酶組織化學(xué)應(yīng)用1127課件

酶組織化學(xué)的應(yīng)用酶組織化學(xué)基本反應(yīng)原理酶作用底物+相關(guān)化學(xué)試劑反應(yīng)產(chǎn)物沉淀↓（有色）酶（孵育液內(nèi)）（組織細(xì)胞內(nèi)）（鏡下觀察）顯示酶的組織化學(xué)方法1.金屬沉淀法：磷酸酶的顯示

甘油磷酸鈉磷酸酯+鉛磷酸鉛硫化鉛2.偶氮偶聯(lián)法：顯示各種酶類(lèi)最重要的方法3.電子傳遞法：氧化酶和脫氫酶的顯示

酸性磷酸酶底物酶初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物（PRP）重氮鹽

最終反應(yīng)產(chǎn)物（FRP）（一）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）分布：廣泛存在于機(jī)體組織，常見(jiàn)于具有活躍轉(zhuǎn)運(yùn)功能的細(xì)胞膜內(nèi)，如毛細(xì)血管及毛細(xì)血管動(dòng)脈部分的內(nèi)皮細(xì)胞，腎近曲小管刷狀緣和腸上皮紋狀緣;

應(yīng)用：1.肝臟病、白血病的研究診斷;2.骨的發(fā)生和代謝疾病;顯示堿性磷酸酶的常用方法:1.鈣鈷法(Gomori-Takamatsu法)【基本原理】甘油磷酸鈉磷酸酯+Ca++磷酸鈣磷酸鈷硫化鈷【孵育液】孵育液的成分：3%β-甘油磷酸鈉10ml2%巴比妥鈉10ml2%CaCl220ml5%MgSO41ml雙蒸水5mlAKP顯示堿性磷酸酶的常用方法:1.

鈣鈷法(Gomori-Takamatsu法)【操作步驟】

1.新鮮組織低溫冰凍切片2.不固定切片直接進(jìn)作用液,或用1%氯化鈣固定5分鐘-2小時(shí),4℃,蒸餾水洗3.作用液10-60分鐘,37℃4.蒸餾水洗5.2%硝酸鈷1分鐘6.蒸餾水洗顯示堿性磷酸酶的常用方法:1.

鈣鈷法(Gomori-Takamatsu法)【操作步驟】

7.1~2%硫化銨1分鐘8.蒸餾水洗9.甘油明膠封片,或脫水,透明,中性樹(shù)膠封片【結(jié)果】堿性磷酸酶活性處有黑色的硫化鈷沉淀腎曲管堿性磷酸酶---鈣鈷法X2002.偶氮偶聯(lián)法⑵六偶氮對(duì)品紅與α-萘酚偶聯(lián)---以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯與六偶氮對(duì)品紅偶聯(lián)【孵育液】萘酚AS-BI磷酸鈉,二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO),Tris-cl或巴比妥醋酸緩沖液,六偶氮對(duì)品紅【操作步驟】

1.小塊組織液氮驟冷,低溫冰箱切片2.甲醛鈣液(Fca)固定5分鐘,4℃,然后蒸餾水洗,也可不固定(二)酸性磷酸酶(acidphosphatase,ACP)

在酸性條件下催化醇和酚類(lèi)磷酸酯的水解最適PH為4.8-5.2

抑制劑因組織差異而不同:酒石酸,氟化物,0.5%甲醛分布:主要位于溶酶體內(nèi)

應(yīng)用:

前列腺癌和其他臟器的轉(zhuǎn)移性前列腺癌(+++)

Hodgins淋巴,胃癌,肺癌,乳腺癌等(+++)

尤文氏瘤,成骨肉瘤等(-)顯示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸鉛法【基本原理】與堿性磷酸酶鈣鈷法的原理相似甘油磷酸鈉磷酸酯+鉛磷酸鉛硫化鉛（黑色）【孵育液】硝酸鉛,巴比妥-硝酸鹽緩沖液，β-甘油磷酸鈉【結(jié)果】酸性磷酸酶活性處呈棕黑色ACP顯示酸性磷酸酶的常用方法2.同時(shí)偶聯(lián)法【基本原理】ACP在酸性條件下水解萘酚AS-TR磷酸酯為萘酚AS-TR和磷酸,萘酚AS-TR和六偶氮對(duì)品紅偶聯(lián),在酶活性處形成紅色的不溶性復(fù)合物【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯,六偶氮對(duì)品紅【操作步驟】1.新鮮組織低溫冰箱切片2.不固定或吹干后丙酮固定15分鐘3.用孵育液置于37℃水浴箱1~2小時(shí)4.流水洗,晾干(1-2分鐘)5.用Mayer蘇木精或1%甲基綠復(fù)染6.流水洗10分鐘7.常規(guī)脫水透明,中性樹(shù)膠封片【結(jié)果】酸性磷酸酶活性處呈桔紅色,胞核蘭色(蘇木精復(fù)染)或綠色(甲基綠復(fù)染)涂片-腹腔巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶X4005′核苷酸酶存在于胞膜，為胞膜的標(biāo)志酶5′核苷酸酶的顯示----鉛法【基本原理】5′N(xiāo)ase水解底物5′單磷酸腺苷AMP

磷酸+鉛磷酸鉛硫化鉛（黑色）【注意】5′核苷酸酶在作用上和堿性磷酸酶相似

5′N(xiāo)aseAKP1.腎組織中分布腎小管刷狀緣(+),所有僅腎小管刷狀緣(+)

基膜也(+)2.β-甘油磷酸鈉(—)(+)5′N(xiāo)ase作為底物(四)葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-p-酶)

肝細(xì)胞特有的功能性酶,分解糖原,維持血糖濃度,是糖代謝的關(guān)鍵酶

PH6時(shí)活性最強(qiáng),PH8時(shí)最穩(wěn)定,PH5時(shí)易變性抑制劑:氟化物,鋅和氰離子酒精固定,石蠟包埋后,G6p酶被完全抑制;經(jīng)甲醛固定而失活硝酸鉛法顯示G6p酶:葡萄糖-6-p葡萄糖+磷酸磷酸鉛硫化鉛G6p酶2.膜性腺苷三磷酸酶

又稱(chēng)鈉-鉀離子激活腺苷三磷酸酶最適PH7.2-7.5

激活劑:Mg++,Na+,K+

抑制劑:Ca++,

苦毒毛旋花子甙常存在于細(xì)胞膜,特別是分泌功能活躍的細(xì)胞膜。3.線粒體腺苷三磷酸酶

心肌最豐富,肝臟次之心肌的線粒體ATP酶被Mg++激活，而被Ca++抑制肝細(xì)胞線粒體ATP酶可同時(shí)被Mg++、Ca++激活心肌和肝的線粒體ATP酶均可被對(duì)-氯汞苯甲酸（PCMB）抑制（六）非特異性酯酶酯酶可分為三類(lèi)——非特異性酯酶、脂酶、膽堿酯酶非特異性酯酶---水解短鏈脂肪酸的酯脂酶---水解長(zhǎng)鏈脂肪酸的酯膽堿酯酶---水解膽堿的酯酶

非特異性酯酶最適PH5.0-8.0

定位在溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在肝、腎、胰和小腸具有較高的酶活性

應(yīng)用----單核巨噬細(xì)胞、T淋巴、中性粒細(xì)胞都有非特異性酯酶反應(yīng)

1.在急性白血病分類(lèi)診斷時(shí)，非特異性酯酶含量多少、有無(wú)顆粒及顆粒大小，都有一定的診斷價(jià)值

2.可作為T(mén)、B淋巴細(xì)胞的鑒別顯示非特異性酯酶法---同時(shí)偶聯(lián)法

用乙酸-α-萘酯或萘酚AS衍生物為底物，在酶作用下，釋出α-萘酚，與固藍(lán)B或六偶氮對(duì)品紅偶聯(lián)，生成紫黑色或紅棕色不溶的偶氮染料（七）膽堿酯酶

乙酰膽堿酯酶---神經(jīng)組織、肌肉、紅細(xì)胞中

膽堿酯酶---血漿中含量豐富

顯示乙酰膽堿酯酶的方法—Karnovsky-Rotts亞鐵氰化銅法【基本原理】

碘化乙酰硫化膽堿硫代膽堿+乙酸

鐵氰化鉀亞鐵氰化鉀

亞鐵氰化銅沉淀

乙酰膽堿酯酶（-SH）Cu++（一）脫氫酶

脫氫酶的顯示：底物為脫氫酶氧化，從底物釋放出氫，經(jīng)氫傳遞系統(tǒng)，使受氫體還原而顯色常以四唑鹽和鐵氰化鉀作為受氫體

組化示脫氫酶分為不需輔酶和必需輔酶二種1.瑚珀酸脫氫酶（SDH）

SDH是屬于琥珀酸氧化酶系統(tǒng)的酶。不需輔酶的存在

SDH存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，以心肌、腎曲管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞含量最豐富，和線粒體膜牢固結(jié)合

最適PH7【顯示方法】Pearson二甲亞砜法【基本原理】琥珀酸鹽+受氫體（四唑鹽）富馬酸+還原的受氫體

（無(wú)色）（藍(lán)色沉淀）【作用液】0.1M琥珀酸鈉,0.1M磷酸鹽緩沖液PH7.6NBT(硝基藍(lán)四唑),二甲亞砜(DMSO)【步驟】

1.新鮮組織低溫冰凍切片2.作用液15~35分鐘3.生理鹽水洗4.Fca(氯化鈣Formalin)固定10分鐘5.入80%乙醇5分鐘6.甘油明膠封固或脫水、透明、中性樹(shù)膠封片【結(jié)果】酶活性處為藍(lán)紫色沉淀小鼠心肌冰凍切片-琥珀酸脫氫酶X4002.乳酸脫氫酶（LDH）

需輔酶的脫氫酶廣泛分布的可溶性酶，為糖原分解的酶系最適PH7.4

肝、骨骼肌的酶活性高于心肌【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互變反應(yīng)

乳酸鹽+NAD丙酮酸鹽+（NADH+H+）

LDH（輔酶Ⅰ）（還原型輔酶Ⅰ）（二）過(guò)氧化物酶

催化各種物質(zhì)被過(guò)氧化氫（H2O2）所氧化見(jiàn)于乳腺、甲狀腺、唾液腺、肥大細(xì)胞等髓過(guò)氧化物酶見(jiàn)于中性和嗜酸性