GST酶親和層析及SDS-PAGE課件

工程菌中GST酶的親和層析分離

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS）鑒定蛋白質(zhì)分離純化綜合實(shí)驗(yàn)工程菌中GST酶的親和層析分離

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1Contents1.蛋白質(zhì)分離純化2.蛋白質(zhì)的鑒定分析Contents1.蛋白質(zhì)分離純化2.蛋白質(zhì)的鑒定分析根據(jù)蛋白分子特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。

性質(zhì)

方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)吸附層析(羥基磷灰石層析、疏水作用層析)對配體分子親和層析的生物親和力蛋白質(zhì)分離純化的方法根據(jù)蛋白分子特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來等電點(diǎn)沉淀法聚乙二醇沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法熱變性沉淀法蛋白質(zhì)分離純化1．電泳法2．層析法3．沉淀法4．透析、超濾5、離心6、結(jié)晶等電點(diǎn)沉淀法聚乙二醇沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法熱變性沉淀法蛋主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。一、粗分級分離主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白（1）鹽析(Salting-out)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[(NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl等]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。常用的鹽析劑是硫酸銨，其鹽析能力強(qiáng)，水中溶解度大，濃度高時(shí)也不會(huì)引起蛋白質(zhì)活性喪失。鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。（1）鹽析(Salting-out)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的GST酶親和層析及SDS課件蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。脫鹽常選用透析法或凝膠過濾。

透析是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水(緩沖液)中進(jìn)行，可不斷更換蒸餾水，直至雜質(zhì)被除去。透析袋蛋白質(zhì)溶液蒸餾水（2）透析(Dialysis)蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。脫鹽（3）等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。（3）等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有(4)有機(jī)溶劑法與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有二：降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。室溫下，有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性?？稍诓粩鄶嚢柘聦㈩A(yù)冷的有機(jī)溶劑逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，則在很大程度上解決變性問題。不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分離不同蛋白質(zhì)。(4)有機(jī)溶劑法與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能二、細(xì)分級分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用柱層析方法：分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。常用電泳方法：PAGE、等電聚焦電泳(IEF)。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。二、細(xì)分級分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部細(xì)菌中外源GST酶的分離純化及鑒定1、細(xì)菌中外源GST蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(IPTG誘導(dǎo))2、細(xì)菌的裂解（溶菌酶法）3、Glu-Aragrosebeads親和層析分離GST蛋白4、GST蛋白的SDS純度鑒定綜合實(shí)驗(yàn)細(xì)菌中外源GST酶的分離純化及鑒定綜合實(shí)驗(yàn)親和層析的原理親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對互配的。主要的有：酶和底物、酶與競爭性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。親和層析的原理親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液中的另一方分子進(jìn)行親和層析，達(dá)到分離純化目的。例如，酶與其輔酶是成對互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化。在親和層析中，作為固定相的一方稱為配基(ligand)。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(matrix)(又稱載體或擔(dān)體)上，常用的載體主要有：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素等。當(dāng)用小分子作為配基時(shí)，由于空間位阻不易與載體偶聯(lián)，或不易與配對分子載體結(jié)合。為此通常在載體和配基之間接入不同長度的連接臂(spacearm)。在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液Affinitychromatography

親和層析SolidMatrixligandAffinitychromatography親和層析So親和層析法分離生物大分子示意圖配基待分離的生物分子a.載體手臂配基親和吸附劑b.親和層析法分離生物大分子示意圖配基d.與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì)

d.與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì)

親和層析的示意圖親和層析的示意圖GST酶的親和層析GSH-Agarosebeads

原理谷胱甘肽(Glutathione，GSH)與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(

GSH-S-transferase)之間具有特異性的作用力。將混合菌體蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠（G-Agarosebeads）孵育，凝膠手臂上的GSH可以與GST蛋白特異性結(jié)合，通過洗脫除去不能與珠結(jié)合的雜蛋白而獲得瓊脂糖珠結(jié)合的GST純蛋白。進(jìn)一步使用還原型谷胱甘肽(GSH)洗脫時(shí)，將競爭GST上的結(jié)合位點(diǎn)而將GST蛋白洗脫下來，從而獲得純化的GST酶的純品。GST酶的親和層析GSH-Agarosebeads操作步驟一、細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)⑴取一支凍存的B菌，無菌條件下解凍后取20μl放入20ml含氨芐青霉素（Amp，100ug/ml）的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜。⑵取培養(yǎng)12~14h后的小量培養(yǎng)菌液2ml放入250ml含Amp的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)3~5h后至OD600為0.6~0.8，加入1MIPTG250μl誘導(dǎo)培養(yǎng)3~6h后，收集菌液。⑶將菌液每3-4ml/管收集在Ep管中，離心后棄上清。操作步驟一、細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)二、GST酶純化⑴在含細(xì)菌沉淀的Ep管中加入500μl的裂解液懸浮細(xì)菌，再加入50μl溶菌酶溶液，反復(fù)在手中顛倒振搖30min，直至管內(nèi)液體變得清亮，10000g,離心5min后收集上清。（留存10μl上清于一新Ep管中做對照）⑵將收集的剩余上清直接放入含有50μl50%GSH-Aragrosebeads的EP管中，混勻管內(nèi)液體，振搖反應(yīng)5min后，2000g離心1min，然后小心去除珠子上方的上清溶液。⑶在Ep管中加入預(yù)冷的PBS洗液1ml懸浮珠子，2000g離心1min，小心去除上清溶液，重復(fù)用PBS洗珠子8次以上,最后一次用5000g離心2min。最后將珠子上方的溶液盡量吸干凈，注意操作中盡量避免珠子被溶液帶走。⑷在收集的珠子中加入20μlGSH溶液懸浮珠子（注意不要顛倒Ep管，以免珠子粘在管壁上），室溫反應(yīng)5min后，10000g離心1min后收集上清溶液（即純化的GST蛋白）至一新Ep管中。（回收含有珠子的Ep管）二、GST酶純化聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）鑒定蛋白質(zhì)常規(guī)PAGE

不連續(xù)PAGE

SDS

固相pH梯度IEF(IPG-IEF)

雙向電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）鑒定蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。能得到孔徑不同、范圍廣泛的凝膠物質(zhì)，重復(fù)性好。機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大，有利于電泳后進(jìn)行各種處理。無電滲作用。設(shè)備簡單，所需樣品量少，分辨率高。用途廣泛：分離分析蛋白質(zhì)、核酸、多肽等大分子物質(zhì)；毫克水平材料的準(zhǔn)備；蛋白質(zhì)、核酸分子量的測定…….聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。能凝膠聚合原理 化學(xué)聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲級乙二胺（TEMED）為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發(fā)生連鎖反應(yīng)形成網(wǎng)狀的聚合物。光聚合核黃素B1還原型游離基聚合反應(yīng)光照O2凝膠聚合原理 化學(xué)聚合核黃素B1還原型聚丙烯酰胺凝膠的合成丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠催化劑聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠的合成丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠催化劑單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合光聚合引發(fā)劑（NH4)2S2O8（NH4)2S2O8

核黃素

加速劑TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8

過硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)

TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺

DMAPNβ－二甲基胺基丙晴聚合為含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，在相鄰長鏈之間通過甲撐橋連接而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合凝膠的孔徑單體和雙體在凝膠中的總濃度a+bV×100%T＝雙體占總濃度的百分含量，即交聯(lián)度ba＋b×100%C＝a，Acr的質(zhì)量（g）b，Bis的質(zhì)量（g）V，溶液的體積（ml）C＝6.5％-0.3TT：5％～20％孔徑大小凝膠的孔徑單體和雙體在凝膠中的總濃度a+bV×100%T＝蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍(kD)適用的凝膠濃度（T%）＜1020－3010－4015－2040－10010－15100－5005－10＞5002—5

凝膠濃度的選擇蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍(k聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀溶液濃溶液－

－交聯(lián)劑

凝膠－－結(jié)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀溶液濃溶液－－交聯(lián)劑凝膠不連續(xù)PAGE的分離效應(yīng)濃縮效應(yīng)分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)可分離：1.電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別

2.分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別的分子

3.電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同不連續(xù)凝膠電泳洗脫堿性不連續(xù)－分離酸性樣品酸性不連續(xù)－分離堿性樣品不連續(xù)PAGE的分離效應(yīng)濃縮效應(yīng)可分離：1.電荷性質(zhì)與密度相①

濃縮效應(yīng)1.緩沖液與凝膠的離子成分和pH值不同。Cl-，Gly-，蛋白質(zhì)離子?？炻x子遷移快慢的差別造成電場強(qiáng)度與電導(dǎo)率的變化。低導(dǎo)電區(qū)和高導(dǎo)電區(qū)。蛋白質(zhì)樣品遷移率在快慢離子之間，壓縮聚集成一條窄帶。2.兩層凝膠的孔徑不同：濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠①濃縮效應(yīng)1.緩沖液與凝膠的離子成分和pH值不同。Cl-，②分子篩效應(yīng)移動(dòng)界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時(shí)，凝膠的pH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，直至完全解離出gly-,其分子量小，遷移超過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用；同時(shí)，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動(dòng)，依其分子量的大小而分開。②分子篩效應(yīng)移動(dòng)界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時(shí)③電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)所帶的凈電的性質(zhì)和電荷量與分子的遷移率的關(guān)系，在同一電場強(qiáng)度中，在單位時(shí)間內(nèi)各分子遷移的距離的差別而到達(dá)分離。③電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)所帶的凈電的性質(zhì)和電荷量與分子的遷移率SDS依據(jù)被分離的蛋白質(zhì)分子大小而進(jìn)行分離，主要用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)解聚為多肽亞基。SDS是一種陰離子去垢劑，帶負(fù)電荷。蛋白質(zhì)多肽與SDS分子按比例結(jié)合(1.4gSDS/1g蛋白質(zhì))成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：logMW=K-bRf，MW為分子量，Rf為遷移率，k、b均為常數(shù)SDSSDS影響因素溶液中SDS單體的濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單體濃度低于0.5mmol/L，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3樣品緩沖液的離子強(qiáng)度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，通常是10～100mmol/L用SDS處理樣品同時(shí)用巰基乙醇或DTT處理，完全還原蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵，使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。影響因素溶液中SDS單體的濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白蛋白質(zhì)樣品收集蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)上樣行SDSSDS鑒定酶蛋白純度

蛋白質(zhì)樣品收集SDS鑒定酶蛋白純度

操作步驟

1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,準(zhǔn)備2個(gè)干凈的燒杯.

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好.

※固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.

3.按比例配好分離膠,用滴管快速加入,之后加少許蒸餾水封膠,靜置30－40分鐘.

※配制凝膠要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝膠無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免凝膠不均勻.

※封水的目的是為了使分離膠上沿平直，并隔絕空氣，促使凝膠聚合過程；

※凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面.

4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入分離膠面上,迅速插入樣梳,靜置40分鐘.

※樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.操作步驟1.將玻璃板用蒸餾水洗凈ddH2O3.90ml30%凝膠貯液3.33ml分離膠buffer2.50ml10%SDS100μl10%AP100μl10%TEMED100μl⑴配膠，先配分離膠，再陪濃縮膠。（在孵箱里或水浴鍋中聚合）10%分離膠配方：（10ml,一塊膠）

操作步驟ddH2O3.90ml⑴（2）4.8%濃縮膠配方：（5ml）ddH2O3.345ml30%凝膠貯液0.8ml濃縮膠buffer0.625ml10%SDS50μl10%AP50μl10%TEMED50μl

操作步驟（2）4.8%濃縮膠配方：（5ml）ddH2O5.拔出樣梳。插入電泳槽，倒入緩沖液體，用緩沖液沖洗樣品孔

※要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會(huì)影響加樣效果.6.加樣前蛋白樣品濃度的測定（每個(gè)樣品孔內(nèi)可加入蛋白約20-100μg)。7.上樣：在含有樣品的Ep管中加入10μl的2XSDS上樣buffer混勻溶液，對照管中加入10μl上樣buffer，沸水浴煮5min后方可上樣(用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣,注射器不可過低,以防刺破膠體,)。8.電泳：接通電源，先行80V電泳(濃縮膠)，樣品進(jìn)入分離膠后改為160V，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。9.染色取出凝膠，于考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色30min。

※剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無損.10.脫色回收染色液，加入脫色液，脫至背景清晰。.

操作步驟5.拔出樣梳。插入電泳槽，倒入緩沖液體，用緩沖液沖洗樣品孔思考題比較血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳和PAGE結(jié)果，試述為什么PAGE具有較高的分辨率？--回答三個(gè)效應(yīng)及如何形成？在不連續(xù)體系SDS中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么?樣品溶解液中各種試劑的作用是什么?在不連續(xù)體系SDS中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用?思考題注意事項(xiàng)丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過0.5μg/kg，皮膚接觸可致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動(dòng)作機(jī)能失調(diào)、四肢無力等。丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過皮膚。不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作。注意事項(xiàng)丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過注意事項(xiàng)Glu-Aragrosebeads（谷胱甘肽-瓊脂糖珠）呈透明乳白色，顆粒較小，用PBS洗珠子時(shí)要避免槍頭將珠子隨溶液一同吸出，造成樣品損失。沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近一定要催化充分，使之完全聚合集中處理，實(shí)驗(yàn)中全部的膠由專門受過訓(xùn)練的人收集到一起，在一個(gè)特殊標(biāo)明的容器中保存，并進(jìn)一步催化使之反應(yīng)完全，最后送交學(xué)校危險(xiǎn)品倉庫，統(tǒng)一處理。聚丙烯酰胺通常認(rèn)為無毒，但是也要小心操作，因?yàn)槠渲锌赡芰粝律倭繘]有聚合的單體。保護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器，不得損壞。注意事項(xiàng)Glu-Aragrosebeads（谷胱甘肽-瓊脂工程菌中GST酶的親和層析分離

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS）鑒定蛋白質(zhì)分離純化綜合實(shí)驗(yàn)工程菌中GST酶的親和層析分離

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳44Contents1.蛋白質(zhì)分離純化2.蛋白質(zhì)的鑒定分析Contents1.蛋白質(zhì)分離純化2.蛋白質(zhì)的鑒定分析根據(jù)蛋白分子特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。

性質(zhì)

方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)吸附層析(羥基磷灰石層析、疏水作用層析)對配體分子親和層析的生物親和力蛋白質(zhì)分離純化的方法根據(jù)蛋白分子特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來等電點(diǎn)沉淀法聚乙二醇沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法熱變性沉淀法蛋白質(zhì)分離純化1．電泳法2．層析法3．沉淀法4．透析、超濾5、離心6、結(jié)晶等電點(diǎn)沉淀法聚乙二醇沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法熱變性沉淀法蛋主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。一、粗分級分離主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白（1）鹽析(Salting-out)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[(NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl等]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。常用的鹽析劑是硫酸銨，其鹽析能力強(qiáng)，水中溶解度大，濃度高時(shí)也不會(huì)引起蛋白質(zhì)活性喪失。鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。（1）鹽析(Salting-out)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的GST酶親和層析及SDS課件蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。脫鹽常選用透析法或凝膠過濾。

透析是將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水(緩沖液)中進(jìn)行，可不斷更換蒸餾水，直至雜質(zhì)被除去。透析袋蛋白質(zhì)溶液蒸餾水（2）透析(Dialysis)蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。脫鹽（3）等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。（3）等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有(4)有機(jī)溶劑法與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有二：降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。極性有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。室溫下，有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。可在不斷攪拌下將預(yù)冷的有機(jī)溶劑逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機(jī)溶劑局部濃度過高，則在很大程度上解決變性問題。不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分離不同蛋白質(zhì)。(4)有機(jī)溶劑法與水互溶的極性有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能二、細(xì)分級分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用柱層析方法：分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。常用電泳方法：PAGE、等電聚焦電泳(IEF)。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。二、細(xì)分級分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部細(xì)菌中外源GST酶的分離純化及鑒定1、細(xì)菌中外源GST蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(IPTG誘導(dǎo))2、細(xì)菌的裂解（溶菌酶法）3、Glu-Aragrosebeads親和層析分離GST蛋白4、GST蛋白的SDS純度鑒定綜合實(shí)驗(yàn)細(xì)菌中外源GST酶的分離純化及鑒定綜合實(shí)驗(yàn)親和層析的原理親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對互配的。主要的有：酶和底物、酶與競爭性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。親和層析的原理親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液中的另一方分子進(jìn)行親和層析，達(dá)到分離純化目的。例如，酶與其輔酶是成對互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化。在親和層析中，作為固定相的一方稱為配基(ligand)。配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(matrix)(又稱載體或擔(dān)體)上，常用的載體主要有：瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素等。當(dāng)用小分子作為配基時(shí)，由于空間位阻不易與載體偶聯(lián)，或不易與配對分子載體結(jié)合。為此通常在載體和配基之間接入不同長度的連接臂(spacearm)。在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液Affinitychromatography

親和層析SolidMatrixligandAffinitychromatography親和層析So親和層析法分離生物大分子示意圖配基待分離的生物分子a.載體手臂配基親和吸附劑b.親和層析法分離生物大分子示意圖配基d.與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì)

d.與待分離物質(zhì)專一可逆結(jié)合的物質(zhì)c.樣品雜質(zhì)

親和層析的示意圖親和層析的示意圖GST酶的親和層析GSH-Agarosebeads

原理谷胱甘肽(Glutathione，GSH)與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(

GSH-S-transferase)之間具有特異性的作用力。將混合菌體蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠（G-Agarosebeads）孵育，凝膠手臂上的GSH可以與GST蛋白特異性結(jié)合，通過洗脫除去不能與珠結(jié)合的雜蛋白而獲得瓊脂糖珠結(jié)合的GST純蛋白。進(jìn)一步使用還原型谷胱甘肽(GSH)洗脫時(shí)，將競爭GST上的結(jié)合位點(diǎn)而將GST蛋白洗脫下來，從而獲得純化的GST酶的純品。GST酶的親和層析GSH-Agarosebeads操作步驟一、細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)⑴取一支凍存的B菌，無菌條件下解凍后取20μl放入20ml含氨芐青霉素（Amp，100ug/ml）的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜。⑵取培養(yǎng)12~14h后的小量培養(yǎng)菌液2ml放入250ml含Amp的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)3~5h后至OD600為0.6~0.8，加入1MIPTG250μl誘導(dǎo)培養(yǎng)3~6h后，收集菌液。⑶將菌液每3-4ml/管收集在Ep管中，離心后棄上清。操作步驟一、細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)二、GST酶純化⑴在含細(xì)菌沉淀的Ep管中加入500μl的裂解液懸浮細(xì)菌，再加入50μl溶菌酶溶液，反復(fù)在手中顛倒振搖30min，直至管內(nèi)液體變得清亮，10000g,離心5min后收集上清。（留存10μl上清于一新Ep管中做對照）⑵將收集的剩余上清直接放入含有50μl50%GSH-Aragrosebeads的EP管中，混勻管內(nèi)液體，振搖反應(yīng)5min后，2000g離心1min，然后小心去除珠子上方的上清溶液。⑶在Ep管中加入預(yù)冷的PBS洗液1ml懸浮珠子，2000g離心1min，小心去除上清溶液，重復(fù)用PBS洗珠子8次以上,最后一次用5000g離心2min。最后將珠子上方的溶液盡量吸干凈，注意操作中盡量避免珠子被溶液帶走。⑷在收集的珠子中加入20μlGSH溶液懸浮珠子（注意不要顛倒Ep管，以免珠子粘在管壁上），室溫反應(yīng)5min后，10000g離心1min后收集上清溶液（即純化的GST蛋白）至一新Ep管中。（回收含有珠子的Ep管）二、GST酶純化聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）鑒定蛋白質(zhì)常規(guī)PAGE

不連續(xù)PAGE

SDS

固相pH梯度IEF(IPG-IEF)

雙向電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）鑒定蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。能得到孔徑不同、范圍廣泛的凝膠物質(zhì)，重復(fù)性好。機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大，有利于電泳后進(jìn)行各種處理。無電滲作用。設(shè)備簡單，所需樣品量少，分辨率高。用途廣泛：分離分析蛋白質(zhì)、核酸、多肽等大分子物質(zhì)；毫克水平材料的準(zhǔn)備；蛋白質(zhì)、核酸分子量的測定…….聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。能凝膠聚合原理 化學(xué)聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲級乙二胺（TEMED）為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發(fā)生連鎖反應(yīng)形成網(wǎng)狀的聚合物。光聚合核黃素B1還原型游離基聚合反應(yīng)光照O2凝膠聚合原理 化學(xué)聚合核黃素B1還原型聚丙烯酰胺凝膠的合成丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠催化劑聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠的合成丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠催化劑單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合光聚合引發(fā)劑（NH4)2S2O8（NH4)2S2O8

核黃素

加速劑TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8

過硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)

TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺

DMAPNβ－二甲基胺基丙晴聚合為含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，在相鄰長鏈之間通過甲撐橋連接而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合凝膠的孔徑單體和雙體在凝膠中的總濃度a+bV×100%T＝雙體占總濃度的百分含量，即交聯(lián)度ba＋b×100%C＝a，Acr的質(zhì)量（g）b，Bis的質(zhì)量（g）V，溶液的體積（ml）C＝6.5％-0.3TT：5％～20％孔徑大小凝膠的孔徑單體和雙體在凝膠中的總濃度a+bV×100%T＝蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍(kD)適用的凝膠濃度（T%）＜1020－3010－4015－2040－10010－15100－5005－10＞5002—5

凝膠濃度的選擇蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍(k聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀溶液濃溶液－

－交聯(lián)劑

凝膠－－結(jié)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀溶液濃溶液－－交聯(lián)劑凝膠不連續(xù)PAGE的分離效應(yīng)濃縮效應(yīng)分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)可分離：1.電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別

2.分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別的分子

3.電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同不連續(xù)凝膠電泳洗脫堿性不連續(xù)－分離酸性樣品酸性不連續(xù)－分離堿性樣品不連續(xù)PAGE的分離效應(yīng)濃縮效應(yīng)可分離：1.電荷性質(zhì)與密度相①

濃縮效應(yīng)1.緩沖液與凝膠的離子成分和pH值不同。Cl-，Gly-，蛋白質(zhì)離子?？炻x子遷移快慢的差別造成電場強(qiáng)度與電導(dǎo)率的變化。低導(dǎo)電區(qū)和高導(dǎo)電區(qū)。蛋白質(zhì)樣品遷移率在快慢離子之間，壓縮聚集成一條窄帶。2.兩層凝膠的孔徑不同：濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠①濃縮效應(yīng)1.緩沖液與凝膠的離子成分和pH值不同。Cl-，②分子篩效應(yīng)移動(dòng)界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時(shí)，凝膠的pH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，直至完全解離出gly-,其分子量小，遷移超過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用；同時(shí)，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和pH值中泳動(dòng)，依其分子量的大小而分開。②分子篩效應(yīng)移動(dòng)界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時(shí)③電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)所帶的凈電的性質(zhì)和電荷量與分子的遷移率的關(guān)系，在同一電場強(qiáng)度中，在單位時(shí)間內(nèi)各分子遷移的距離的差別而到達(dá)分離。③電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)所帶的凈電的性質(zhì)和電荷量與分子的遷移率SDS依據(jù)被分離的蛋白質(zhì)分子大小而進(jìn)行分離，主要用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)解聚為多肽亞基。SDS是一種陰離子去垢劑，帶負(fù)電荷。蛋白質(zhì)多肽與SDS分子按比例結(jié)合(1.4gSDS/1g蛋白質(zhì))成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：logMW=K-bRf，MW為分子量，Rf為遷移率，k、b均為常數(shù)SDSSDS影響因素溶液中SDS單體的濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單體濃度低于0.5mmol/L，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3樣品緩沖液的離子強(qiáng)度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，通常是10～100mmol/L用SDS處理樣品同時(shí)用巰基乙醇或DTT處理，完全還原蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵，使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。影響因素溶液中SDS單體的濃度大于1mmol/L時(shí)大多數(shù)蛋白蛋白質(zhì)樣品收集蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)上樣行SDSSDS鑒定酶蛋白純度

蛋白質(zhì)樣品收集SDS鑒定酶蛋白純度

操作步驟

1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,準(zhǔn)備2個(gè)干凈的燒杯.

2.把玻璃板在灌膠支架上固定好.

※固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.

3.按比例配好分離膠,用滴管快速加入,之后加少許蒸餾水封膠,靜置30－40分鐘.

※配制凝膠要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝膠無法注膠.注膠過程最好一次性完成,