生化分離工程-蘇海佳-第三章細(xì)胞破碎

Chapter3CellDisruption

第三章細(xì)胞破碎微生物的代謝產(chǎn)物多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于在發(fā)酵液中。有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的多數(shù)蛋白質(zhì)不會被分泌到發(fā)酵液中，而是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類和一些抗生素也是包含在生物體中。目標(biāo)產(chǎn)物就是細(xì)胞本身，如面包酵母。胞外胞內(nèi)細(xì)胞細(xì)胞破碎是指：選用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。胞外物質(zhì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)酵液預(yù)處理——澄清液收集菌體——細(xì)胞破碎——轉(zhuǎn)入液相——碎片分離主要劃分為兩大類:化學(xué)法和機(jī)械法3·1細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成1.細(xì)菌的細(xì)胞壁所有的細(xì)菌細(xì)胞壁由堅(jiān)固的骨架——肽聚糖組成

1、肽聚糖由聚糖鏈借短肽交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞有一定的形狀和強(qiáng)度；2、短肽一般由4-5個氨基酸組成，常含有D-氨基酸與二氨基庚二酸；3、聚糖鏈由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替通過（1-4）糖苷健連接而成。短肽接在N-胞壁酸上，相鄰的短肽交叉相連，形成網(wǎng)狀。所有細(xì)菌都含有肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁較厚，約15-50nm，肽聚糖含量占40%一90%。其余是多糖和磷壁酸；革蘭氏陰性菌的肽聚糖層約，外有一外壁層約8-l0nm，由脂蛋白和脂多糖及磷脂構(gòu)成的兩層外壁層。革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁比革蘭氏陰性菌堅(jiān)固，較難破碎。特點(diǎn)：

破碎阻力：肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度，與肽鍵的數(shù)量和交聯(lián)度有關(guān)。Gram-negativeprocaryotes革蘭氏陰性原核生物（E.coli）1、里層葡聚糖的細(xì)纖維——細(xì)胞壁的剛性骨架；2、覆蓋在細(xì)纖維上的是一層糖蛋白；3、外層是由1，6—磷酸二脂鍵共價連接而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的甘露聚糖；4、其內(nèi)部有甘露聚糖—酶的復(fù)合物。2、酵母的細(xì)胞壁組成：由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁厚，更難破碎。例如，面包酵母的細(xì)胞壁厚約70nm。特點(diǎn)：破壁阻力：壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和壁厚。植物細(xì)胞胞壁的主主要組成成成分是是纖維素素在初生壁壁上還有有半纖維維素和果果膠質(zhì)纖維素是是由鏈狀狀結(jié)構(gòu)的的-D-葡萄糖以以1，4-葡萄糖苷苷鍵結(jié)合合，纖維維素分子子束聚集集——微纖絲——植物細(xì)胞胞壁的框框架，而而其他物物質(zhì)填充充在微纖纖絲之間間的空隙隙中——植物細(xì)胞胞壁的基基本結(jié)構(gòu)構(gòu)。在干燥植植物體中中纖維素素約占總總重的1/3一1/2。就是使細(xì)細(xì)胞壁和和細(xì)胞膜膜受到不不同程度度的破壞壞(增大通透透性)或破碎，，釋放其其中的目目標(biāo)產(chǎn)物物。細(xì)胞的大大小，形形狀、聚聚合物的的交聯(lián)程程度破碎細(xì)胞胞的目的的影響破碎碎的因素素：※3.2細(xì)胞破碎碎和產(chǎn)物物釋放原原理利用化學(xué)學(xué)、生化化試劑或或酶改變變細(xì)胞壁壁或細(xì)胞胞膜的結(jié)結(jié)構(gòu)，增增大胞內(nèi)內(nèi)物質(zhì)的的溶解速速率，或或完全溶溶解細(xì)胞胞壁，形形成原生生質(zhì)體，，在滲透透壓作用用下，細(xì)細(xì)胞膜破破裂釋放放胞內(nèi)物物質(zhì)。化學(xué)法壓縮力和和剪切力力——高壓勻漿漿、珠磨磨、撞擊擊破碎、、超聲波波破碎機(jī)械法主要有：：酸堿處處理、化化學(xué)試劑劑處理、、酶溶滲透壓沖沖擊法和和凍結(jié)—融化法物理滲透透法細(xì)胞破碎碎機(jī)理※3.3mechanicaldisruption機(jī)械破碎碎1、處理量量大，破破碎快，，時間短短，效率率較高，，工業(yè)規(guī)規(guī)模的重重要手段段；2、作用力：：擠壓，剪剪切和撞撞擊作用用；3、在許多多情況下下，細(xì)胞胞內(nèi)含物物全部釋釋放出來來；4、由于機(jī)機(jī)械攪拌拌產(chǎn)生熱熱量，破破碎要采采用冷卻卻措施。。機(jī)械法破破碎特點(diǎn)點(diǎn)機(jī)械破碎碎主要的的方法有有珠磨法法、高壓壓勻漿法法、撞擊擊破碎法法和超聲聲波等方方法。1.高壓勻漿漿法（high-pressurehomogenization）原理：利用高壓壓迫使細(xì)細(xì)胞懸浮浮液通過過針形閥閥，由于于突然減減壓和高高速撞擊擊造成細(xì)細(xì)胞破裂裂，在高高壓勻漿漿器中，，細(xì)胞經(jīng)經(jīng)歷了高高速造成成的剪切切、碰撞撞和由高高壓到常常壓的突突變，從從而造成成細(xì)胞壁壁的破壞壞，細(xì)胞胞膜隨之之破裂，，胞內(nèi)產(chǎn)產(chǎn)物得到到釋放。。高速勻漿漿破碎的的動力學(xué)學(xué)方程為為：細(xì)胞破碎碎率S與操作壓壓力P和循環(huán)次次數(shù)N之間的關(guān)關(guān)系。k為破碎速速度常數(shù)數(shù)上述參數(shù)數(shù)隨微生生物種類類和培養(yǎng)養(yǎng)條件的的不同而而有所差差異壓力P可用動能能表達(dá)：：影響因素素：細(xì)胞破碎碎率用包包內(nèi)產(chǎn)物物釋放率率表示：：1、壓力、、溫度和和通過勻勻漿器閥閥的次數(shù)數(shù)，操作作壓力影影響最大大。工業(yè)業(yè)生產(chǎn)中中常采用用的壓力力為55－70Mpa。2、不同菌菌種，不不同生長長期以及及不同培培養(yǎng)條件件。優(yōu)點(diǎn)：1、操作參參數(shù)少，，且易于于確定；；2、樣品損損失量少少，在間間歇處理理少量樣樣品方面面效果好好3、適用于于酵母和和大多數(shù)數(shù)細(xì)胞的的破碎。。適用范圍圍：1、適用于于酵母和和大多數(shù)數(shù)細(xì)菌細(xì)細(xì)胞；2、細(xì)胞濃濃度可達(dá)達(dá)20%；3、團(tuán)狀或或絲狀真真菌易造造成堵塞塞，一些些易損傷傷勻漿閥閥，質(zhì)地地堅(jiān)硬的的亞細(xì)胞胞器一般般不適用用；4、需設(shè)置置冷卻裝裝置。原理：細(xì)細(xì)胞懸浮浮液與玻玻璃珠（（或石英英砂，或或氧化鋁鋁）一起起高速攪攪拌，研研磨使細(xì)細(xì)胞達(dá)到到某種程程度破碎碎，2.珠磨法（（Beadmilling）作用力：：剪切力力層之間間的碰撞撞和磨料料的滾動動WSK臥式高效效全能珠珠磨機(jī)ZM系列臥式式密閉珠珠(砂)磨機(jī)兩種情況況下，細(xì)細(xì)胞破碎碎動力學(xué)學(xué)可近似似表示為為：t：為細(xì)胞懸懸浮液在在破碎室室內(nèi)的平平均停留留時間其中V為懸浮液液體積m3，Q為懸浮液液流量m3/S，S為破碎率率，k為破碎速速率常數(shù)數(shù)，與許許多因素素有關(guān)。?？刹捎瞄g間歇式與與連續(xù)操操作。間歇操作作：t為破碎操操作時間間即連續(xù)操作作：1、隨細(xì)胞胞種類而而異；2、同一進(jìn)進(jìn)料速度度，細(xì)胞胞濃度，則破碎碎率，能耗；3、同一懸懸浮液中中，破碎碎的能耗耗與破碎碎率成正正比，提提高破碎碎率，導(dǎo)導(dǎo)致電能能消耗增增加；4、對一定定細(xì)胞，，存在適適宜的微微球粒徑徑，通常常D/d=30-100，D：微球粒粒徑；d：目標(biāo)細(xì)細(xì)胞粒徑徑。攪拌轉(zhuǎn)速懸浮液進(jìn)料速率微球大小微球填充密度細(xì)胞濃度微球密度溫度攪拌槳設(shè)計(jì)破碎室的幾何形狀影響1、操作簡簡便穩(wěn)定定，破碎碎率可控控制，易易放大2、在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室和工工業(yè)規(guī)模模上已得得到應(yīng)用用3、適用于于絕大多多數(shù)微生生物細(xì)胞胞破碎，，特別對于有大大量菌絲絲體的微微生物和和一些有有亞細(xì)胞胞器（質(zhì)質(zhì)地堅(jiān)硬硬）的微微生物細(xì)細(xì)胞。缺點(diǎn)：破破碎過程程產(chǎn)生大大量的熱熱能，有有效能量量利用率率僅為1%，應(yīng)充分分考慮換換熱。優(yōu)點(diǎn)：3、撞擊破破碎原理：將將細(xì)胞冷冷凍可使使其成為為剛性球球體，降降低破碎碎的難度度。如圖：細(xì)細(xì)胞懸浮浮液以噴噴霧狀高高速凍結(jié)結(jié)，形成成粒徑小小于50m的微粒子子。高速速載氣氣(如氮?dú)?，，流速約約300m/s)。將凍結(jié)結(jié)的微粒粒子送入入破碎室室，高速速撞擊撞撞擊板，，使凍結(jié)結(jié)的細(xì)胞胞發(fā)生破破碎。1、細(xì)胞破破碎僅發(fā)發(fā)生在與與撞擊板板撞擊的的一瞬間間，細(xì)胞胞破碎均均勻，可可避免細(xì)細(xì)胞反復(fù)復(fù)受力發(fā)發(fā)生過度度破碎的的現(xiàn)象。。2、細(xì)胞破破碎程度度可通過過無級調(diào)調(diào)節(jié)載氣氣壓力(流速)控制，避避免細(xì)胞胞內(nèi)部結(jié)結(jié)構(gòu)的破破壞，適適用于細(xì)細(xì)胞器(如線粒體體、葉綠綠體等)的回收。。3、適用于于大多數(shù)數(shù)微生物物細(xì)胞和和植物細(xì)細(xì)胞的破破碎，通通常處理理細(xì)胞懸懸浮液濃濃度為10%-20%。4、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室規(guī)規(guī)模的的撞擊擊破碎碎器間間歇處處理能能力約約50-500cm3，而工工業(yè)規(guī)規(guī)模的的連續(xù)續(xù)處理理在l0dm3/h以上.特點(diǎn)：：4、超聲聲波破破碎法法(Ultrasonication)破碎機(jī)機(jī)理：：是與與空化化現(xiàn)象象引起起的沖沖擊波波和剪剪切力力有關(guān)關(guān)，即即空穴穴作用用產(chǎn)生生的空空穴泡泡由于于又受受到超超聲波波的沖沖擊而而閉合合，從從而產(chǎn)產(chǎn)生一一個極極為強(qiáng)強(qiáng)烈的的沖擊擊力壓壓力，，由此此而引引起懸懸浮細(xì)細(xì)胞上上產(chǎn)生生了剪剪切應(yīng)應(yīng)使細(xì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)液體體產(chǎn)生生流動動而使使細(xì)胞胞破碎碎?？栈髯饔脵C(jī)械作作用熱效應(yīng)應(yīng)1、處理理少量量樣品品時操操作方方便，，液體體損傷傷量少少，破破碎率率高。。2、有效效能量量利率率極低低，操操作時時需在在冰水水中進(jìn)進(jìn)行或或通入入冷卻卻劑而而增加加成本本，不不易放放大；；3、適用用于大大多數(shù)數(shù)微生生物的的破碎碎，不不適于于大規(guī)規(guī)模操操作，，主要要用于于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室規(guī)規(guī)模的的細(xì)胞胞破碎碎。影響：：細(xì)胞種種類、、濃度度、處處理時時間以以及超超聲波波的聲聲頻特點(diǎn)：：方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理細(xì)胞機(jī)機(jī)械破破碎法法比較較※3.4CHEMICALMETHODS化學(xué)方方法1.堿處理理利用酸酸堿調(diào)調(diào)節(jié)pH值，可可提高高目標(biāo)標(biāo)產(chǎn)物物溶解解度。。堿處理理20－30min可導(dǎo)致致細(xì)胞胞溶解解。缺點(diǎn)：：pH=11－11.5的堿濃濃度破破壞了了許多多生物物活性性，使使蛋白白酶失失活，，常伴伴隨著著蛋白白的變變性和和降解解。優(yōu)點(diǎn)：：價格格便宜宜，易易適于于任何何規(guī)模模的操操作。。2.化學(xué)試試劑法法化學(xué)滲滲透取取決于于試劑劑的類類型和和細(xì)胞胞壁、、細(xì)胞胞膜的的結(jié)構(gòu)構(gòu)與形形成。。1).EDTA螯合劑劑，對對細(xì)胞胞的外外層膜膜有破破壞作作用。。如E-coli；原因：：二價價陽離離子，，尤其其是Mg2＋對革革蘭氏氏陰性性菌細(xì)細(xì)胞被被膜以以外層層膜的的穩(wěn)定定作用用是重重要的的，EDTA的螯合合作用用導(dǎo)致致外層層膜不不穩(wěn)定定或去去除。。2).有機(jī)溶溶劑法法可使細(xì)細(xì)胞膜膜表面面發(fā)生生變化化，胞胞內(nèi)產(chǎn)產(chǎn)物可可以釋釋放出出來，，由于于沒有有整體體破碎碎細(xì)胞胞，可可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)選擇擇性釋釋放.如采用用異丙丙醇處處理酵酵母，，釋放放超氧氧化物物歧化化酶，，處理理后，，超氧氧化物物歧化化酶釋釋放率率達(dá)90％，純純化因因子提提高25。3).表面活活性劑劑能夠作作用細(xì)細(xì)胞質(zhì)質(zhì)和細(xì)細(xì)胞壁壁膜，，膜結(jié)結(jié)構(gòu)中中的脂脂蛋白白成分分被或或多或或少地地溶解解，使使細(xì)胞胞滲透透作用用有利利于某某些蛋蛋白的的通過過。如如：SDS等作用是是溶解解蛋白白質(zhì)和和擾亂亂蛋白白－脂脂界面面?；瘜W(xué)滲滲透法法的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)：：避免免大量量細(xì)胞胞碎片片，核核酸留留在胞胞內(nèi)，，處理理后，，溶液液很容容易澄澄清，，簡化化后處處理步步驟，，簡單單的攪攪拌容容器代代替了了機(jī)械械破碎碎設(shè)備備。缺點(diǎn)是是價格格昂貴貴，易易污染染產(chǎn)物物，會會導(dǎo)致致產(chǎn)物物活性性和最最優(yōu)產(chǎn)產(chǎn)量的的不可可逆損損失。。3.生物法法酶溶法法是利利用酶酶反應(yīng)應(yīng)分解解破壞壞細(xì)胞胞壁上上特殊殊的鍵鍵而達(dá)達(dá)到破破壁的的目的的，以以提高高胞內(nèi)內(nèi)產(chǎn)物物和通通透性性。優(yōu)點(diǎn)：：生物物轉(zhuǎn)移移性強(qiáng)強(qiáng)，操操作條條件溫溫和、、能量量低、、可避避免高高剪切切力，，確保保產(chǎn)物物破壞壞最小小。缺點(diǎn)：：費(fèi)用用高，，時間間長，，多用用于原原生質(zhì)質(zhì)體自溶作作用是是酶溶溶的另另一種種方式式，通通過調(diào)調(diào)節(jié)溫溫度，，PH或添加加有機(jī)機(jī)溶劑劑等激激活劑劑，誘誘使細(xì)細(xì)胞產(chǎn)產(chǎn)生溶溶解自自身的的酶的的方法法，稱稱為自自溶。。1）滲透透壓沖沖擊法法（OsmoticShock）將細(xì)胞胞放在在高滲滲透壓壓的介介質(zhì)中中（如如一定定濃度度的甘甘油或或蔗糖糖溶液液），，達(dá)到到平衡衡后，，介質(zhì)質(zhì)被突突然稀稀釋，，或者者將細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入緩緩沖液液中，，由于于滲透透壓的的突然然變化化，水水迅速速通過過細(xì)胞胞壁和和細(xì)胞胞膜進(jìn)進(jìn)入細(xì)細(xì)胞，，引起起細(xì)胞胞壁和和膜膨膨脹破破裂，，從而而使細(xì)細(xì)胞通通透性性增大大。4.細(xì)胞物物理破破碎方方法原理1、最溫溫和的的一種種方法法2、選擇擇性高高，釋釋放速速度快快，工工藝簡簡單，，易放放大。。3、適用用于易易破碎碎的細(xì)細(xì)胞，，和細(xì)細(xì)胞壁壁預(yù)先先受到到酶處處理的的細(xì)胞胞，及及合成成受抑抑制而而強(qiáng)度度減弱弱的細(xì)細(xì)胞，，如動動物細(xì)細(xì)胞和和革蘭蘭氏陰陰性菌菌。特點(diǎn)：：缺點(diǎn)：：存在在著高高鹽濃濃度對對產(chǎn)品品污染染問題題。2)冷凍－－融化化法(Freczinganthawirg)破壞細(xì)細(xì)胞膜膜的疏疏水鍵鍵，增增加其其親水水性和和通透透性，，而且且由于于胞內(nèi)內(nèi)水結(jié)結(jié)晶使使胞內(nèi)內(nèi)外產(chǎn)產(chǎn)生溶溶液濃濃度差差，在在滲透透壓作作用下下引起起細(xì)胞胞膨脹脹而破破裂。。本法對于存存在于細(xì)胞胞質(zhì)周圍靠靠近細(xì)胞膜膜的胞內(nèi)產(chǎn)產(chǎn)物釋放較較為有效，，但由于本本法成本高高，只能進(jìn)進(jìn)行小規(guī)模模應(yīng)用，且且釋放速率率慢、產(chǎn)量量低，另外外酶易失活活也限制了