文獻(xiàn)閱讀總結(jié)課件

免疫磁珠富集凈化-超高效液相色譜法同時測定陳皮中4種黃曲霉毒素化學(xué)工程與技術(shù)文獻(xiàn)信息DOI：10.3724/SP.J.1123.2015.06001作者：邢言言，佟玲，陳楠，于治國，趙云麗

作者單位：沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽,110016天士力控股集團(tuán)研究院藥物分析所,天津,300402刊名：色譜Journal：ChineseJournalofChromatography年，卷(期)：2015,(12)分類號：O658關(guān)鍵詞：免疫磁珠，超高效液相色譜法，黃曲霉毒素，陳皮Keywords：immunomagneticbeads(IMBs)，ultraperformanceliquidchromatography(UPLC)，aflatoxins(AFs)，Citrusreticulatablanco摘要：將ＰｒｏｔＥｌｕｔＮＨＳ（Ｎ-羥基丁二酰亞胺）偶聯(lián)磁珠與抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體偶聯(lián)得到黃曲霉毒素總量免疫磁珠，其具有較好的分散性，良好的磁性能和特異的選擇性。背景黃曲霉毒素（ＡＦｓ）是由黃曲霉和寄生曲霉在繁殖過程中產(chǎn)生的一類分子結(jié)構(gòu)相似的次級代謝產(chǎn)物，被世界衛(wèi)生組織（ＷＨＯ）的癌癥研究機(jī)構(gòu)（ＩＡＲＣ）劃定為Ⅰ類致癌物。黃曲霉毒素毒性比砒霜大68倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥的毒性次級代謝產(chǎn)物是指生物生長到一定階段后通過次級代謝合成的分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對該生物無明顯生理功能，或并非是該生物生長和繁殖所必需的小分子物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。致癌物的等級可分為第一級(Group1)致癌物、第二級A類(Group2A)致癌物、第二級B類(Group2B)致癌物、第三級(Group3)致癌物三個級別。黃曲霉毒素屬于第一級致癌物黃曲霉素、砒霜、石棉、六價鉻、二惡英、甲醛、酒精飲料、煙草、檳榔等丙烯酰胺、無機(jī)鉛化合物、氯霉素等。氯仿、DDT、敵敵畏、萘衛(wèi)生球、鎳金屬、硝基苯、柴油燃料、汽油等。苯胺、蘇丹紅、咖啡因、二甲苯、糖精及其鹽、安定、氧化鐵、有機(jī)鉛化合物、靜電磁場、三聚氰胺、汞與其無機(jī)化合物等。黃曲霉毒素的產(chǎn)生：目前報道的ＡＦｓ有20多種，中藥材在采收、貯存、加工和炮制過程中處理不當(dāng)易被ＡＦｓ污染，較常見的有黃曲霉毒素Ｂ1（ＡＦＢ1）、黃曲霉毒素Ｂ2（ＡＦＢ2）、黃曲霉毒素Ｇ1（ＡＦＧ1）、黃曲霉毒素Ｇ2（ＡＦＧ2），其中ＡＦＢ1

的毒性最強(qiáng)。黃曲霉素是黃曲霉菌屬黃曲霉菌、寄生曲霉菌產(chǎn)生的代謝物，劇毒，同時還有致癌、致畸、致突變的作用，主要引起肝癌，還可以誘發(fā)骨癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等。有些食品由于存放不當(dāng)會發(fā)生霉變，凡是霉變的食品都有可能存在黃曲霉素。黃曲霉素易在糧食、油類及其制品和堅果上生長，如花生、棉籽等，干果類中的核桃、杏仁、榛子，奶制品、干咸魚、海米、干辣椒、干蘿卜條等，其中花生及其制品黃曲霉素的含量最高。黃曲霉毒素的檢測過程陳皮樣品樣品預(yù)處理

UPLC檢測文中采用免疫磁珠分離技術(shù)，要先用樣品與磁性顆粒結(jié)合熒光檢測器免疫磁珠分離技術(shù)免疫磁珠分離技術(shù)是20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來的一項與磁載體結(jié)合的免疫學(xué)技術(shù)，它同時具備了免疫學(xué)反應(yīng)的高度專一性以及固相化試劑所特有的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于分離及濃縮特定細(xì)胞、微生物、蛋白質(zhì)和核酸片段等肉眼難以觀察或樣品中含量不高的物質(zhì)。AFs的檢測方法酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、熒光分光光度計法、ＨＰＬＣ法、ＵＰＬＣ法及ＬＣ-ＭＳ聯(lián)用法等。酶聯(lián)免疫法適用于ＡＦｓ的快速篩查，但重復(fù)性差，假陽性出現(xiàn)率較高；薄層色譜法由于靈敏度低及重復(fù)性差，目前應(yīng)用較少；ＨＰＬＣ法是目前應(yīng)用最多的定量檢測方法，但由于ＡＦＢ1

和ＡＦＧ1與水接觸后會產(chǎn)生熒光淬滅現(xiàn)象，原有較強(qiáng)的熒光特性基本消失，分析時一般需要柱前或柱后衍生，檢測步驟增加，造成分析速度較慢，耗費(fèi)有機(jī)溶劑較多，費(fèi)時費(fèi)力。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，簡稱酶聯(lián)免疫法。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測。熒光物質(zhì)分子與溶劑分子之間作用引起熒光物質(zhì)發(fā)生熒光熄滅，而發(fā)生吸光度的改變。ＬＣ-ＭＳ聯(lián)用法能夠同時進(jìn)行定性和定量分析，能有效排除假陽性結(jié)果，但儀器昂貴，不易推廣。ＵＰＬＣ法借助于ＨＰＬＣ法的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)。ＵＰＬＣ與傳統(tǒng)的ＨＰＬＣ法相比，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量，降低了分析成本。檢測器文中選用的熒光檢測器使用了汞／氙燈，而汞在365ｎｍ下發(fā)射強(qiáng)度比氙燈高10倍。這種超強(qiáng)的發(fā)射強(qiáng)度實現(xiàn)了ＡＦＢ1

和ＡＦＧ1

在不衍生的情況下依然保持較強(qiáng)的信號。加上小容量熒光檢測池的高靈敏度，省去了衍生的步驟，大大縮短了檢出周期，提高了檢測速度和重復(fù)性。實驗部分儀器與試劑超高效液相色譜儀（美國Ｗａｔｅｒｓ公司）；熒光檢測器（美國Ｗａｔｅｒｓ公司）；超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（天美科學(xué)儀器有限公司）；多功能渦旋混合器（美國ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ公司）；型掃描電子顯微鏡（日本Ｈｉｔａｃｈｉ公司）；傅里葉紅外光譜儀（美國Ｎｉｃｏｌｅｔ公司）；

超微量分光光度計（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）。黃曲霉毒素Ｂ1、Ｂ2、Ｇ1、Ｇ2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體，AFT；ＰｒｏｔＥｌｕｔＮＨＳ（Ｎ-羥基丁二酰亞胺）偶聯(lián)磁珠；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）；考馬斯亮藍(lán)Ｇ-250染料試劑；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。實驗用水超純水。NaCl20%甲醇-PBS精密取3ml磁鐵甲醇PBS溶液純甲醇ＮＨＳ磁珠與ＡＦＴ的偶聯(lián)ＮＨＳ磁珠外表面的ＮＨＳ基團(tuán)與ＡＦＴ的伯氨基團(tuán)反應(yīng)，形成Ｃ-Ｎ共價鍵，實現(xiàn)ＡＦＴ與磁珠的共價偶聯(lián)。利用此原理，本實驗成功將ＡＦＴ偶聯(lián)到ＮＨＳ磁珠表面。采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量法測定抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體和ＮＨＳ磁珠的偶聯(lián)效率（以ＢＳＡ為標(biāo)準(zhǔn)物繪制Ｂｒａｄｆｏｒｄ標(biāo)準(zhǔn)曲線），平均偶聯(lián)率為99％，由此說明1ｍｇＡＦＴ基本全部被60ｍｇＰｒｏｔＥｌｕｔＮＨＳ磁珠偶聯(lián)?？捡R斯亮蘭（Bradford法），考馬斯亮蘭在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。免疫磁珠的使用量免疫磁珠富集凈化樣品時，吸附是關(guān)鍵步驟，為更好地控制免疫磁珠對ＡＦｓ的吸附量，本文對免疫磁珠的使用量進(jìn)行了優(yōu)化。免疫磁珠富集凈化的時間在ｐＨ7.4及室溫條件下，考察了不同富集吸附時間下免疫磁珠對4種ＡＦｓ的富集凈化效果。免疫磁珠的洗脫體積與洗脫時間為了確定洗脫液甲醇對免疫磁珠的洗脫體積與洗脫時間，分別使用400、800、1000、1200μＬ甲醇對免疫磁珠進(jìn)行洗脫。色譜條件的優(yōu)化文中采用不同比例的甲醇-水系統(tǒng)等度和梯度洗脫分離陳皮樣品中的4種ＡＦｓ對陳皮樣品中4種ＡＦｓ的分離情況。ａ．ｍｉｘｅｄｓｔａｎｄａｒｄｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＦＢ1

：2ｎｇ／ｍＬ；ＡＦＢ2

：0.6ｎｇ／ｍＬ；ＡＦＧ1

：2ｎｇ／ｍＬ；ＡＦＧ2

：0.6ｎｇ／ｍＬ）；ｂ．ＣｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔａｂｌａｎｃｏｓｐｉｋｅｄｗｉｔｈＡＦｓ（ａｓ2μｇ／ｋｇｏｆＡＦＢ1

）；ｃ．ｂｌａｎｋＣｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔａｂｌａｎｃｏｓａｍｐｌｅ．方法學(xué)考察專屬性線性范圍和相關(guān)系數(shù)檢出限和定量限儀器精密度穩(wěn)定性加標(biāo)回收率和重復(fù)性4種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（ｎ=6）4種黃曲霉毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（ｒ2

）、檢出限和定量限樣品測定采用本文建立的方法分別測定6批陳皮樣品，均未檢出黃曲霉毒素。為了排除假陰性結(jié)果，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對該6批陳皮樣品進(jìn)行結(jié)果復(fù)核實驗。結(jié)果表明6批陳皮樣品均不含4種ＡＦｓ。同時也證明了本文建立的方