉(zhuǎn)到含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上，長出來的菌即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌株。+質(zhì)粒DNA420C熱擊復(fù)蘇Amp+細(xì)菌處于00C,CaC27轉(zhuǎn)化率定義及計(jì)算公式：轉(zhuǎn)化子數(shù)/ugDNA=單菌落數(shù)質(zhì)粒濃度(ng/ul)X

1uL2.5ng/uLX10x1000轉(zhuǎn)化率定義及計(jì)算X10x100028影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長狀態(tài)：大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感受態(tài)OD值：0.3－0.5(5X107個/ml)試劑的質(zhì)量：化合物及無機(jī)離子：Rb+、Mn+、二甲亞砜等質(zhì)粒：大小、構(gòu)型外源DNA（質(zhì)粒）與細(xì)胞的比例：器皿的潔凈度污染—盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺中進(jìn)行影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長狀態(tài)：大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感29感受態(tài)細(xì)胞的保存

制備好的感受態(tài)細(xì)胞每100uL分裝一支EP管輕輕混勻----可以用tip頭輕輕攪勻.

4℃保存（不加甘油），可保存一周；加30%甘油，-20℃保存，可保存一月；加30%甘油，80℃保存，可保存六月；感受態(tài)細(xì)胞的保存制備好的感受態(tài)細(xì)胞每100uL分裝一支E30實(shí)驗(yàn)器材搖床分光光度計(jì)冷凍離心機(jī)超凈工作臺恒溫水浴涂布棒恒溫培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)器材搖床31實(shí)驗(yàn)試劑LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基氨芐青霉素0.1MCaCl230%甘油實(shí)驗(yàn)試劑LB液體培養(yǎng)基32實(shí)驗(yàn)流程1、接單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜2、5%（250ul)菌液接種到含5mlLB的試管中，370C振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)，至OD6000.4-0.5（已完成）3、將1.5mL菌液轉(zhuǎn)移到離心管中4、離心5000rpm，40C，5min5、倒出培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)流程1、接單菌落到5mlLB液體培養(yǎng)基中，370C、1336.用冰預(yù)冷的1mL0.1M的CaCl2處理、懸浮細(xì)胞，7.冰上20min8.(取1.5mL)5000rpm離心5min，傾去上清9.100uLCaCl2輕輕懸浮，冰浴大腸桿菌DH5α感受態(tài)的制備6.用冰預(yù)冷的1mL0.1M的CaCl2處理、懸浮細(xì)34實(shí)驗(yàn)流程大腸桿菌DH5α受態(tài)的制備--------1ml-----------20min實(shí)驗(yàn)流程大腸桿菌DH5α受態(tài)的制備--------1ml-35實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1.實(shí)驗(yàn)樣品:吸取50uL感受態(tài)細(xì)胞到另一個1.5mlEP管中，加入1uL質(zhì)粒（槍頭輕輕混勻，勿吹打）

2.陰性對照：

DH5α感受態(tài)細(xì)胞50uL冰浴20mins42℃90秒（靜置，勿搖動）迅速放到冰上,冰浴2mins加入950uLLB培養(yǎng)基，標(biāo)明組號，37℃200rpm搖床培養(yǎng)45mins實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1.實(shí)驗(yàn)樣品:吸取50uL感受態(tài)細(xì)胞到36

制備LB瓊脂平板(已完成)

含Ap的LB固體培養(yǎng)基倒平板,每組5個.（編號1,2,3,4,5）不含Ap的LB固體培養(yǎng)基平板。（編號6）涂布

樣品(轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的菌液),涂布于1,2,3,4,5號平板，各100uL。

陰性對照(轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的菌液)100uL：涂布于6號平板。

靜置15mins,倒置平板37℃培養(yǎng)過夜

制備LB瓊脂平板(已完成)37涂布棒的使用

酒精燈的使用使用前，浸入75%酒精中；在酒精燈上引燃涂布棒上的酒精（不要燒到手）；等酒精燒完后，讓涂布棒