光度測(cè)定法BE檢查技術(shù)

光度測(cè)定法BET檢查技術(shù)湛江安度斯生物有限公司2009年3月1、光度測(cè)定法方法學(xué)分類2、光度測(cè)定法原理3、動(dòng)態(tài)比濁法BET4、終點(diǎn)比色法BET2023/1/521、光度測(cè)定法方法學(xué)分類光度測(cè)定法（定量法檢測(cè)）濁度法顯色法動(dòng)態(tài)濁度法終點(diǎn)濁度法動(dòng)態(tài)顯色法終點(diǎn)顯色法(比濁法)(比色法)2023/1/532、光度測(cè)定法原理光電轉(zhuǎn)換原理光度測(cè)定法是利用鱟試劑與內(nèi)毒素的混合物在反應(yīng)過(guò)程的透光度變化與內(nèi)毒素濃度的關(guān)系來(lái)定量檢測(cè)內(nèi)毒素的一種方法。當(dāng)一束光線進(jìn)入如下光電轉(zhuǎn)換裝置時(shí)，該裝置將產(chǎn)生電流I，我們稱I為透光強(qiáng)度。入射光反應(yīng)混合物透射光光電池I透光容器2023/1/54設(shè)：初始時(shí)的透光強(qiáng)度為Is，某時(shí)刻的透光強(qiáng)度為It

定義1：透光度（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始時(shí)It=Is，Rt=100%，Rt曲線變化趨勢(shì)是由高至低。定義2：吸光度(OD)：

OD=-lg(It/Is)

初始時(shí)It=Is，OD=0，OD曲線變化趨勢(shì)是由低至升高。選擇不同的參數(shù)(Rt或OD)將得到不同變化趨勢(shì)的動(dòng)態(tài)曲線。T(分)IsItIeI2023/1/55TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線(Rt-T曲線)以透光度（Rt）為縱座標(biāo)，時(shí)間（T）為橫座標(biāo)，把TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)混合液透光度的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線如圖：Rt（%）T（分）動(dòng)態(tài)曲線100孕育期反應(yīng)期結(jié)束2023/1/56TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線(OD-T曲線)以吸光度（OD）為縱座標(biāo)，時(shí)間（T）為橫座標(biāo)，把TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)混合液吸光度的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線如圖：ODT（分）動(dòng)態(tài)曲線0孕育期反應(yīng)期結(jié)束2023/1/57動(dòng)態(tài)曲線的特點(diǎn)把標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制備成三個(gè)濃度C1、C2、C3（C1>C2>C3），分別與TAL反應(yīng)，描繪出反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線如下圖：C3Rt（%）T（分）C2C1分析動(dòng)態(tài)曲線可看出：內(nèi)毒素濃度越高，孕育期越短；內(nèi)毒素濃度越高，反應(yīng)期曲線越陡；內(nèi)毒素濃度越高，進(jìn)入結(jié)束期越快。2023/1/58光度測(cè)定法BET試驗(yàn)的相關(guān)變量C3100Rt（%）T（分）C2C1相關(guān)變量：

內(nèi)毒素濃度(C)

透光度(Rt或OD)

反應(yīng)時(shí)間(T)2023/1/591）動(dòng)態(tài)法原理固定透光度(Rt)，建立內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-T曲線），用供試品的反應(yīng)時(shí)間比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。這里的反應(yīng)時(shí)間是指反應(yīng)混合液的透光度到達(dá)預(yù)設(shè)透光度值（Rt）的時(shí)間?；貧w分析Rt%預(yù)設(shè)透光度值R0T1T2T392100T(分)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線2023/1/510（2）測(cè)測(cè)定定樣樣品品內(nèi)內(nèi)毒毒素素濃濃度度（（Cs）用鱟鱟試試劑劑與與未未知知內(nèi)內(nèi)毒毒素素含含量量的的供供試試品品(S)反應(yīng)應(yīng)，，得得到到反反應(yīng)應(yīng)時(shí)時(shí)間間Ts，比比對(duì)對(duì)C-T關(guān)系系的的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線，，可可得得出出供供試試品品的的內(nèi)內(nèi)毒毒素素含含量量Cs。比對(duì)對(duì)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線TsT(分)Rt(%)R0CsLgT=b-kLgCLgCCsTsLgT922022/12/29112）終點(diǎn)點(diǎn)法原原理固定反反應(yīng)時(shí)時(shí)間（（T），建建立內(nèi)內(nèi)毒素素濃度度與透透光度度關(guān)系系的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲曲線（（C-Rt曲線）），用用供試試品的的透光光度比比對(duì)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲曲線，，得出出供試試品的的內(nèi)毒毒素濃濃度。。Rt(%)T(分)C1C2C3100R1R2R3預(yù)設(shè)反反應(yīng)終終止時(shí)時(shí)間T0RtR3R2R1C3C2C1Rt=b-K·C回歸分分析（1）建立立標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線線2022/12/2912（2）測(cè)定定樣品品內(nèi)毒毒素濃濃度（（Cx）用鱟試試劑與與未知知內(nèi)毒毒素含含量的的供試試品（（X）反應(yīng)應(yīng)，得得到透透光度度值Rx，比對(duì)對(duì)C-Rt關(guān)系的的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線線，可可得出出供試試品的的內(nèi)毒毒素含含量Cx。CxToT(分)Rx100Rt(%)Rt(%)Rt=b-K·CRxCx比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線2022/12/29133、動(dòng)態(tài)態(tài)比濁濁法試驗(yàn)儀儀器及及器具具動(dòng)態(tài)微微孔平平板儀儀或試試管儀儀BET軟件微孔平板、、反應(yīng)試管管等2022/12/2914英國(guó)LabKinetics公司ATi動(dòng)態(tài)試管儀儀,96孔湛江安度斯斯公司開(kāi)發(fā)發(fā)的BET專用軟件“生物探針針-2002”2022/12/2915美國(guó)CharlesRiverEndosafe便攜式檢測(cè)測(cè)系統(tǒng)（PTS）美國(guó)BioTek公司超級(jí)酶酶標(biāo)儀，ELx808IU,使用96孔微孔板2022/12/2916LKM細(xì)菌內(nèi)毒素素動(dòng)態(tài)試管管儀制造商：英英國(guó)萊伯金金耐特公司司（LabKineticsLtd.）世界上第一一臺(tái)動(dòng)態(tài)試試管儀的生生產(chǎn)商目前世界上上銷量最大大的動(dòng)態(tài)試試管儀已經(jīng)取得醫(yī)醫(yī)療器械許許可證完善的售后后服務(wù)儀器特點(diǎn)：：1、體積小巧巧，占用空空間??；2、恒溫性能能、光學(xué)性性能精密，，各孔溫度均均在37±0.2℃，這是國(guó)內(nèi)同同類儀器無(wú)無(wú)法達(dá)到的。3、配有專業(yè)業(yè)的、操作作簡(jiǎn)單的軟軟件系統(tǒng)。2022/12/2917ELx808IU型動(dòng)態(tài)酶酶標(biāo)儀制造商：：美國(guó)伯伯騰公司司（BioTek）功能強(qiáng)大大的細(xì)菌菌內(nèi)毒素素檢測(cè)儀儀器豐富的面面板操作作及數(shù)據(jù)據(jù)分析，，無(wú)需電電腦可獨(dú)獨(dú)立操作作可使用多多個(gè)波長(zhǎng)長(zhǎng)同時(shí)分分析2022/12/2918動(dòng)態(tài)比濁濁法試驗(yàn)驗(yàn)程序1、器具的的準(zhǔn)備2、驗(yàn)證試試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線線的可靠靠性試驗(yàn)驗(yàn)干擾試驗(yàn)驗(yàn)3、檢查法法2022/12/29191）試驗(yàn)器器具的準(zhǔn)準(zhǔn)備器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑8×75mm或10×75mm）稀釋容器大口徑玻璃試管移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及無(wú)熱原吸頭等其他試管架、酒精燈、異丙醇浸泡的無(wú)紡布、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜或醫(yī)用膠布、標(biāo)記紙等凡是與供供試品或或反應(yīng)試試劑接觸觸的器具具，必須須經(jīng)除熱熱原處理理。通常常玻璃器器具需經(jīng)經(jīng)250℃℃、60分鐘的干干烤處理理2022/12/29202）標(biāo)準(zhǔn)曲曲線的可可靠性試試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康牡尿?yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室的條條件是否否滿足BET試驗(yàn)的要要求驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)人員的的實(shí)驗(yàn)技技能是否否滿足BET試驗(yàn)驗(yàn)的的要要求求驗(yàn)證證實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)所所用用試試劑劑（（包包括括鱟鱟試試劑劑、、內(nèi)內(nèi)毒毒素素標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品品、、BET水等等））是是否否滿滿足足BET試驗(yàn)驗(yàn)要要求求2022/12/29211、、試劑劑2022/12/29Page22試劑名稱廠家裝量規(guī)格動(dòng)態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支10EU/ml~0.03EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶?jī)?nèi)毒素<0.003EU/ml2、反應(yīng)項(xiàng)項(xiàng)目將標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒毒素制備成成至少3個(gè)濃度的稀稀釋液，相相鄰濃度間間稀釋倍數(shù)數(shù)不得大于于10，最低濃度度不得低于于所用鱟試試劑的標(biāo)示示檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)前，先先預(yù)熱動(dòng)態(tài)態(tài)儀，使其其達(dá)到反應(yīng)應(yīng)溫度項(xiàng)目平行管陰性對(duì)照溶液(D)OOOOOOOOOOO內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（C）(EU/mL)0.030.252.02022/12/29233、溶液C的制備E1003.6mlWE100.4ml3.2mlWE20.8ml2.8mlWE0.250.4ml2.8mlWE0.030.4ml30s0.4ml30s0.4ml30s0.8ml30s0.4mlBET水1.0ml2.8ml2.8ml3.6ml3.2mlCSE混合5分鐘E10E2E0.25E0.03CSE/E1002022/12/29244、鱟試劑劑的準(zhǔn)備①取TAL1支，用砂輪輪在安瓿頸劃痕，擦拭拭后從安瓿瓿頸處折斷斷（避免玻玻璃屑落入入安瓿內(nèi)））；②②用刻度度吸管或移移液器準(zhǔn)確確吸取BET水1.25ml沿瓶壁加入入安瓿內(nèi)，，輕輕搖勻勻，使內(nèi)容容物全部溶溶解（避免免產(chǎn)生氣泡泡）；③取反應(yīng)應(yīng)試管11支，按2.0EU/ml、0.25EU/ml、、0.03EU/ml各濃度平行行3管，NC平行2管標(biāo)標(biāo)記；2022/12/29255、、軟軟件件系系統(tǒng)統(tǒng)的的設(shè)設(shè)置置進(jìn)入入動(dòng)動(dòng)態(tài)態(tài)儀儀系系統(tǒng)統(tǒng)軟軟件件，，根根據(jù)據(jù)試試驗(yàn)驗(yàn)要要求求，，設(shè)設(shè)置置相相關(guān)關(guān)參參數(shù)數(shù)，，如如反反應(yīng)應(yīng)時(shí)時(shí)間間、、預(yù)預(yù)設(shè)設(shè)透透光光度度值值等等。。填寫(xiě)寫(xiě)相相關(guān)關(guān)的的實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)參參數(shù)數(shù)，，使使軟軟件件進(jìn)進(jìn)入入待待采采集集狀狀態(tài)態(tài)2022/12/29266、、加加樣樣反反應(yīng)應(yīng)先將將復(fù)復(fù)溶溶好好的的鱟鱟試試劑劑分分裝裝至至各各反反應(yīng)應(yīng)試試管管中中，，0.1ml/管；；分別別將將反反應(yīng)應(yīng)溶溶液液加加入入各各相相應(yīng)應(yīng)反反應(yīng)應(yīng)管管中中，，一一般般按按照照從從低低濃濃度度到到高高濃濃度度的的順順序序加加樣樣，，首首先先加加陰陰性性對(duì)對(duì)照照溶溶液液；；加樣樣完完成成后后，，將將每每支支反反應(yīng)應(yīng)管管內(nèi)內(nèi)的的混混合合液液輕輕輕輕混混勻勻后后，，插插入入動(dòng)動(dòng)態(tài)態(tài)儀儀中中反反應(yīng)應(yīng)TAL2.0EU/ml0.1ml0.1ml0.1ml0.25EU/mlCSE0.1ml0.03EU/ml0.1mlNCBET水0.1ml0.1ml0.1ml加樣樣順順序序從從低低濃濃度度到到高高濃濃度度2022/12/2927在動(dòng)態(tài)儀儀中插入入反應(yīng)試試管后，，開(kāi)始數(shù)數(shù)據(jù)采集集。2022/12/29287、結(jié)果果判斷藥典要求求1、陰性性對(duì)照的的反應(yīng)時(shí)時(shí)間應(yīng)大大于標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線最最低濃度度的反應(yīng)應(yīng)時(shí)間2、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線的的相關(guān)系系數(shù)|r|≥0.980廠家建議議值3、變異異系數(shù)CV%<10%關(guān)于相關(guān)關(guān)系數(shù)當(dāng)對(duì)一組組數(shù)據(jù)作作線性回回歸分析析時(shí)，以以相關(guān)系系數(shù)r表示其標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線線的線性性狀況，，即該組組數(shù)據(jù)的的相關(guān)狀狀況。當(dāng)當(dāng)r值為正時(shí)時(shí)，表示示該組數(shù)數(shù)據(jù)呈正正相關(guān)關(guān)關(guān)系；r值為負(fù)時(shí)時(shí)，該組組數(shù)據(jù)為為負(fù)相關(guān)關(guān)關(guān)系。。當(dāng)r值的絕對(duì)對(duì)值|r|=1時(shí)，其標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線線的線性性最好。。2022/12/2929試驗(yàn)完完成后后進(jìn)行行數(shù)據(jù)據(jù)分析析2022/12/2930試驗(yàn)完完成后后進(jìn)行行數(shù)據(jù)據(jù)分析析2022/12/2931試驗(yàn)完成后后進(jìn)行數(shù)據(jù)據(jù)分析E0.3125E0.25E22022/12/29323）干擾擾初篩試驗(yàn)驗(yàn)?zāi)康募霸砝碇挥性跓o(wú)干干擾情況下下，樣品的的內(nèi)毒素檢檢測(cè)結(jié)果才才是有效的的。通過(guò)檢測(cè)從從供試品原原液到其MVD或MVC之間的稀釋釋液，計(jì)算算內(nèi)毒素回回收率，判判斷供試品品濃度對(duì)BET的干擾情況況。2022/12/2933試驗(yàn)步驟1、供試品品限值的確確定2、試劑的的選擇3、供試品品最大有效效稀釋的計(jì)計(jì)算4、反應(yīng)溶溶液的制備備5、加樣及及反應(yīng)6、結(jié)果判判斷2022/12/2934干擾擾初初篩篩試試驗(yàn)驗(yàn)舉舉例例供試試品品限限值值硫酸酸慶慶大大霉霉素素，，100ml/瓶，，5000U/ml；；藥典典要要求求，，硫硫酸酸慶慶大大霉霉素素限限值值L=0.5EU/1000U2022/12/2935試劑劑本試試驗(yàn)驗(yàn)使使用用鱟鱟試試劑劑的的檢檢測(cè)測(cè)范范圍圍為為10~0.03EU/ml，，選擇擇標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線濃濃度度為為2、、0.25、、0.03EU/ml試劑名稱廠家裝量規(guī)格動(dòng)態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支10~0.03EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶?jī)?nèi)毒素<0.003EU/ml2022/12/2936最大大有有效效稀稀釋釋倍倍數(shù)數(shù)的的計(jì)計(jì)算算光度度測(cè)測(cè)定定法法中中，，供供試試品品最最大大有有效效稀稀釋釋倍倍數(shù)數(shù)計(jì)計(jì)算算公公式式：：MVD=cL/λλ，，其中中λ為標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線最最低低點(diǎn)點(diǎn)濃濃度度本試試驗(yàn)驗(yàn)，，MVD=5000U/mlx0.5EU/1000U0.03EU/ml=80（（倍））2022/12/2937各反反應(yīng)應(yīng)溶溶液液的的制制備備溶液液C的制制備備E1000.4ml3.6mlWE100.8ml3.2mlWE20.4ml2.8mlWE0.25S原液液0.4ml3.6mlWS101.4ml1.4mlWS201.4ml1.4mlWS401.4ml1.4mlWS80備用用液液0.4ml2.8mlWE0.03溶液液A的制制備備E0.50.8ml2.4mlW備用用液液2022/12/2938溶液B的制備E0.5S100.5ml0.5mlS20E0.25E0.5S400.5ml0.5mlS80E0.25E0.5S200.5ml0.5mlS40E0.252022/12/2939加樣及反應(yīng)應(yīng)取TAL兩支，參照照標(biāo)準(zhǔn)曲線線可靠性試試驗(yàn)中的方方法將其復(fù)復(fù)溶；復(fù)溶鱟試劑劑后，運(yùn)行行軟件，使使其進(jìn)入待待采集狀態(tài)態(tài)；將兩支復(fù)溶溶好的鱟試試劑溶液合合并在一起起，輕輕混混勻避免產(chǎn)產(chǎn)生氣泡；；將鱟試劑液液分裝至20支反應(yīng)應(yīng)試管中，，0.1ml/管；將相應(yīng)的溶溶液A、B、C、D加至反應(yīng)管管中，0.1mL/管，每濃度度平行2管管E0.03E0.25E2溶液C溶液DWS20S40S80S20E0.25S40E0.25S80E0.25溶液A溶液A溶液A溶液B溶液B溶液B2022/12/2940結(jié)果判斷藥典要求1、陰性對(duì)對(duì)照的反應(yīng)應(yīng)時(shí)間（TD）大于標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線最低低濃度的反反應(yīng)時(shí)間（（Tλ）2、標(biāo)準(zhǔn)曲曲線的相關(guān)關(guān)系數(shù)|r|≥0.9803、回收率率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議值值4、變異系系數(shù)CV%<10%2022/12/2941回收率率的計(jì)計(jì)算光度測(cè)測(cè)定法法試驗(yàn)驗(yàn)中，，在供試品品檢查查濃度度的溶溶液中中,添加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲曲線中中點(diǎn)或或靠近近中點(diǎn)點(diǎn)的內(nèi)內(nèi)毒素素濃度度,根據(jù)回回收的的內(nèi)毒毒素濃濃度與與添加加的內(nèi)內(nèi)毒素素濃度度的比比值(回收率率R)，，判斷供供試品品溶液液對(duì)試試驗(yàn)的的干擾擾程度度。R的計(jì)算算公式式如下下：2022/12/29Page42Ct：試驗(yàn)驗(yàn)測(cè)出出的供供試品品溶液液的內(nèi)內(nèi)毒素素含量量Cs：試驗(yàn)驗(yàn)測(cè)出出的加加入m標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)內(nèi)毒素素的供供試品品溶液液的內(nèi)內(nèi)毒素素含量量m：標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線線的中中點(diǎn)或或靠近近中點(diǎn)點(diǎn)的已已知濃濃度內(nèi)內(nèi)毒素素光度測(cè)測(cè)定法法規(guī)定定：當(dāng)當(dāng)R在50~200%之間時(shí)時(shí)，認(rèn)認(rèn)為在在此試試驗(yàn)條條件下下該供供試品品溶液液對(duì)試試驗(yàn)無(wú)無(wú)干擾擾。Cs-CtmR=本試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果果相關(guān)系系數(shù)絕絕對(duì)值值|r|=0.9949>0.980TD（>3600s）>Tλ20倍回收收率40倍回收收率80倍回收收率試驗(yàn)有有效試驗(yàn)有有效有干擾擾有干擾擾無(wú)干擾擾2022/12/29434））干干擾擾試試驗(yàn)驗(yàn)根據(jù)據(jù)干干擾擾初初篩篩試試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)結(jié)果果，，確確定定選選擇擇供供試試品品的的無(wú)無(wú)干干擾擾濃濃度度選擇擇3批批供供試試品品進(jìn)進(jìn)行行干干擾擾驗(yàn)驗(yàn)證證試試驗(yàn)驗(yàn)溶液液的的制制備備方方法法與與干干擾擾初初篩篩試試驗(yàn)驗(yàn)相相同同有干干擾擾不理理想想無(wú)干干擾擾2022/12/2944溶液液的的制制備備A為稀稀釋釋倍倍數(shù)數(shù)不不超超過(guò)過(guò)MVD的供供試試品品溶溶液液B為加加入入m內(nèi)毒毒素素且且與與A溶液液有有相相同同稀稀釋釋倍倍數(shù)數(shù)的的供供試試品品溶溶液液C為用用于于制制備備標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線的的內(nèi)內(nèi)毒毒素素標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)溶溶液液D為陰陰性性對(duì)對(duì)照照編號(hào)內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無(wú)供試品溶液不少于2個(gè)B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的濃度（設(shè)為λm）供試品溶液不少于2個(gè)C至少3個(gè)濃度（最低點(diǎn)設(shè)定為λ）檢查用水每一濃度不少于2個(gè)D無(wú)檢查用水不少于2個(gè)2022/12/2945反應(yīng)項(xiàng)目目設(shè)置3批樣品品都在同同一濃度度做干擾擾驗(yàn)證試試驗(yàn)每濃度平平行2管管溶液編號(hào)項(xiàng)目平行管D陰性對(duì)照OOC內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOA1S80OOB1S80E0.25OOA2S80OOB2S80E0.25OOA3S80OOB3S80E0.25OO2022/12/2946接受標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)藥典要求求1、陰性性對(duì)照的的反應(yīng)時(shí)時(shí)間（TD）大于標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線線最低濃濃度的反反應(yīng)時(shí)間間（Tλ）2、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線的的相關(guān)系系數(shù)|r|≥0.9803、各批批樣品的的回收率率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議議值4、變異異系數(shù)CV%<10%2022/12/29475）檢查查法（日日常檢查查）根據(jù)干擾擾試驗(yàn)結(jié)結(jié)果，選選擇無(wú)干干擾的供供試品濃濃度進(jìn)行行BET日常檢查查各反應(yīng)溶溶液的制制備及反反應(yīng)項(xiàng)目目設(shè)置與與干擾試試驗(yàn)相同同溶液編號(hào)項(xiàng)目平行管D陰性對(duì)照OOC內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOAS80OOBS80E0.25OO2022/12/2948結(jié)果判斷斷藥典要求求1、陰性性對(duì)照的的反應(yīng)時(shí)時(shí)間(TD)大于標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線線最低濃濃度的反反應(yīng)時(shí)間間(Tλ)2、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線的的相關(guān)系系數(shù)|r|≥0.9803、各批批樣品的的回收率率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議議值4、變異異系數(shù)CV%<10%若供試品品溶液A所有平行行管的內(nèi)內(nèi)毒素濃濃度平均均值乘以以稀釋倍倍數(shù)后，，小于規(guī)規(guī)定的內(nèi)內(nèi)毒素限限值，判判供試品品符合規(guī)規(guī)定，否否則判供供試品不不符合規(guī)規(guī)定無(wú)復(fù)測(cè)要要求2022/12/29494、終點(diǎn)點(diǎn)比色法法BET原理當(dāng)鱟試驗(yàn)驗(yàn)的顯色色反應(yīng)到到達(dá)預(yù)設(shè)設(shè)的反應(yīng)應(yīng)終止時(shí)時(shí)間（T0)時(shí)，反應(yīng)應(yīng)混合液液的吸光光度值（（OD）與內(nèi)毒素素濃度（（C）成正比，，利用標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒毒素建立立OD-C的標(biāo)準(zhǔn)曲曲線，利利用標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線定定量測(cè)定定供試品品的內(nèi)毒毒素含量量。儀器分光光度度計(jì)酶標(biāo)儀37℃恒恒溫儀2022/12/2950試驗(yàn)程序1.試驗(yàn)驗(yàn)準(zhǔn)備：儀儀器及用具具等2.確定定藥品的細(xì)細(xì)菌內(nèi)毒素素限值（L）3.選擇擇終點(diǎn)比色色法試劑盒盒終點(diǎn)比色法法鱟試劑顯色基質(zhì)（（底物）工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)內(nèi)毒素（CSE）4.計(jì)算算供試品的的最大有效效稀釋（MVD）或最低有效效濃度（MVC）5.標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線的可可靠性試驗(yàn)驗(yàn)6.干擾擾試驗(yàn)（驗(yàn)驗(yàn)證）7.檢查查法（日常常檢查）2022/12/2951終點(diǎn)比色法法日常檢查查舉例試劑及器具具終點(diǎn)比色法試劑盒終點(diǎn)比色法試劑

顯色基質(zhì)（底物）

工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）酶標(biāo)儀405nm微孔平板96孔，無(wú)熱原微孔平板恒溫器提供37℃恒溫環(huán)境供試品（S）生理鹽水，L=0.5EU/ml2022/12/2952試驗(yàn)步驟1、開(kāi)啟微孔平平板恒溫器器預(yù)熱2、溶液C的制備根根據(jù)試劑盒盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃濃度要求，，制備標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)內(nèi)毒素系系列溶液，，如1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、及0.125EU/ml（λ）；3、溶液A、B的制備MVD=L/λ=0.5/0.125=4（倍）將供試品稀稀釋到S2、S4（溶液A）

0.6mlS2+0.6E1.01.2mlS4E0.5（溶液B）2022/12/29534、反應(yīng)項(xiàng)項(xiàng)目設(shè)置置溶液編號(hào)項(xiàng)目平行管D陰性對(duì)照OOC內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)(EU/mL)E0.125OOE0.25OOE0.5OOE1OOAS4OOBS4E0.5OO2022/12/29545、取微孔平平板放到到37℃℃恒溫器器上；每每孔加0.05ml相應(yīng)溶液液（A、B、、C及D溶液），，每濃度度溶液平平行2孔孔；加樣樣完畢恒恒溫孵育育5分鐘鐘*；6、復(fù)溶鱟試試劑及顯顯色基質(zhì)質(zhì)（底物物）；7、每孔加入入0.05ml鱟試劑，，恒溫7分鐘*；8、每孔加入入0.1ml顯色基質(zhì)質(zhì)溶液，，恒溫5分鐘*；9、每孔加入入0.1ml終止液；；*此時(shí)間間根據(jù)終終點(diǎn)比色色試劑盒盒使用說(shuō)說(shuō)明書(shū)要要求確定定2022/12/295510、把微微孔孔平平板板放放入入酶酶標(biāo)標(biāo)儀儀中中用用405nm波長(zhǎng)長(zhǎng)測(cè)測(cè)吸吸光光度度值值；；11、根據(jù)據(jù)各各內(nèi)內(nèi)毒毒素素濃濃度度對(duì)對(duì)應(yīng)應(yīng)的的吸吸光光度度值值建建立立內(nèi)內(nèi)毒毒素素濃濃度度與與吸吸光光度度值值的的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線；；12、利用用標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線計(jì)計(jì)算算A、、B溶液液的的內(nèi)內(nèi)毒毒素素含含量量及及供供試試品品的的回回收收率率。。此此計(jì)計(jì)算算一一般般由由儀儀器器自自動(dòng)動(dòng)進(jìn)進(jìn)行行。。判判斷斷實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)的的有有效效性性與與動(dòng)動(dòng)態(tài)態(tài)濁濁度度法法相相同同。。2022/12/29569、靜夜四無(wú)無(wú)鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨中黃黃葉樹(shù)，，燈下白白頭人。。。03:52:1903:52:1903:5212/29/20223:52:19AM11、以我獨(dú)沈沈久，愧君君相見(jiàn)頻。。。12月-2203:52:1903:52Dec-2229-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。03:52:1903:52:1903:52Thursday,December29,202213、乍見(jiàn)見(jiàn)翻疑疑夢(mèng)，，相悲悲各問(wèn)問(wèn)年。。。12月月-2212月月-2203:52:1903:52:19December29,202214、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國(guó)見(jiàn)見(jiàn)青山。。。29十十二月20223:52:19上午午03:52:1912月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月223:52上上午午12月月-2203:52December29,202216、行行動(dòng)動(dòng)出出成成果果，，工工作作出出財(cái)財(cái)富富。。。。2022/12/293:52:1903:52:1929December202217、做前，能能夠環(huán)視四四周；做時(shí)時(shí)，你只能能或者最好好沿著以腳腳為起點(diǎn)的的射線向前前。。3:52:19上上午3:52上上午03:52:1912月-229、沒(méi)有有失敗敗，只只有暫暫時(shí)停停止成成功?。?。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、很多多事情情努力力了未未必有有結(jié)果果，但但是不不努力力卻什什么改改變也也沒(méi)有有。。。03:52:1903:52:1903:5212/29/20223:52:19AM11、成功功就是是日復(fù)復(fù)一日日那一一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小小努力力的積積累。。。12月月-2203:52:1903:52Dec-2229-Dec-2212、世間間成事事，不不求其其絕對(duì)對(duì)圓滿滿，留留一份份不足足，可可得無(wú)無(wú)限完完美。。。03:52:1903:52:1903:52Thursday,December29,202213、不知香香積寺，，數(shù)里入入云峰。。。12月-2212月-2203:52:1903:52:19December29,202214、意意志志堅(jiān)