重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)課件

重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)血涂片檢查瘧原蟲是診斷和鑒定瘧原蟲種別的主要方法，也是瘧疾流行病學(xué)調(diào)查的重要部分，血涂片制作和染色的好壞足心影響檢查的結(jié)果，必須把握好“三關(guān)”。2重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)玻片清潔。清潔的玻片無(wú)油脂，無(wú)劃痕，無(wú)灰塵，玻片上有油跡，使厚血膜容易脫落，薄血膜涂布不均勻。在用手指持玻片時(shí)，只能夾持玻片的兩側(cè)邊緣，不要接觸玻片的表面，以避免手指上的油污染玻片。一、玻片清潔3重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)新的載玻片先用熱肥皂水洗滌，再用清水沖洗，然后用軟而潔凈的毛巾擦干待用。(一)新的載玻片的洗滌4重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)①5%的肥皂水煮沸法：

將洗衣肥皂削成小片，加水配成約5%的肥皂水，煮沸后將玻片一張一張地平放進(jìn)肥皂水內(nèi)，微火煮約一刻鐘，然后滅火待肥皂水稍冷后，將潔干毛巾擦凈后待用。(二)使用過(guò)的載玻片的清潔方法有兩種：5重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)②清潔液浸泡法：清潔液配制如下：重鉻酸鉀80g濃硫酸100ml水(清凈水)1000ml6重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)配制時(shí)須先將重鉻酸鉀研細(xì)放入水中，慢慢加溫到全部溶解為止，然后緩緩加入濃硫酸，待溶液冷卻后倒入有蓋的大口玻璃缸內(nèi)。清潔玻片時(shí)，將待洗的玻片逐張放入清潔中浸泡一兩天后，取出清水沖洗至完全沒(méi)有黃色為止。浸泡前最好用二甲笨除去鏡油，清潔液顏色變?yōu)槟G色后即失去清潔作用，不能再用。7重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)二、制片1.薄血膜涂制2.厚血膜涂制薄血膜厚血膜標(biāo)記處8重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)1.薄血膜涂制：1.薄血膜涂制(1)先用75%酒精棉球?qū)⒍瓜?，待酒精干后用采血針迅速刺入耳垂近下端邊緣處?2)用左手的拇指與食指以及右手的中指向相對(duì)的方向?qū)⒍馆p輕擠壓出血。(3)取一張潔凈的載玻片，將它的左1/3的表面接觸耳垂上的血滴（不要將玻片接觸耳垂上的皮膚），使一小滴血在玻片上。血量1-1.5mm3.1/4火柴頭大小。9重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)(4)將推片置于血溶之前與血液相接觸，待血液沿推片邊緣展開后，將推片與載玻片保持30角度，用力均勻迅速將推片由右向左推出而制成薄血膜。涂制得較好的薄血膜只有一層血球，血球的分布排列比較均勻，血膜的末端突出如舌狀。若取的血滴太大，則涂制的血膜太寬太厚；若推時(shí)用力不均勻，則易成梯田狀.若用力太大，則血膜兩端過(guò)厚，若涂片上有油污，則血膜成多孔狀。10重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)薄血膜涂好后，再輕擠耳垂擠出約火柴頭大一血滴，將這一滴血滴在玻片的中心1/3處然后用推片的一角由血滴中央向周圍旋轉(zhuǎn)涂成直徑約一厘米的圓形血膜，旋轉(zhuǎn)涂制時(shí)間不宜過(guò)短，以免形成纖維蛋白束，遮蓋了瘧原蟲。

厚血薄涂好后，應(yīng)平放待干，防蒼蠅舔食血膜或灰塵落在上面。受檢者的編號(hào)可用鉛筆或鋼筆寫在薄血膜的邊緣上，也可用蠟筆寫在厚血膜一端。2.厚血膜涂制11重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)血片制作和染色質(zhì)量規(guī)范

項(xiàng)目血膜好中差血片制作

厚血量位置直徑外觀4.0～5.0mm3玻片右1/38～1.0cm圓形厚膜均勻，邊緣整齊略多或略少稍偏右0.7～0.8或1.0～1.2cm圓形稍不均不整齊過(guò)多或過(guò)少偏右過(guò)多＜0.7或＞1.2cm厚薄不勻影響著色薄血量位置長(zhǎng)寬外觀1.5～2.0mm3玻片1/2～1/3處1.5×2.0cm舌狀厚薄均勻略多或略少稍偏右或偏左稍大或稍小舌狀稍不勻過(guò)多或過(guò)少偏右或偏左過(guò)多過(guò)大或過(guò)小厚薄不勻呈波浪型染色外觀鏡下蘭紫色白細(xì)胞瘧原蟲漿呈蘭色，核深紅深蘭色胞漿淡蘭或深蘭，核紅色紅色或灰白色胞漿不易見，核淡紅或蘭色清潔度外觀鏡下光潔無(wú)油灰無(wú)沉渣稍有油污稍有沉渣油灰粘連沉渣多或有雜菌12重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)血片制作和染色質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)1.血片制作質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。13重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)2.血片制作和染色合格率要求：分別以血片制作、染色和清潔度的好、中、差合并計(jì)算合格率。(1)血片制作合格率應(yīng)在85%以上。(2)染色合格率應(yīng)在85%以上。(3)清潔度合格率應(yīng)在80%以上。14重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)三、染色常用的染色方法有姬姆薩氏和瑞氏兩種(一)吉氏染色法：吉氏染劑是最可靠的血膜染劑，其優(yōu)點(diǎn)是易于掌握很少染色過(guò)度，染好后的血膜褪色較慢.

15重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)吉氏染劑粉0.5g甘油（中性）25ml甲醇（純，分析純）25ml將吉氏染劑粉0.5置于乳缽中，加少許甘油充分研磨，再加甘油研磨，直至25ml甘油加完為止。將充分研磨的吉氏甘油液倒入無(wú)水，干凈的棕色玻塞瓶中，然后分次加甲醇于乳缽洗出染劑倒入瓶中，直至25甲醇將乳缽洗凈并全部倒入瓶中，塞緊，充分搖勻，放置室內(nèi)一星期，每天搖動(dòng)數(shù)次，以后即可使用.1.吉氏染劑的配制：16重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)為了保證染色良好，使瘧原蟲的紅核和蘭胞漿分明，感染的紅血球上的薛氏小點(diǎn)清楚，在稀釋染劑原液時(shí)，所用的蒸餾水必須加緩沖液（緩沖蒸餾水）。新鮮蒸餾水可能接近中性，但貯存在一個(gè)時(shí)期后，由于吸收了空氣中的二氧化碳而變?yōu)樗嵝?，因此蒸餾水中必須加緩沖液，使其達(dá)到我們需要的酸堿度。

2.緩沖液的配制;17重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)

磷酸氫二鈉（無(wú)水）9.5g

蒸餾水1000ml

磷酸二氫鉀9.07g

蒸餾水1000ml

將上二液分別貯存于緊塞的玻瓶中。

緩沖液配制：18重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)稀釋染劑所用的蒸餾水的ph以7.0-7.2為最適宜，現(xiàn)用現(xiàn)配，可按下表配制：緩沖蒸餾水的配制（ml）

ph磷酸二氫鈉液磷酸二氫鉀液蒸餾水6.637639006.849519007.063379007.273279007.48119900在無(wú)條件的地方，此時(shí)也可用當(dāng)?shù)氐娘嬘盟蠓羞^(guò)濾后試染，試染結(jié)果如淋巴細(xì)胞的胞漿呈蘭色紅血球染色不很蘭就可使用。

19重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)3.染色步驟：①固定：用吉氏染液染色須先將薄血膜用甲醇或無(wú)水酒精固定。滴于薄血膜上，也可用玻棒沾取甲醇涂在薄血膜上，避免甲醇流至厚血膜，誤將其固定，可用蠟筆劃一條線，或者是斜放玻片，玻片上的甲醇蒸發(fā)干后即可染色。②溶解血紅蛋白，在厚血膜上加2-3滴蒸餾水，待血紅蛋白充分溶解后傾去玻片上的水，待血膜干后即可染色。20重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)③染色：快染：5：1(20%)，5滴水，1滴染液(原液)，染5分鐘清水沖洗即成。慢染：20：1(5%)，20滴水，1滴染液(原液)，染30分鐘用清水沖洗。待片水干后鏡檢。21重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)(二)瑞氏染色法：瑞氏染色法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便快速，缺點(diǎn)是染液在熱的環(huán)境中易變質(zhì)，且染色時(shí)間不易掌握，血膜上有染劑沉淀；用本法染色的血膜退色較快，不宜作長(zhǎng)久保存的標(biāo)本。22重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)瑞氏染劑粉0.2g

甘油(中性)3ml(無(wú)中性的也可)

甲醇(中性)97ml

將瑞氏染粉放入乳缽中，加入甘油充分研磨，然后加入甲醇10ml，混合后倒入干燥、清潔的棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，分次將甲醇倒入乳缽內(nèi)，至乳缽內(nèi)染劑洗凈為止，配制好的染液充分搖勻即可使用。1.瑞氏染劑的配制23重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)（1）先用蠟筆在厚薄血膜間劃一界限，然后用緩沖蒸留水滴2-3滴在已干的厚血膜上，溶血后傾去水滴。

（2）加瑞氏染液5-8滴于薄血膜上，染色1-2分鐘。

（3）加5-8滴緩沖蒸留水于薄血膜上，用吸管混合均勻后把染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同時(shí)染色約10分鐘。

（4）用清水輕輕沖去染液，將玻片直立待干后鏡檢2.染色步驟24重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)四、鏡檢(1)間日瘧原蟲薄血片形態(tài)①被寄生紅細(xì)胞的形態(tài)變化大小：顯著脹大色澤：褪色斑點(diǎn)：紅色的薛氏小點(diǎn)，細(xì)小數(shù)目多，重復(fù)感染：不多見25重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)②小滋養(yǎng)體胞漿：淡藍(lán)色，較大，稍粗厚，有一個(gè)空泡。核：紅色，通常一個(gè)，圓形。體積：較大，約占紅細(xì)胞直徑的三分之一。26重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)③大滋養(yǎng)體胞漿：阿米巴樣，含數(shù)個(gè)空泡，體積較大，淺藍(lán)色核：一個(gè)，呈點(diǎn)狀或桿狀，瘧色素：短桿狀，細(xì)小，棕黃色27重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)胞漿：阿米巴樣，體積很大，空泡甚小或消失，蘭色核：2-10個(gè)團(tuán)塊，不規(guī)則，瘧色素：細(xì)桿狀，棕黃色，分布不均勻④早期裂殖體28重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)⑤裂殖體裂殖子：12-24個(gè)，多為16-18個(gè)，排列不規(guī)則，瘧色素：棕黃色，常集中于一側(cè)。29重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)

形狀：圓形，較小胞漿：淡蘭色，核：疏松，較大，常位于中央瘧色素：棕色，桿狀，均勻散在，⑥小配子體30重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)⑦大配子體形狀：圓形，較大胞漿：深蘭色核：致密，位于一側(cè)瘧色素：棕黃色，均勻散在，數(shù)很多。31重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)(2)間日瘧厚血片形態(tài)①小滋養(yǎng)體胞漿：大多呈“感嘆號(hào)”，“問(wèn)號(hào)”，飛鳥等形狀。核：較大，多數(shù)是一個(gè)，32重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)間日瘧的大滋養(yǎng)體相當(dāng)大，形狀不一，變化很多，胞漿蘭色，分散斷裂成為大小數(shù)目不等、邊緣不清楚的圓塊，這是間日瘧原蟲大滋養(yǎng)的特征，核一個(gè)，大而明顯，呈不整齊的圓形，位于胞漿的中央或邊緣。瘧色素短桿狀，棕黃色，分布于胞漿上中。②大滋養(yǎng)體33重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)胞漿多，形態(tài)變化很大，有分布斷裂成塊現(xiàn)象，核分裂成數(shù)個(gè)，較大，呈圓形或不規(guī)則的圓形，零亂地分布在胞漿中，棕黃色短桿狀的瘧色素較多。

③裂殖體前期34重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)35重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)裂殖子12-24個(gè)不等，色素集中，位于中央或一側(cè)。④成熟裂殖體37重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)間日瘧原蟲的配子體很大，幾乎同中性白細(xì)胞同樣大小，胞漿完整致密呈圓形或橢圓形，雌雄配子體的形態(tài)與薄片上的形態(tài)完全相同，配子體有時(shí)易與晚期滋養(yǎng)體相混淆，但配子體的胞漿比較固實(shí)，色素顆粒多而分散并有沿邊緣分布現(xiàn)象。⑤配子體38重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)間日瘧雄配子體間日瘧?配體子體39重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)1惡性瘧原蟲薄血膜--環(huán)狀體環(huán)纖細(xì),約為RBC直徑的1/5核1個(gè)，但2個(gè)常見紅細(xì)胞常含2個(gè)以上原蟲蟲體常位于紅細(xì)胞的邊緣，呈“鳥飛狀”40重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)2惡性瘧原蟲—大滋養(yǎng)體

一般不出現(xiàn)在外周血體小結(jié)實(shí)，圓形，不活動(dòng)瘧色素集中一團(tuán)，黑褐色原蟲此時(shí)開始集中在內(nèi)臟毛細(xì)血管41重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)3惡性瘧早期裂殖體42重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)4惡性瘧原蟲成熟裂殖體

裂殖子8～36個(gè)，通常18～24個(gè)，排列不規(guī)則瘧色素集中成一團(tuán)蟲體占紅細(xì)胞體積的2／3至3／443重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)5惡性瘧原蟲雌配子體新月形，兩端較尖核致密，深紅色，常位于中央瘧色素黑褐色，分布于核周圍44重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)5惡性瘧原蟲雄配子體臘腸形，兩端鈍圓胞質(zhì)色藍(lán)而略帶紅核疏松，淡紅色，位于中央瘧色素黃棕色，小桿狀，在核周圍較多

45重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)惡性瘧厚血片形態(tài)環(huán)狀體核1-2個(gè)，常呈“!”、飛鳥等形狀。大滋養(yǎng)體常呈圓形、瘧色素集成1-2個(gè)團(tuán)。裂殖體較小，裂殖子8-26個(gè)。?配子體新月形，雄配子體臘腸形。46重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)47重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)五、是非區(qū)別1.生物的物質(zhì)血液內(nèi)的有性成分，白血球殘塊、血小板碎塊、紅血球內(nèi)何杰-喬氏點(diǎn)、卡玻氏環(huán)，水生阿米巴、細(xì)菌、滴蟲等。特點(diǎn)：①無(wú)瘧色素②湊合常不完善③大小與瘧色素不符。48重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)染料雜質(zhì)、灰塵。

特點(diǎn)：

①無(wú)生物體死亡的自如感覺(jué)

②常折光

③有湊合的痕跡。2.無(wú)生命的物質(zhì)49重慶市疾病控制中心瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)3.厚薄血膜之差薄血膜：用血少，