發(fā)酵工程 發(fā)酵工業(yè)無菌技術(shù)

4發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)思考題1、發(fā)酵工業(yè)中污染雜菌的危害及其預(yù)防措施2、滅菌、消毒、除菌與防腐3、滅菌的常用方法及其機(jī)理4、濕熱滅菌的理論計(jì)算5、空氣滅菌的常用方法6、簡述好氧發(fā)酵無菌空氣制備的工藝流程與要求。什么是染菌？發(fā)酵過程中除了生產(chǎn)菌以外，還有其它菌生長繁殖。一、發(fā)酵工業(yè)的無菌處理

滅菌（sterilization）是指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過程。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。消毒（disinfection）是指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除病原微生物的過程，它一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞而不能殺滅細(xì)菌芽孢。消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。除菌（degerming）是用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。防腐（antisepsis）就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。如低溫、缺氧、干燥、高滲、添加防腐劑等。1）由于雜菌污染，使發(fā)酵培養(yǎng)基因雜菌的消耗而損失，造成產(chǎn)率的下降；2）由于雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或染菌后發(fā)酵液某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成得率降低或使產(chǎn)品質(zhì)量下降；3）污染的雜菌可能會分解產(chǎn)物而使生產(chǎn)失??；二、雜菌污染的危害

4）污染的雜菌大量繁殖，會改變反應(yīng)介質(zhì)的pH，從而使生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生異常變化；5）發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被裂解而使生產(chǎn)失敗等。三、發(fā)酵污染及其危害的具體分析

1、染菌對不同菌種發(fā)酵的影響

細(xì)菌：發(fā)酵周期短，主要防止噬菌體的污染；營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌：生長能力差，所需培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，易受生長較快雜菌的污染；霉菌：發(fā)酵周期較長，易染菌。對于有機(jī)酸發(fā)酵，中、后期pH較低不易發(fā)生染菌；酵母：易受生長較快的細(xì)菌及野生酵母的污染。

放線菌由于生長的最適pH為7左右，因此染細(xì)菌為多，而霉菌生長pH為5左右，因此染酵母菌為多。青霉素發(fā)酵染菌，絕大多數(shù)雜菌都能直接產(chǎn)生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導(dǎo)而產(chǎn)生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，染有能產(chǎn)生青霉素酶的雜菌，都能使青霉素迅速破壞。不同產(chǎn)品鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素等雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不同程度的危害。如雜菌大量消耗營養(yǎng)干擾生產(chǎn)菌的正常代謝；改變pH，降低產(chǎn)量。灰黃霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌，對細(xì)菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。不同產(chǎn)品對疫苗生產(chǎn)危害很大?，F(xiàn)在疫苗多采用深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用的產(chǎn)品，在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內(nèi)外毒素，都應(yīng)全部廢棄。因此，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后的損失也越大。2、污染不同同種類和性性質(zhì)的微生生物的影響響（1）污染噬菌菌體噬菌體的感感染力很強(qiáng)強(qiáng)，傳播蔓蔓延迅速，，也較防治治，故危害害極大。污污染噬菌體體后，可使使發(fā)酵產(chǎn)量量大幅度下下降，嚴(yán)重重的造成斷斷種，被迫迫停產(chǎn)。（2）污染其它它雜菌有些雜菌會會使生產(chǎn)菌菌自溶產(chǎn)生大量泡泡沫，即使使添加消泡泡劑也無法法控制逃液液，影響發(fā)發(fā)酵過程的的通氣攪拌拌。有的雜菌會會使發(fā)酵液液發(fā)臭、發(fā)發(fā)酸，致使使pH下降，使不耐酸酸的產(chǎn)品破破壞。特別是染芽芽孢桿菌，，由于芽孢孢耐熱，不不易殺死，，往往一次次染菌后會會反復(fù)染菌菌。由于接種量量較小，生生產(chǎn)菌生長長一開始不不占優(yōu)勢，，而且培養(yǎng)基營養(yǎng)養(yǎng)豐富，容易污染雜雜菌。種子染菌對對發(fā)酵危害害極大，應(yīng)應(yīng)嚴(yán)格控制制種子染菌菌，如在此階段段染菌，應(yīng)應(yīng)將培養(yǎng)液液全部廢棄棄。3、不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵酵的影響（1）種子培養(yǎng)養(yǎng)期染菌（2）發(fā)酵前期期染菌發(fā)酵前期最最易染菌。。原因發(fā)酵前期菌菌量不很多多，與雜菌沒有有競爭優(yōu)勢勢；且還未合成成產(chǎn)物（抗抗生素）或或產(chǎn)生很少少，抵御雜菌能能力弱。在這個時期期要特別警警惕以防止止染菌的發(fā)發(fā)生。措施可以用降低低培養(yǎng)溫度度，調(diào)整補(bǔ)補(bǔ)料量，用用酸堿調(diào)pH值，縮短培培養(yǎng)周期等等措施予以以補(bǔ)救。如如果前期染染菌，且培培養(yǎng)基養(yǎng)料料消耗不多多，可以重重新滅菌，，補(bǔ)加一些些營養(yǎng)，重重新接種再再用。發(fā)酵中期染染菌，處理理困難，危危害很大。。（3）發(fā)酵中期期染菌發(fā)酵中期染染菌會嚴(yán)重重干擾產(chǎn)生生菌的代謝謝。雜菌大大量產(chǎn)酸，，培養(yǎng)液pH下降；糖、、氮消耗快快，發(fā)酵液液發(fā)粘，菌菌絲自溶，，產(chǎn)物分泌泌減少或停停止，有時時甚至?xí)故挂旬a(chǎn)生的的產(chǎn)物分解解。有時也也會使發(fā)酵酵液發(fā)臭，，產(chǎn)生大量量泡沫。措施降溫培養(yǎng)，，減少補(bǔ)料料，密切注注意代謝變變化情況。。如果發(fā)酵酵單位到達(dá)達(dá)一定水平平可以提前前放罐，或或者抗生素素生產(chǎn)中可可以將高單單位的發(fā)酵酵液輸送一一部分到染染菌罐，抑抑制雜菌。。（4）發(fā)酵后期期染菌發(fā)酵后期發(fā)發(fā)酵液內(nèi)已已積累大量量的產(chǎn)物，，特別是抗抗生素，對對雜菌有一一定的抑制制或殺滅能能力。因此此如果染菌菌不多，對對生產(chǎn)影響響不大。如如果染菌嚴(yán)嚴(yán)重，又破破壞性較大大，可以提提前放罐。。4、雜菌污染染對發(fā)酵產(chǎn)產(chǎn)物提取和和產(chǎn)品質(zhì)量量的影響1）發(fā)酵染菌菌對過濾的的影響染菌的發(fā)酵酵液一般發(fā)發(fā)粘，菌體體大多數(shù)自自溶，所以以在發(fā)酵液液過濾時不不能或很難難形成濾餅餅，導(dǎo)致過濾困難。污染雜菌的的種類對過過濾的影響響程度有差差異，如污污染霉菌時時，影響較較小，而污污染細(xì)菌時時很難過濾濾。由于過過濾困難，，過濾時間間拉長，影響發(fā)酵液液儲罐和過過濾設(shè)備的的周轉(zhuǎn)使用用，破壞了生產(chǎn)產(chǎn)平衡。染染菌發(fā)酵液液還會因過過濾困難而而大幅度降低低過濾收率率，直接影響提提取總收率率。2）發(fā)酵染菌菌對提取的的影響染菌發(fā)酵液液中含有比比正常發(fā)酵酵液更多的的水溶性蛋蛋白和其它它雜質(zhì)。采用有機(jī)溶溶劑萃取的的提煉工藝藝，則極易易發(fā)生乳化化，很難使使水相和溶溶劑相分離離，影響進(jìn)進(jìn)一步提純純。采用直接用用離子交換換樹脂的提提取工藝，，如鏈霉素素、慶大霉霉素，染菌菌后大量雜雜菌黏附在在離子交換換樹脂表面面，或被離離子交換樹樹脂吸附，，大大降低低離子交換換樹脂的交交換容量，，而且有的的雜菌很難難用水沖洗洗干凈，洗洗脫時與產(chǎn)產(chǎn)物一起進(jìn)進(jìn)入洗脫液液，影響進(jìn)進(jìn)一步提純純。四、雜菌污污染的防治治1、染菌的檢檢查顯微鏡檢查查法：平板劃線培培養(yǎng)檢查法法：肉湯培養(yǎng)檢檢查法：發(fā)酵過程的的異常現(xiàn)象象觀察法：：溶解氧、、pH、尾氣中的的CO2含量、發(fā)酵酵液黏度、、顏色等的的異常變化化，都可能能是發(fā)生染染菌的重要要信息。溶解氧水平平的異常變變化污染好氧性性雜菌，溶溶解氧在短短時間內(nèi)下下降，并接接近零值，，長時間不不能回升；；污染非好好氧性雜菌菌，生產(chǎn)菌菌受到抑制制，耗氧量量減少，溶溶解氧升高高。pH異常對于污染產(chǎn)產(chǎn)酸菌或利利用碳源效效率高生長長較快的雜雜菌，會使使pH迅速下降。。尾氣中CO2含量異常污染雜菌，，糖耗加快快，CO2含量增加；；感染噬菌菌體，糖耗耗減慢，CO2含量減少。。2、污染的原原因分析染菌的原因因復(fù)雜，包包括種子帶帶菌、空氣氣帶菌、設(shè)設(shè)備滲漏、、培養(yǎng)基或或補(bǔ)料液滅滅菌不徹底底、操作失失誤、技術(shù)術(shù)管理不善善等。日本工業(yè)技技術(shù)院發(fā)酵酵研究所多多年來抗生生素發(fā)酵染染菌原因分分析項(xiàng)目百百分分率%種子帶菌或或懷疑種子子帶菌9.64接種時罐壓壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌菌不透0.79總空氣系統(tǒng)統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲滲漏10.13操作原因10.15原因不明24.941）從污染雜雜菌的種類類分析污染耐熱芽芽孢桿菌：：培養(yǎng)基或或設(shè)備滅菌菌不徹底；；污染不耐熱熱雜菌：種種子帶菌、、空氣除菌菌不徹底、、設(shè)備滲漏漏或操作問問題；污染淺綠色色菌落雜菌菌：冷卻盤盤管滲漏引引起；污染霉菌：：無菌室滅滅菌不徹底底，或操作作問題；污染酵母菌菌：糖液滅滅菌不徹底底。2）從污染時時間分析發(fā)酵前期染染菌：種子子帶菌、培培養(yǎng)基或設(shè)設(shè)備滅菌不不徹底、操操作不當(dāng)或或空氣帶菌菌；發(fā)酵后期染染菌：中間間補(bǔ)料污染染、設(shè)備滲滲漏或操作作問題。3）從染菌程程度分析多個罐染菌菌：種子帶帶菌、空氣氣系統(tǒng)問題題；個別罐染菌菌：設(shè)備問問題、操作作不當(dāng)。3、雜菌污染染的途徑及及其預(yù)防措措施1）種子帶菌種子帶菌又又分為種子子本身帶菌菌和種子培培養(yǎng)過程中中染菌。加加強(qiáng)種子管管理，嚴(yán)格格無菌操作作，種子本本身帶菌是是可以克服服的。種子子培養(yǎng)過程程染菌與發(fā)發(fā)酵一樣有有許多因素素造成。防止種子帶帶菌制備種子時時對沙土管管及搖瓶嚴(yán)嚴(yán)格加以控控制。沙土制備時時要多次間間歇滅菌注意接種時時的無菌操操作子瓶、母瓶瓶的移種和和培養(yǎng)無菌室和搖搖床間都要要保持清潔潔。無菌室室內(nèi)要供給給恒溫恒濕濕的無菌空空氣，還要要裝紫外燈燈用以滅菌菌，或用化化學(xué)藥品滅滅菌。無菌室要求求在無菌室中中裝有紫外外燈，打開開紫外燈，，照半小時時，關(guān)燈后后15分鐘再接種種。用消毒藥水水如新潔而而滅配成1/1000濃度擦桌子子、拖地，，開啟超凈凈臺的通風(fēng)風(fēng)，接種時必須須在超凈臺臺上操作，，超凈臺裝裝有一臺鼓鼓風(fēng)機(jī)，進(jìn)進(jìn)風(fēng)口有一一粗過濾器器，出風(fēng)口口有高效過過濾器，保保證無菌風(fēng)風(fēng)從超凈臺臺吹出，外外界有菌空空氣不可能能進(jìn)入接種種區(qū)域，保保證無菌條條件。接種人員必必須穿好無無菌服，戴戴好口罩，，手用酒精精棉球擦干干凈。2）空氣帶菌菌從日本工業(yè)業(yè)技術(shù)院分分析空氣帶帶菌而造成成的染菌為為19.96％。國內(nèi)外外空氣除菌菌技術(shù)雖已已有較大改改善，但仍仍然沒有使使染菌率降降低到理想想的程度。。因?yàn)榭諝鈿獬到y(tǒng)統(tǒng)較為復(fù)雜雜，環(huán)節(jié)多多，偶遇不不慎便會導(dǎo)導(dǎo)致空氣除除菌失敗。。防止空氣引引起的染菌菌空氣過濾除除菌設(shè)備流流程空壓機(jī)儲罐二級冷卻加熱器空氣過濾器器粗過濾空氣冷卻器器的列管穿穿孔泄露，，冷卻水會會滲入到空空氣中，造造成染菌。。棉花-活性炭過濾濾器長期使使用后，棉棉花和活性性炭的體積積被壓縮而而松動，如如果上下端端棉花鋪得得厚薄不均均，厚的一一邊阻力大大空氣不暢暢通，薄的的一邊空氣氣容易通過過，久而久久之，薄的的一邊長期期受空氣頂頂吹而使棉棉花活性炭炭改變位置置，造成過過濾器失效效。過濾器用蒸蒸汽滅菌時時，若被蒸蒸汽冷凝水水潤濕就會會降低或喪喪失過濾效效能，滅菌菌完畢應(yīng)立立即緩慢通通入壓縮空空氣，將水水分吹干。。3）設(shè)備滲漏漏設(shè)備滲漏包包括夾套穿穿孔、盤管管穿孔、接接種管穿孔孔、閥門滲滲漏、攪拌拌軸滲漏、、罐蓋漏和和其它設(shè)備備漏等。從從日本工業(yè)業(yè)技術(shù)院發(fā)發(fā)酵研究所所對染菌原原因分析發(fā)發(fā)現(xiàn)，這類類染菌占33.85％。所以說說加強(qiáng)設(shè)備備本身及附附屬零部件件的嚴(yán)密度度檢查，對對制服染菌菌是極其主主要的，也也是重要的的。防止設(shè)備滲滲漏發(fā)酵設(shè)備及及附件由于于化學(xué)腐蝕蝕、電化學(xué)學(xué)腐蝕，物物料與設(shè)備備摩擦造成成機(jī)械磨損損以及加工工制作不良良等原因會會導(dǎo)致設(shè)備備及附件滲滲漏。設(shè)備上一旦旦滲漏，就就會造成染染菌，例如如冷卻盤管管、夾套穿穿孔滲漏，，有菌的冷冷卻水便會會通過漏孔孔而進(jìn)入發(fā)發(fā)酵罐中招招致染菌。。閥門滲漏漏也會使帶帶菌的空氣氣或水進(jìn)入入發(fā)酵罐而而造成染菌菌。設(shè)備上的漏漏隙如果肉肉眼能看見見，容易發(fā)發(fā)現(xiàn)，也容容易治理；；但有的微微小泄漏，，肉眼看不不見，必須須通過一定定的試漏方方法才能發(fā)發(fā)現(xiàn)。試漏方法可可采用水壓試漏法法。即被測設(shè)設(shè)備的出口口處裝上壓壓力表，將將水壓入設(shè)設(shè)備，待設(shè)設(shè)備中壓力力上升到要要求壓力，，關(guān)閉進(jìn)出出水，看壓壓力有否下下降。壓力力下降則有有滲漏。但但有些滲漏漏很小，看看不出何處處漏水，可可以用稀堿堿溶液壓入入設(shè)備，然然后用蘸有有酚酞的紗紗布揩，只只要酚酞能能變紅處即即為滲漏處處。閥門滲漏漏可以用用集氣桶來試漏。。方法是是先在集集氣桶中中裝滿水水，然后后關(guān)閉所所有閥門門，向發(fā)發(fā)酵罐中中通入空空氣，使使罐壓上上升到要要求壓力力，一般般一公斤斤以上。。由于集集氣桶連連通各管管道，觀觀察哪根根管子冒冒泡，即即這根管管子的閥閥門漏氣氣。4）滅菌不不徹底滅菌技術(shù)術(shù)的好壞壞與滅菌菌質(zhì)量很很有關(guān)系系蒸汽通入入培養(yǎng)基基。升溫快慢慢、保溫溫時間、泡沫的的產(chǎn)生；；蒸汽總壓壓是否達(dá)達(dá)到要求求標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中的的雜菌數(shù)量量因季節(jié)節(jié)而有很很大差別別。如上海海第四制制藥廠在在卡那霉霉素生產(chǎn)產(chǎn)中，于于炎熱的的夏季將將連續(xù)滅滅菌預(yù)熱熱至800C的培養(yǎng)基基采樣培培養(yǎng)，可可發(fā)現(xiàn)無無法計(jì)數(shù)數(shù)的大量量的芽孢孢桿菌；；而在冬冬季取樣樣的培養(yǎng)養(yǎng)中，則則僅發(fā)現(xiàn)現(xiàn)2～3個芽孢桿桿菌。原材料儲儲存和保管，，如液胨胨、玉米米漿、母母液糖等等有機(jī)原原料——雜菌的數(shù)數(shù)量發(fā)酵罐、、培養(yǎng)基基配制罐罐等設(shè)備備的清洗洗質(zhì)量——有無滅菌菌的死角角對減少少或避免免染菌仍仍然是十十分必要要的。五、發(fā)酵酵工業(yè)的的無菌技技術(shù)1．化學(xué)試試劑滅菌菌法：常用試劑劑有甲醛醛、氯氣氣（或次次氯酸鈉鈉）、高高錳酸鉀鉀、環(huán)氧氧乙烷、、季銨鹽鹽（如新新潔爾滅滅）、臭臭氧等。。這些物物質(zhì)易與與微生物物細(xì)胞中中的一些些成分產(chǎn)產(chǎn)生化學(xué)學(xué)反應(yīng)，，如使蛋蛋白質(zhì)變變性、酶酶類失活活、破壞壞細(xì)胞膜膜通透性性而殺滅滅微生物物。由于化學(xué)學(xué)試劑也也會與培培養(yǎng)基中中的一些些成分作作用，而而且加入入培養(yǎng)基基后不易易去除，，它不能能用于培培養(yǎng)基的的滅菌，，但染菌菌后的培培養(yǎng)基可可用化學(xué)學(xué)藥劑處處理。2．輻射滅滅菌：利用高能能量的電電磁輻射射和微粒粒輻射來來殺滅微微生物。。如紫外外線（穿穿透力低低，僅適適用于表表面消毒毒和空氣氣消毒））與菌體體核酸的的光化學(xué)學(xué)反應(yīng)而而使菌體體死亡；；（0.01-0.14nm）的X射線、Co60產(chǎn)生的γ射線，它它們含極極高的能能量，可可使菌體體內(nèi)的水水和有機(jī)機(jī)物產(chǎn)生生強(qiáng)烈的的離子化化反應(yīng)，，形成OH-、H2O2和有機(jī)過過氧化物物，從而而在微生生物體內(nèi)內(nèi)引起氧氧化連鎖鎖反應(yīng)，，導(dǎo)致微微生物菌菌體迅速速死亡。。近年興興起了微微波滅菌菌。3．過濾除除菌法適用于澄澄清液體體和氣體體的除菌菌。是將液體體或氣體體用微孔孔薄膜過過濾，使使大于孔孔徑的細(xì)細(xì)菌等微微生物顆顆粒阻留留，從而而達(dá)到除除菌目的的。用于于遇熱容容易變性性而失效效的試劑劑或培養(yǎng)養(yǎng)液。4．高溫滅滅菌法：：1）干熱滅滅菌法160℃℃下保溫1-2小時。干干熱對微微生物有有氧化、、使細(xì)胞胞蛋白質(zhì)質(zhì)變性和和電解質(zhì)質(zhì)濃縮等等效應(yīng)而而使菌體體死亡。。2）火焰滅滅菌法滅菌徹底底，但僅僅適用于于接種針針、玻璃璃棒、三三角瓶口口等的滅滅菌。3）濕熱滅滅菌法(工業(yè)上的的蒸氣滅滅菌裝置置)：濕熱滅菌菌要比干干熱滅菌菌更有效效，這一一方面是是由于濕濕熱易于于傳遞熱熱量，蒸蒸汽具有有很強(qiáng)的的穿透能能力，而而且在冷冷凝時會會放出大大量的冷冷凝熱，，另一方方面是由由于濕熱熱更易破破壞保持持蛋白質(zhì)質(zhì)穩(wěn)定性性的氫鍵鍵等結(jié)構(gòu)構(gòu)，從而而加速其其變性。。很容易易使蛋白白質(zhì)凝固固而殺死死各種微微生物。。一般的的濕熱滅滅菌條件件：121℃℃，30min。高壓蒸汽汽滅菌是是發(fā)酵工工業(yè)最常常用的方方法，能能有效地地殺滅雜雜菌，但但高溫也也破壞培培養(yǎng)基的的營養(yǎng)成成分。消除高溫溫有害影影響的措措施（1）對易破破壞的含含糖培養(yǎng)養(yǎng)基進(jìn)行行滅菌時時，應(yīng)先先將糖液液與其他他成分分分別滅菌菌后再合合并；（2）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基基與磷酸酸鹽先作作分別滅滅菌，然然后再混混合，就就不易形形成磷酸酸鹽沉淀淀；（3）對含有有在高溫溫下易破破壞成分分的培養(yǎng)養(yǎng)基（如如含糖組組合培養(yǎng)養(yǎng)基）可可進(jìn)行低低壓滅菌菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸寸2下滅菌15分鐘）或或間歇滅滅菌；（4）在大規(guī)規(guī)模發(fā)酵酵工業(yè)中中，可采采用連續(xù)續(xù)加壓滅滅菌法進(jìn)進(jìn)行培養(yǎng)養(yǎng)基的滅滅菌。4)間歇滅菌菌法，又又稱丁達(dá)達(dá)爾滅菌菌法或分分段滅菌菌法。適適用于不不耐熱培培養(yǎng)基的的滅菌。。方法是：：將待滅滅菌的培培養(yǎng)基在在80～100℃下蒸煮15～60分鐘，以以殺死其其中所有有微生物物的營養(yǎng)養(yǎng)細(xì)胞，，然后置置室溫或或37℃下保溫過過夜，誘誘導(dǎo)殘留留的芽孢孢發(fā)芽，，第二天天再以同同法蒸煮煮和保溫溫過夜，，如此連連續(xù)重復(fù)復(fù)3天，即可可在較低低溫度下下達(dá)到徹徹底滅菌菌的效果果。滅菌設(shè)備備高壓蒸汽汽滅菌生產(chǎn)中使使用高壓壓蒸汽滅滅菌鍋的的型號很很多：手提式滅滅菌鍋立式或臥臥式滅菌菌鍋大型滅菌鍋六、發(fā)酵酵培養(yǎng)基基與設(shè)備備管道滅滅菌某些分子子的分解解和分子子內(nèi)部的的重新排排列的反反應(yīng)屬于于單分子子反應(yīng)。。雜菌雖然然是一個個復(fù)雜的的高分子子體系，，但其受受熱被殺殺死，主主要原因因是高溫溫能使蛋蛋白質(zhì)變變性，這這種反應(yīng)應(yīng)屬與單單分子反反應(yīng)，因因此雜菌菌在一定定溫度下下受熱死死亡也遵遵循單分分子反應(yīng)應(yīng)方程。。1、濕熱滅滅菌原理理對微生物物進(jìn)行濕濕熱滅菌菌時，培培養(yǎng)基中中的微生生物受熱熱死亡的的速率與與殘存的的微生物物數(shù)量成成正比，，即式中，N為培養(yǎng)基基中活微微生物的的個數(shù)；；t為微生物物受熱時時間；k為比死亡亡速率。。若開始滅滅菌時（（t＝0），培養(yǎng)養(yǎng)基中活活微生物物數(shù)為N0，將上式式積分可可得即隨溫度的的變化，，比死亡亡速率k值有很大大的變化化，溫度度對k的影響遵遵循阿侖侖尼烏斯斯定律。。或A－阿累尼尼烏斯常常數(shù)，1/s，對指定定反應(yīng)來來說為一一常數(shù)；；E－反應(yīng)的的活化能能；R－摩爾氣氣體常數(shù)數(shù)；T－熱力學(xué)學(xué)溫度。。由實(shí)驗(yàn)測測得一微微生物死死亡反應(yīng)應(yīng)在一系系列不同同溫度時時的k值，以對對作作圖，，可得一一直線。。直線的的斜率為為，，截距為為，，可求得得該反應(yīng)應(yīng)的活化化能。培養(yǎng)基在在滅菌以以前，存存在各種種各樣的的微生物物，它們們的k各不相同同，k值越小，，則此微微生物越越耐熱。。在計(jì)算算時，可可以對熱熱抵抗力力較大的的芽孢桿桿菌的k進(jìn)行計(jì)算算，這時A可以取1.34×1036s-1，E可以取2.844×105J/mol，這樣得得到了只只隨滅菌菌溫度而而變的滅滅菌速率率常數(shù)k的簡化計(jì)計(jì)算公式式，即若要求滅滅菌后絕絕對無菌菌，即N=0，則從上上面公式式可以看看出滅菌菌時間t將等于無無窮大，，這是不不可能的的，故培培養(yǎng)液滅滅菌后，，以在培培養(yǎng)液中中還殘留留一定活活菌數(shù)進(jìn)進(jìn)行計(jì)算算。工程程上，通通常以=10-3個/罐，即雜雜菌污染染降低到到被處理理的每1000罐中只殘殘留1個活菌的的程度，，此數(shù)已已滿足生生產(chǎn)要求求。某發(fā)酵罐罐，內(nèi)裝裝培養(yǎng)基基80m3，在121℃℃下進(jìn)行分分批滅菌菌。設(shè)每每毫升培培養(yǎng)基中中含耐熱熱的芽孢孢為107個，求滅滅菌時間間？影響培養(yǎng)養(yǎng)基滅菌菌的因素素1）pH值的影響響pH值對微生生物的耐耐熱性影影響很大大，pH為6.0－8.0時微生物物最不易易死亡，，pH<6.0時氫離子子易滲入入微生物物的細(xì)胞胞內(nèi)。2）培養(yǎng)基基成分培養(yǎng)基的的成分中中，油脂脂、糖類類、蛋白白質(zhì)都是是傳熱的的不良介介質(zhì)，會會增加微微生物的的耐熱性性，使滅滅菌困難難。濃度較高高的培養(yǎng)養(yǎng)基相對對需要較較高溫度度和較長長時間滅滅菌。高濃度的的鹽類，，色素則則削弱其其耐熱性性，故較較易滅菌菌。3）培養(yǎng)基基中的顆顆粒物質(zhì)質(zhì)培養(yǎng)基中中的顆粒粒物質(zhì)大大，滅菌菌困難，，反之，，滅菌容容易。一一般說來來，含有有顆粒對對培養(yǎng)基基滅菌影影響不大大，但在在培養(yǎng)基基混有較較大顆粒粒，特別別是存在在凝結(jié)成成團(tuán)的膠膠體時，，會影響響滅菌效效果，必必須過濾濾除去。。2、分批滅滅菌培養(yǎng)基的的分批滅滅菌就是是將配制制好的培培養(yǎng)基放放在發(fā)酵酵罐或其其他容器器中，通通入蒸汽汽將培養(yǎng)養(yǎng)基和所所用設(shè)備備一起滅滅菌的操操作過程程，也稱稱實(shí)罐滅滅菌。在工業(yè)上上，培養(yǎng)養(yǎng)基的分分批滅菌菌無需專專門的滅滅菌設(shè)備備，設(shè)備備投資少少，滅菌菌效果可可靠，對對滅菌用用蒸汽要要求低（（0.2-0.3Mpa表壓），，但因其其滅菌溫溫度低、、時間長長而對培培養(yǎng)基成成分破壞壞大，對對操作難難于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)自動控控制。分批滅菌菌的過程程包括升升溫、保保溫和降降溫三個個階段。。1）培養(yǎng)基基的預(yù)熱熱滅菌時培培養(yǎng)基需需通過夾夾套或蛇蛇管先加加熱到80－90℃，然后再再導(dǎo)入蒸蒸汽升溫溫至120－130℃℃。預(yù)熱的的目的一一是防止止直接導(dǎo)導(dǎo)入蒸汽汽時由于于培養(yǎng)基基與蒸汽汽的溫差差過大而而產(chǎn)生大大量冷凝凝水使培培養(yǎng)基稀稀釋；二二是防止止直接導(dǎo)導(dǎo)入蒸汽汽所造成成的泡沫沫急劇上上升而引引起物料料外溢。。2）培養(yǎng)基基滅菌將蒸汽從從進(jìn)氣口口、排料料口或取取樣口直直接導(dǎo)入入罐內(nèi)，，使罐溫溫上升至至120－130℃℃，并保溫溫30min。3）降溫關(guān)閉蒸汽汽，先自自然冷卻卻10分鐘左右右，通冷冷卻水進(jìn)進(jìn)行冷卻卻，當(dāng)罐罐內(nèi)溫度度降至70℃以下時，，啟動攪攪拌槳攪攪拌，慢慢速攪動動培養(yǎng)基基，加速速冷卻。。當(dāng)蒸汽閥閥門關(guān)閉閉以及通通冷卻水水后，發(fā)發(fā)酵罐的的罐壓將將迅速下下降，當(dāng)當(dāng)罐內(nèi)壓壓力降至至0.03MPa時，必須須間隙開開啟進(jìn)氣氣閥，讓讓無菌空空氣進(jìn)入入發(fā)酵罐罐內(nèi)，并并使罐壓壓保持在在0.03-0.05MPa之間，以以罐內(nèi)產(chǎn)產(chǎn)生負(fù)壓壓而吸入入外界空空氣。在在引入無無菌空氣氣前，罐罐內(nèi)壓力力必須低低于空氣氣壓力，，否則罐罐內(nèi)物料料（培養(yǎng)養(yǎng)基）將將倒流進(jìn)進(jìn)行空氣氣過濾器器。滅菌菌時總蒸蒸汽壓力力不低于于0.3-0.4Mpa，使用壓力不不低于0.2Mpa。應(yīng)該指出，在在分批滅菌時時，升溫階段段對滅菌亦是是有貢獻(xiàn)的。。3、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌就是是將配制好的的培養(yǎng)基在通通入發(fā)酵罐時時進(jìn)行加熱、、保溫、降溫溫的滅菌過程程，也稱之為為連消。連續(xù)滅菌時，，培養(yǎng)基在短短時間內(nèi)被加加熱到滅菌溫溫度（一般為為130-140度），短時間間保溫（一般般為5-8min）后，被快速速冷卻，再進(jìn)進(jìn)入早已滅菌菌完畢的發(fā)酵酵罐。組成培養(yǎng)基的的不同成分（（耐熱與不耐耐熱、糖與氮氮源）可在不不同溫度下分分開滅菌，以以減少培養(yǎng)基基受熱破壞的的程度。培養(yǎng)基的連續(xù)續(xù)滅菌具有對對培養(yǎng)基破壞壞小、可以實(shí)實(shí)現(xiàn)自動控制制、提高發(fā)酵酵罐的設(shè)備利利用率、蒸汽汽用量平穩(wěn)等等優(yōu)點(diǎn)而被廣廣泛應(yīng)用，尤尤其在培養(yǎng)基基體積較大時時。但對加熱蒸汽汽的壓力要求求較高，一般般不小于0.45Mpa。同時連續(xù)滅滅菌需要一組組附加設(shè)備，，設(shè)備投資大大。培養(yǎng)基連消工工藝流程圖分批滅菌與連連續(xù)滅菌的比比較滅菌方式優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)連續(xù)滅菌1、滅菌溫度高高，可減少培培養(yǎng)基中營養(yǎng)養(yǎng)物質(zhì)的損失；2、操作條件恒恒定，滅菌質(zhì)質(zhì)量穩(wěn)定；3、易于實(shí)現(xiàn)管管道化和自控控操作；4、避免了反復(fù)復(fù)的加熱和冷冷卻，提高了了熱的利用率；5、發(fā)酵設(shè)備利利用率高；1、對設(shè)備的要要求高，需另另外設(shè)置加熱熱冷卻裝置；2、操作較麻煩煩；3、染菌的機(jī)會會多；4、不適合于含含大量固體物物料的滅菌；；5、對蒸汽的要要求高；分批滅菌1、設(shè)備要求低低，不需另外外的加熱冷卻卻裝置；2、操作要求低，，適于手動操操作；3、適合于小批批量生產(chǎn)規(guī)模模；4、適合于含有有大量固體物物質(zhì)的培養(yǎng)基基的滅菌；1、培養(yǎng)基的營營養(yǎng)物質(zhì)損失失較多，滅菌菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量下下降；2、需進(jìn)行反復(fù)復(fù)的加熱和冷冷卻，能耗較較高；3、不適合于大大規(guī)模生產(chǎn)過過程的滅菌；；4、發(fā)酵罐的利利用率較低；；七、空氣除菌菌好氣性發(fā)酵過過程中需要大大量的無菌空空氣，空氣要要作到絕對無無菌在目前是是不可能的，，也是不經(jīng)濟(jì)濟(jì)的。發(fā)酵對無菌空空氣的要求是是：無菌，，無灰塵，無無雜質(zhì)，無水水，無油，正正壓等幾項(xiàng)指指標(biāo)；發(fā)酵對無菌空空氣的無菌程程度要求是：：只要在發(fā)酵酵過程中不因因無菌空氣染染菌而造成損損失即可。在工程設(shè)計(jì)中中一般要求1000次使用周期中中只允許有一一個菌通過，，即經(jīng)過濾后后空氣的無菌菌程度為N=10-31、空氣除菌的的方法：輻射殺菌熱殺菌靜電除菌過濾除菌2、過濾除菌過濾除菌是使使空氣通過經(jīng)經(jīng)高溫滅菌的的介質(zhì)過濾層層，將空氣中中的微生物等等顆粒阻截在在介質(zhì)層中，，而達(dá)到除菌菌的目的。從可靠性，經(jīng)經(jīng)濟(jì)適用與便便于控制等方方面考慮，目目前仍以介質(zhì)質(zhì)過濾法較好好，也是大多多數(shù)發(fā)酵廠廣廣泛采用的方方法。發(fā)酵生產(chǎn)中制制備無菌空氣氣的大致過程程3、空氣預(yù)處理理1）外源空氣的的前過程主要措施：提提高空氣吸氣氣口的位置和和加強(qiáng)吸入空空氣的前過濾濾。2）空氣壓縮及及壓縮空氣的的冷卻空氣經(jīng)空壓機(jī)機(jī)壓縮后，溫溫度會顯著上上升，壓縮比比愈高，溫度度也愈高。式中T1、T2－壓縮前后空空氣的熱力學(xué)學(xué)溫度；p1、p2－壓縮前后空空氣的絕對壓壓力；k－絕熱指數(shù)，，空氣為1.4。若壓縮為多多變過程，則則可用多變指指數(shù)m（對于空氣m=1.2-1.3）代替絕熱指指數(shù)。3）壓縮空氣冷冷卻后的除水水、除油、再再加熱和穩(wěn)壓壓（儲氣罐））。前置高效過濾濾空氣除菌流流程4、空氣過濾介介質(zhì)1）纖維狀或顆顆粒狀過濾介介質(zhì)：棉花、、玻璃纖維、、活性炭等。。2）過濾紙類介介質(zhì)：主要是是玻璃纖維紙紙。3）石棉濾板：：20%藍(lán)石棉和80%紙漿纖維混合合打漿制成。。4）燒結(jié)材料：：燒結(jié)金屬、、燒結(jié)陶瓷、、燒結(jié)塑料等等。5）微孔濾膜類過過濾介質(zhì)6、提高過濾除除菌效率的措措施1）減少進(jìn)口空空氣的含菌數(shù)數(shù)2）設(shè)計(jì)和安裝裝合理的空氣氣過濾器，選選用除菌效率率高的過濾介介質(zhì)3）設(shè)計(jì)合理的的空氣預(yù)處理理設(shè)備，以達(dá)達(dá)到除油、水水和雜質(zhì)的目目的4）降低進(jìn)入空空氣過濾器的的空氣的相對對濕度，保證證過濾介質(zhì)能能在干燥狀態(tài)態(tài)下工作5）穩(wěn)定壓縮空空氣的壓力，，采用合適容容量的貯氣罐罐發(fā)酵用的無菌菌空氣，是將將自然界的空空氣經(jīng)過壓縮縮、冷卻、除除濕、過濾等等過程，達(dá)到到以下標(biāo)準(zhǔn)：：（1）連續(xù)提供一一定流量的壓壓縮空氣。（2）空氣的壓強(qiáng)強(qiáng)（表壓）為為0.2－0.4Mpa，過低則難于于克服下游的的阻力，過高高則是浪費(fèi)。。（3）進(jìn)入過濾器器前，空氣的的相對濕度小小于70%。（4）進(jìn)入發(fā)酵罐罐的空氣溫度度可比培養(yǎng)溫溫度高10－30℃。（5）壓縮空氣的的潔凈度，在在設(shè)計(jì)空氣過過濾器時，一一般以失敗概概率為10-3為指標(biāo)。作業(yè)：天力生物技術(shù)術(shù)有限公司獲獲得了一株產(chǎn)產(chǎn)蛋白酶的霉霉菌，現(xiàn)需對對其培養(yǎng)基進(jìn)進(jìn)行優(yōu)化，以以提高發(fā)酵酶酶活，請你設(shè)設(shè)計(jì)出試驗(yàn)方方案。9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Wednesday,December28,202210、雨中黃黃葉樹，，燈下白白頭人。。。20:39:5020:39:5020:3912/28/20228:39:50PM11、以我獨(dú)沈沈久，愧君君相見頻。。。12月-2220:39:5020:39Dec-2228-Dec-2212、故人江海海別，幾度度隔山川。。。20:39:5020:39:5020:39Wednesday,December28,202213、乍見翻疑夢夢，相悲各問問年。。12月-2212月-2220:39:5020:39:50December28,202214、他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生白白發(fā)，，舊國國見青青山。。。28十十二二月20228:39:50下下午20:39:5012月月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月228:39下下午午12月月-2220:39December28,202216、行行動動出出成成果果，，工工作作出出財(cái)財(cái)富富。。。。2022/12/2820:39:5020:39:5028December202217、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時時，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點(diǎn)點(diǎn)的射線線向前。。。8:39:50下午午8:39下午午20:39:5012月-229、沒有失敗，，只有暫時停停止成功！。。12月-2212月-22Wednesday,December28,202210、很多事情努努力了未必有有結(jié)果，但是是不努力卻什什么改變