菌種鑒定實驗過程

生土生土生工生物工程（上海）股份有限公司5刊ngondioterhfSh刊ngh君i）Uo“Ltd+菌種鑒定實驗過程一、儀器與試劑1、儀器儀器名稱儀器來源型號測序儀AppliedBiosystems3730XLDNA電泳槽北京六一儀器廠DYCP-31DN穩(wěn)壓電泳儀北京六一儀器廠DYY-5電熱恒溫水槽上海一恒科學儀器有限公司DK-8D凝膠成像儀上海復日科技儀器有限公司FR980恒溫培養(yǎng)箱太倉市科教器材廠DHP-9162恒溫搖床太倉市實驗設備廠TH2-CPCR儀AppliedBiosystems2720thermalcycler冷凍咼速離心機BBIHC-2518RSurf系列精密單道可調移液器牛工SP10-10001.試劑試劑名稱試劑來源cat.No.Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒牛工SK8255Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒牛工SK8259Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒牛工SK8257DreamTaq-TMDNAPolymeraseMBIEP0702dNTP牛工D0056瓊脂糖BBIAB0014SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒牛工SK8131DNALadderMixmaker牛工SM0337引物牛工合成部合成槍頭、PCR管、離心管等牛工鑄塑部生產克隆測序用pMD?8-TVector連接試劑盒TakaraD101ASanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒牛工SK8191二、實驗過程1、基因組DNA提取按SK8255（細菌）、SK8259（真菌）、SK8257（酵母）試劑盒操作。2、PCR擴增2?1菌種鑒定通用引物：所屬類別名稱序列5'一3'擴增序列PCR長度/bp細菌7F1540RCAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA16SrDNA1500bp左右27F1492RAGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT16SrDNA1500bp左右真菌ITS1ITS4TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGATATGC內轉錄間隔區(qū)1和2600bp左右NS1NS6GTAGTCATATGCTTGTCTCGCATCACAGACCTGTTATTGCCTC18SrDNA1300bp左右

2.2PCR反應體系:試劑體積（m）Template(基因組DNA20-50ng/gl)0.510xBuffer(withMg2+)2.5dNTP(各2.5mM)1酶0.2F(10uM)0.5R(10uM)0.5加雙蒸h2o至252.3PCR循環(huán)條件：溫度時間程序94°C4min預變性94°C45sec30cycle55C45sec72C1min72C10min修復延伸4Cg終止反應3、凝膠電泳1%瓊脂糖電泳，150V、100mA20min電泳觀察（見電泳圖DNALadderMixmake）。16SrDNA18SrDNA ITS 26S”燦［】t5U(MJsoooSL-CK1KODOiat?j”燦［】t5U(MJsoooSL-CK1KODOiat?jsaci加o?aacon■?ao4、純化回收PCR產物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，純化方式見附見說明書（SK8131）,PCR產物用PCR引物直接測序。如需要做克隆測序需要進行下面的步驟：5、連接按TakarapMD?8-TVector連接試劑盒操作。6、感受態(tài)細胞的制備：（氯化鈣法）6.1從于37°C培養(yǎng)16小時的新鮮平板中挑取一個單菌落，轉到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37C劇烈振搖培養(yǎng)3小時（旋轉搖床，300轉/分）。

生土生工生物工程（上海）股份有限公司生土5刊npondioterhfSh刊ngh君i）Uo“Ltd+6.2在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°C。6.3于4C,以4000轉/分離心10分鐘，回收細胞。6.4倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。6.5以10ml用冰預冷的0.1mol/LCaC12重懸每份沉淀，放置于冰浴上。6.6于4C,,以4000轉/分離心10分鐘，回收細胞。6.7倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。6.8每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預冷的0.1mol/LCaCl2（含20%甘油）重懸每份細胞沉淀。6.9將細胞分裝成小份（100卩"支），放于-70C凍存。7、 連接產物轉化7.1取100山感受態(tài)細胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。7.2加入10山連接液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。7.342C水浴熱激90秒。冰上放置15~20分鐘。7.4加400plLB培養(yǎng)基，37C200?250rpm振蕩培養(yǎng)1小時。7.5用槍頭吸取200山培養(yǎng)菌液，涂布在預先用20山100mMIPTG和100山20mg/mlX-gal涂布的氨芐青霉素平板上。7.6平板在37C下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜。8、 藍白斑篩選當外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產物卩-半乳糖苷酶片段的活性，因此重組克隆在X-gal/IPTG平板上呈現為白色，而非重組克隆呈藍色，選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，9、 質粒提取與測序用M13+_引物擴增（體系如上）。.M13+/-引物測序三、測序結果分析16SrDNA序列在核糖體數據庫/index.jsp上比對；比對結果范例：domainBacteria(0/20/1186838)(界)Q phylum"Actinobacteria"(0/20/176308)(門)□□□□□□classActinobacteria(0/20/176308)(綱)subclassActinobacteridae(0/20/167455)(亞綱)orderActinomycetales(0/20/166237) (目)suborderStreptomycineae(0/20/10027)(亞目)familyStreptomycetaceae(0/20/10027)(科)genusStreptomyces(0/20/9681)(屬)S0006916244notcalculated0.9951242Streptomyces