gfp基因的克隆與表達(dá)

頁腳頁腳基因工程實(shí)驗設(shè)計題目：綠色熒光蛋白基因(gfp)的克隆及表達(dá)專業(yè)：生工1001：會淼2013年3月13實(shí)驗?zāi)康模貉芯烤G色熒光蛋白(6丫664FluorescentProtein,GFP)基因的基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)。實(shí)驗方法；通過分別將DH-5a(pEGFP-N3)和DH-5a(pET-28a)提取質(zhì)粒、酶切并連接形成重組質(zhì)粒pET-28a-GFP,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliDH-5a感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過限制性核酸切酶NotI與BamH1和PCR對所建質(zhì)粒進(jìn)行分析鑒定后，通過轉(zhuǎn)化的方法把含綠色熒光蛋白(GFP)外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體：31-21進(jìn)行表達(dá)，再用IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)，如果可以看到顯現(xiàn)綠色，判斷GFP基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。材料與方法：實(shí)驗材料克隆菌E.coliDH-5a、表達(dá)菌BL-21為本實(shí)驗室收藏菌種，質(zhì)粒pET-28a和pEGFP-N3,引物，限制性切酶BamH1、NotI儀器設(shè)備￡「「694?！觌x心機(jī)、電泳儀、電子天平、臺式離心機(jī)、控溫磁力攪拌器、調(diào)溫電熱套pH計、冰箱、臺式冷凍恒溫振蕩器、紫外燈、生物潔凈工作臺、電熱恒溫水溫箱、瓊脂糖凝膠電泳電泳裝置、凝膠成像分析系統(tǒng)、酒精燈、培養(yǎng)皿、、移液槍、槍頭、接種環(huán)、酒精棉球、滅菌槍頭、平板封口膜、離心管試劑及溶液分裝后于121℃高壓滅菌20min。(LB固體培養(yǎng)基是在液體LB中加瓊脂粉至1%)；溶液I50mL葡萄糖50mmol/LTris-Cl(pH8.0)25mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/L121℃高壓滅菌15min后置于0?4℃貯存；溶液H100mLNaOH0.2mol/LNaOHSDS1%(W/V)SDS用時由母液2mol/LNaOH、10%(W/V)SDS稀釋現(xiàn)配；溶液m100mLTOC\o"1-5"\h\zKOAc(5mol/L)60mL冰乙酸11.5mLHO28.5mL2121℃高壓滅菌15min后置于0?4℃貯存；氯仿；瓊脂糖；滅菌的去離子水；10義酶切緩沖液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶緩沖。滅菌的0.1mol/LCaCl2標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量的DNA；溴乙錠(EB)儲存液0.5^g/mL；LB/Kan(50Rg/mL)固體培養(yǎng)基；IPTG配成濃度為400mM水溶液，-20℃保存?zhèn)溆?；卡那霉?Kan)配成濃度為100ug/mL水溶液，-20℃保存?zhèn)溆茫?0%乙醇：用新開裝的乙醇和滅菌無離子水配成，放在0~4℃；無水乙醇：放在0~4℃；RNase母液：將RNase溶于10mmol/LTris?Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl配成的試劑中，配成10mg/mL的溶液，在100℃加熱15min,使可能溶有的DNase失活，然后緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于一20℃；1.2方法：大腸桿菌DH-5a(pEGFP-N3)染色體DNA的提取、實(shí)驗?zāi)康模赫莆辗勇确路ㄌ崛NA的原理和操作。,器材：⑴，微量移液器、高速離心機(jī)、1.5mlEP管、吸頭、烘箱、水浴鍋、1.5ml管架、膠頭滴管、冰箱⑵)，消化緩沖液：CTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O,緩慢加入10gCTAB,加水至100ml；其它試劑：氯仿：異戊醇(24:1),酚:氯仿：異戊醇(25:24:1),異丙醇，70%乙醇，TE,10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml或粉劑)，5mol/LNaCl。實(shí)驗原理生物的大部分或幾乎全部DNA都集中在細(xì)胞核或類核中。DNA在體通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)對DNA制品的污染常影響到以后的DNA操作過程，因此需把蛋白質(zhì)除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿對蛋白質(zhì)有極強(qiáng)的變性作用，而對DNA無影響。經(jīng)苯酚、氯仿抽提后，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚相與水相的界面，DNA則留在水相，少量的或與DNA緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA無影響，必要時可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。、實(shí)驗步驟1.100ml細(xì)菌過夜培養(yǎng)液，5000rpm離心10分鐘，去上清液。加9.5mlTE懸浮沉淀，并加0.5ml10%SDS,50ul20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混勻,37℃保溫1小時。加1.5ml5mol/LNaCl,混勻。加1.5mlCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃保溫20分鐘。用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm離心10分鐘,將上清液移至干凈離心管。用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干凈管中。7、加1/10體積3mol/LNaAc,及2.5倍體積預(yù)冷(-20℃)無水乙醇，混勻。-20℃沉淀30皿血。12000rpm15min,棄上清8、加70%乙醇1ml,輕輕混勻，12000rpm15min,棄上清。9、EP管放置于烘箱中烘干。10、加30ulTE或ddH2O溶解DNA。11、瓊脂糖凝膠電泳檢測注意，實(shí)驗室中一般用的1.5ml的EP管，可根據(jù)自己需要按比例調(diào)節(jié)加樣量。DH-5a(pET-28a)的載體質(zhì)粒也可根據(jù)同樣方法提取。PCR擴(kuò)增實(shí)驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)PCR擴(kuò)增的基本原理。2、掌握PCR技術(shù)的常規(guī)操作。3、了解「。區(qū)擴(kuò)增的參數(shù)設(shè)計。實(shí)驗原理1、聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)：利用核酸變、復(fù)性的性質(zhì)，以待擴(kuò)增的DNA為模板，在體外由引物介導(dǎo)的酶促合成特異DNA片段的過程。2、PCR反應(yīng)體系引物、dNTP、Mg2+、模板、TaqDNA聚合酶，Buffer。3、PCR循環(huán)參數(shù)95℃5min95℃30s52℃30s72℃30sgoto②29times72℃10min器材1,微量移液取樣器，移液器吸頭，0.2mlPCR微量離心管，PCR儀，臺式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng),紫外凝膠成像系統(tǒng)2,TaqDNA聚合酶，PCR緩沖液，MgCl2,dNTP,引物，模板，ddH2O,TBE電泳緩沖液，EB,加樣緩沖液3,引物：1.3.5實(shí)驗步驟1、在0.2mlPCR微量離心管中配制30ul反應(yīng)體系。ddwater10.5ulTOC\o"1-5"\h\z10XPCRbuffer（不含MgCl2）3ul25mMMgCl22ul10mmol/LdNTP1ul10umol/L引物11ul10umol/L引物21ul模板1ulTaq酶0.5ul總體積20ul2、在離心機(jī)中混勻。3、EP管放入「。區(qū)儀中，按照原理中的條件設(shè)置程序，進(jìn)行「。區(qū)反應(yīng)。4、PCR結(jié)束后，取3ulPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測1.4凝膠電泳法回收目的DNA及其體外連接實(shí)驗?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法。.掌握DNA體外連接的方法。1.4.2，實(shí)驗原理,DNA分子在瓊脂糖凝膠中的電泳速率與以下因素有關(guān)：DNA分子大小DNA分子構(gòu)象瓊脂糖凝膠濃度電泳所用電壓電泳緩沖液.利用硅膠膜在高鹽濃度時能特異性吸附DNA,而在低鹽濃度時可使DNA被洗脫的原理純化DNA。.Taq酶參與PCR反應(yīng)中，產(chǎn)物雙鏈核酸中的3'端各多連接一個脫氧腺苷酸A,與商業(yè)開發(fā)的pMD18-T載體可在DNA連接酶作用下，按照堿基配對形成環(huán)狀的完整質(zhì)粒。1.4.3,儀器1,凝膠電泳系統(tǒng)，刀片，紫外儀，酒精燈，1.5mlEP管，1.5mlEP管架，65℃水浴鍋2,PCR產(chǎn)物，1XTBE,加樣緩沖液，TakaRa膠回收試劑盒，TA克隆試劑盒，DL2000marker1.4.4,實(shí)驗步驟1,2%瓊脂糖凝膠電泳2,在紫外燈下用干凈的手術(shù)刀割下含有目的DNA瓊脂糖塊裝在1.5ml的EP管中稱量減1克即為凝膠塊重量3,加入5個凝膠體積量的DR-IBuffer4,混勻65℃加熱融化凝膠塊5,加入DR-IBuffer量的1/2體積的DRTIBuffer,當(dāng)目的片段小于400bp再加入終濃度為20%的異丙醇6,將上述溶液short后轉(zhuǎn)移至spincoloumn中12000rpm,1min棄濾液7,加入500由RinseA12000rpm30s棄濾液8,加入700由RinseB12000rpm30s棄濾液9,同810,將spincoloumn安置于新的1.5mlEP管中在spincoloumn膜中央加25ulElutionBuffer放入烘箱1min12000rpm1min保存1.5mlEP管1%膠檢測11,反應(yīng)（冰上操作）在一支0.2mlEP管中加入以下試劑：TOC\o"1-5"\h\z純化的目的DNA片段4.5ulVector0.5ul連接液5ul混勻16℃連接過夜1.5DH-5a和BL-21感受態(tài)細(xì)胞的制備1）將0?4℃保存的DH—5a和BL-21菌種分別接種在LB液體培養(yǎng)基中37℃下250r/min過夜培養(yǎng)16h。2）將分別接種過夜菌:LB按1:50的比例接種于2mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃活化培養(yǎng)2?3h至OD=0.3?0.5。取1.5mL菌液轉(zhuǎn)入EP管中，置于冰上10min,然后于4℃下5000丫小訕離心5min。棄上清液，沉淀加入0.1mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2緩和懸菌。冰上放置15-30min后,4℃下5000丫小訕離心10min。棄上清液，沉淀用0.1mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）緩和懸菌，放在一20℃冰箱保存。1.6感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1）取制備好的感受態(tài)細(xì)胞100以1，冰上解凍，均勻懸浮。加入2ul酶連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置10-30min。42℃水浴中熱擊70sec后，冰上放置2min。加入200ulLB液體培養(yǎng)基，37℃，50-100^皿振蕩培養(yǎng)1h。取200ul懸浮細(xì)胞涂布在含合適抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置1-2h后，封口膜封好平皿，37℃培養(yǎng)倒置12-16h。1.7堿法提質(zhì)粒1）用滅菌吸頭挑取單菌落，浸沒于2mL含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃,180r/min振蕩培養(yǎng)過夜。2）取1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃、11000r/min離心1分鐘，吸棄上清。3）向離心管中加入150用冰預(yù)冷的溶液I，用微量移液器吹打重懸沉淀。4）加入200新配制的溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，冰上放置5分鐘。5）加入150懼用冰預(yù)冷的溶液111，輕輕混勻，冰上放置3?5分鐘。6）用微量離心機(jī)于4℃、11000r/min離心5分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。7）加等體積氯仿400懼抽提，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4℃>11000中皿離心2分鐘,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8）吸取上清液300M，向上清中加入2倍體積的無水乙醇，混勻后，于室溫放置2分鐘;用微量離心機(jī)于4℃、11000^皿離心5分鐘，棄上清。9）用70%乙醇洗滌2次，再次4℃、11000^皿離心5分鐘，沉淀于空氣中干燥。向已干燥的離心管加20以超純水溶解質(zhì)粒DNA,加入2必10mg/mlRNA酶，37℃處理1小時后于-20℃貯存。1.8酶切鑒定1）取提取的質(zhì)粒8于另一微量離心管中，加入2BamHI和NotI的酶切混合液，輕彈管外混勻反應(yīng)物。離心，使溶液聚集在管底部。37℃，酶切反應(yīng)。1.9瓊脂糖凝膠電泳1）稱取0.8g瓊脂糖，放入到錐形瓶中，加入100mL1義1慶￡緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全融化，冷卻至60℃左右。輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上。將膠板除去封膠帶，加電泳緩沖液至電泳槽中，加液量要使液面沒過膠面1-1.5毫米，輕輕拔除梳子。4）吸取10必的質(zhì)粒與2懼的上樣液混勻，吸取混合液將加入加樣孔。5）接通電泳槽與電泳儀的電源，設(shè)置電泳數(shù)據(jù)U=100V,I=30mA。6）當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。7）在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。2.0PCR—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1）將PCR管放置在冰盒上，按如下表格加入PCR反應(yīng)體系各成分PCR反應(yīng)體系各成分的量模板DNA0.1^1P1(20mM)0.2P2(20mM)0.2dNTPs(10mM)0.4Taq酶(5U/^1)0.2^110XPCRbuffer2ddHO16.9懼2Total20^l將PCR管放入PCR儀中，設(shè)定PCR儀的循環(huán)參數(shù)。預(yù)變性95℃3min,變性95℃30s,退火60-55℃30s，延伸72℃1min10個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5℃。變性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min20個循環(huán)，72℃延伸2min。PCR擴(kuò)增完畢后，取出PCP管放在冰盒上。4)取8擴(kuò)增后產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。1pET-28a-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL—211)取100Rl感受態(tài)BL-21,冰上慢速解凍，均勻懸浮。加入2Dl經(jīng)過酶切鑒定成功提取重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，輕輕混勻，冰上靜置10-30min。42℃水浴熱激70s，冰上放置2min。加入200Rl含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，60丫加訕震蕩培養(yǎng)30min。四支EP管中加入0.5Rl的100mM的IPTG誘導(dǎo)，另外E